电泳染色方法

蛋白质电泳染色

银染法

原理

碱性环境下,甲醛等还原剂将蛋白质上结合的银离子还原为单质银颗粒，从而显现出棕黑色。不过确切原理还不是很清楚。

试剂

• 乙醇、冰醋酸：固定剂,稳定凝胶中的蛋白质并去除杂质。
• 乙酸钠、硫代硫酸钠：致敏剂，使得银离子更容易结合在凝胶上。
• 硝酸银溶液：提供银离子。
• 甲醛溶液、碳酸钠：显色剂，碳酸钠提供碱性环境，甲醛还原银离子。
• EDTA、甘氨酸溶液：终止液：终止显色反应。

实验步骤

• 固定‌：使用含有乙醇和冰醋酸的固定液处理凝胶。
• 致敏‌：加入乙酸钠和硫代硫酸钠。
• 洗涤‌：使用纯水洗涤凝胶，去除多余的试剂。
• 染色‌：将凝胶浸泡在含有硝酸银和甲醛的显色剂中进行反应。
• 显色‌：显色剂使银离子还原成金属银，形成可见的染色效果，应当为棕黑色条带。
• 终止‌：使用终止液停止显色反应，并固定染色结果。

特点

• 灵敏度极高，可以检出低丰度（<1ng）蛋白质。
• 染色结果和蛋白质氨基酸组成有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
• 染色强度与蛋白质浓度并非完全线性关系，蛋白质定量受到一定限制。
• 对实验操作要求较高，试剂刺激性强。
• 可能干扰后续质谱

考马斯亮蓝染色法

原理

考马斯亮蓝R-250分子中的芳香环可以通过范德华力与疏水氨基酸残基结合，而磺酸基则通过静电作用与带正电的氨基酸残基结合。游离状态下呈红色而与蛋白质结合后呈蓝色。

考马斯亮蓝R-250和考马斯亮蓝G-250的分子结构

试剂

• 50%甲醇+10%冰醋酸：固定剂，固定蛋白质，去除SDS和盐。
• 0.1%考马斯亮蓝R-250+50%甲醇+10%冰醋酸：染色剂，显色。
• 40%甲醇+10%冰醋酸：脱色剂，去除未结合染料，降低背景噪声。
• 1%乙酸：保存剂，防止凝胶干燥和条带褪色。

实验步骤

• 固定：将凝胶浸泡于固定液中，室温摇动30分钟至过夜。
• 染色：倒弃固定液，加入染色液（液面需完全覆盖凝胶），室温摇床震荡染色12小时（或微波加热至95℃加速至20分钟，避免沸腾）。
• 脱色：弃染色液，加入脱色液震荡脱色；每30分钟更换脱色液，直至背景透明（通常需3~4次）；若需低背景，可用纯水脱色过夜。
• 保存：将凝胶浸泡于1%乙酸中，4℃可保存1周。

特点

• 相对灵敏，0.2μg-0.5μg/条带。
• 成本低。
• 永久性染色，不能继续进行印记分析。

荧光染色

原理

荧光染料（如SYPRO Ruby、Deep Purple）通过疏水作用结合蛋白质，紫外激发下发光。

试剂（以SYPRO Ruby为例）

• SYPRO Ruby：染色剂，最大激发光波长300/420nm，最大发射光波长618nm。
• 40%甲醇+10%乙酸：固定剂，作用同上。
• 2%乙酸水溶液（或蒸馏水）：脱色剂，用于去除未结合的染料。
• 2%甘油溶液：保存剂，用于长期保存凝胶（可维持6个月荧光信号稳定）。

实验步骤

• 固定：将电泳后的凝胶转移至塑料容器中，加入足量固定液（覆盖凝胶体积5-10倍），室温摇动30分钟。
• 染色：倒掉固定液，加入SYPRO Ruby染色液（覆盖凝胶），避光条件下室温摇动染色90分钟至过夜。
• 脱色：倒掉染色液，加入2%乙酸或蒸馏水（覆盖凝胶），室温摇动洗涤30-60分钟。
• 成像：使用荧光扫描仪或蓝光/紫外透射仪照射凝胶。
• 保存：
  • 短期：将凝胶浸泡于2%甘油中避光保存（室温或4℃）。
  • 长期：用湿玻璃纸包裹凝胶，空气干燥后永久保存。

特点

• 灵敏度1-2ng。
• 染色和保存全程需避光，防止荧光猝灭。
• 染色不影响后续质谱分析，无需额外脱色步骤。

负染法

原理

通过金属离子（如铜、锌）选择性沉淀在凝胶背景上，使未被染色的蛋白质条带呈现透明区域。

试剂（以咪唑锌法为例）

• 40%甲醇+10%乙酸：固定剂，作用同上。
• 0.2 mol/L咪唑+0.1% SDS、0.2 mol/L硫酸锌：染色剂，形成咪唑锌沉淀。
• 去离子水或0.1%乙酸：洗涤剂，去除多余金属离子。

实验步骤

• 固定：将凝胶浸入固定液中室温摇动30分钟。
• 洗涤：倒掉固定液，加入去离子水覆盖凝胶，摇动洗涤2次，每次15分钟以洗去残留的固定液。
• 预处理：加入咪唑-SDS溶液（体积为凝胶2倍），摇床孵育15分钟。
• 染色：快速倒掉咪唑-SDS液，立即加入0.2 M硫酸锌溶液，剧烈摇动30-60秒。
• 终止：倒掉硫酸锌溶液，用去离子水冲洗凝胶2次（每次1分钟）。
• 成像：使用白光透射仪观察，或拍照时在凝胶下方放置黑色背景板增强对比度。
• 保存：浸入水中避光保存。

特点

• 速度快，全程仅需45-60分钟。
• 可用于Western Blot前验证转膜效率。
• 蛋白质可回收，不影响后续质谱分析。
• 单独使用检测限1-10 ng，低于荧光染色和银染法，但是高于考马斯亮蓝染色。
• 对实验操作要求高，pH和离子浓度要求苛刻，重复性差。

丽春红染色

原理

丽春红是酸性染料，可以与带正电的氨基酸残基结合，也可以通过疏水相互作用与蛋白质的非极性区域结合。

试剂

• 5%三氯乙酸：固定剂，作用同上。
• 丽春红S：染色剂。
• 5%醋酸或去离子水：脱色剂。
• PBS或TPBS：完全脱色剂，脱去条带上的染料以用于后续印记分析。

实验步骤

• 固定：转膜后，将PVDF/硝酸纤维素膜浸入含5% TCA的溶液中5分钟。
• 染色：将膜完全浸没于丽春红染色液中，室温摇床孵育 3-10分钟（视膜厚度调整）。
• 脱色：用去离子水或 5%醋酸溶液 漂洗膜3次（每次1分钟），直至背景透明、条带清晰。
• 成像：在白光透射扫描仪（波长520-540 nm）下观察，拍照保存结果。

特点

• 全程仅需10-15分钟，远快于考马斯亮蓝（3小时）和银染（4-6小时）。
• 染色后染料可完全洗脱，不干扰抗体结合（对比考马斯亮蓝的永久性染色）。
• 适用于PVDF膜、硝酸纤维素膜，支持高盐/去污剂样本（如细胞裂解液），但是不支持尼龙膜，因为尼龙膜带正电会导致背景噪声过大。
• 灵敏度较低，检测下限约 250 ng/条带，低于银染和荧光染色。