显微技术

基本原理

• 分辨率D：D=0.61λ/N*sin(α/2)

符号	含义	单位
D	最小可分辨的两点间距离（分辨率）	nm 或 μm
λ	照明光波长(最短的可见光波长λ=400nm)	nm 或 μm
N	物镜与标本间介质的折射率	无量纲（空气=1，水≈1.33，油≈1.51~1.52）
α	物镜孔径角（最大可达140°）	度或弧度
NA=N*sin	数值孔径	无量纲

光镜最大分辨率为0.2μm（阿贝极限）

艾里斑和瑞利判据

衍射会让点光源的成像扩散成中心亮斑+一圈一圈的衍射环，这个中心亮斑就是Airy disk，当一个点光源的艾里斑中心恰好落在另一个点光源艾里斑的第一暗环位置时，这两个点光源刚好可以分辨。

第一暗环的r=0.61λ/NA

• 衬度（对比度）

样品不同区域对光或电子的强弱差别。很多生物样品透明，需通过染色或特殊光学技术来产生衬度。

光学显微镜

• 相差显微镜

光波的基本属性：波长，频率（表现为颜色），振幅（表现为明暗），相位（你看不到，乌贼可以）

相差显微镜是将相位差转化为振幅差，并利用其中的相环扩大相差

适合观察活细胞而不需染色

• 微分干涉显微镜（DIC）

DIC利用干涉，其对象为相邻位置的两束光

折射率×厚度→相位变化速率→明暗关系，有浮雕感，在计算机的辅助下可见单根微管（24nm直径）

同样适合透明活体样品。

• 荧光显微镜

利用荧光分子（荧光蛋白、染料）标记特定结构，用特定波长光激发，发出更长波长的荧光。落射荧光显微镜是现在的主流配置。

• 共聚焦显微镜：用一个针孔排除焦平面以外的荧光，实现“光学切片”，让计算机后成像通过不同焦平面的图像叠加重构可对厚样品进行三维重建。
• 双光子/多光子显微镜：使用近红外飞秒脉冲激光，只在焦点极高光子密度处激发荧光，光毒性小，成像更深，常用于活体脑成像。
• 光片显微镜（SPIM）：用一层薄光片从侧面照明，快速获得大视野三维图像，光损伤极低，适合长时间活体胚胎发育观察。