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第二十章癌

2025-09-05T15:25:54Z

Magezeya：

大约五分之一的人会死于癌症，但这并不是我们专门用一章来探讨这种疾病的原因。癌细胞破坏了构成多细胞生物体的最基本细胞行为规则，并且它们会利用各种机会来达到这一目的。这些违反规则的行为虽然往往是悲剧性的，但却有助于揭示正常的规则，以及它们是如何运作的。因此，癌症研究有助于阐明细胞生物学的基本原理——尤其是细胞信号传导（第15章）、细胞周期和细胞生长（第17章）、细胞凋亡（第18章）以及组织结构的控制（第19章和第22章）。当然，随着对这些正常过程的深入了解，我们也将对癌症有更深入的理解，并找到更好的治疗方法。

在本章中，我们首先探讨癌症是什么，并从细胞的角度描述癌症的自然史。然后，我们将讨论导致细胞癌变的分子变化。本章的最后，我们将探讨如何通过加深对癌症分子基础的理解来改进癌症的预防和治疗方法。

== 癌症是一种微进化过程 ==
动物的身体就像一个社会或生态系统，其个体成员是细胞，它们通过细胞分裂进行繁殖，并自行组织成称为组织的协作体。然而，这个生态系统非常特殊，因为自我牺牲——而非适者生存——才是规则。最终，动物体内所有体细胞谱系都致力于支持生殖细胞，而只有生殖细胞才有机会继续生存（详见第21章）。由于体细胞的基因组与产生精子或卵子的生殖细胞谱系的基因组相同，因此体细胞通过自我牺牲来帮助繁殖自身基因的副本。

与细菌或酵母等独立生存的细胞竞争生存不同，多细胞生物的细胞必须致力于合作。为了协调自身行为，细胞会发送、接收并解读一组复杂的细胞外信号，这些信号充当社会控制，指导细胞如何行动（第15章将对此进行讨论）。因此，每个细胞通常都会根据生物体自身的需要，以符合社会责任的方式行事——静息、生长、分裂、分化或死亡。

破坏这种和谐的分子扰动意味着多细胞社会将面临危机。在一个拥有超过10<sup>17</sup>个细胞的人体中，数十亿个细胞每天都会发生突变，这可能会扰乱社会控制。最危险的是，突变可能会赋予一个细胞选择优势，使其生长和分裂略有活力，并且比邻近细胞更容易存活。通过这种方式，一个突变细胞可以成为一个不断生长的突变克隆体的起源。随着时间的推移，在体细胞群体中反复发生的突变、竞争和自然选择会导致情况每况愈下，危及多细胞生物的未来。这些是癌症的基本要素：它是一种疾病，单个突变细胞克隆开始以牺牲邻近细胞为代价而繁荣发展。最终——随着该克隆进化、转移——他将摧毁整个细胞社会（电影20.1）。

本节中，我们将癌症的发展视为一种微观进化过程，该过程在人体内某一细胞亚群中发生于人的生命周期内。正如我们将要看到的，这一过程依赖于数十亿年来驱动地球生物进化的相同原则：突变与自然选择。

=== 癌细胞绕过正常增殖控制并侵占其他组织 ===
癌细胞具有'''两大遗传特性'''：（1）它们'''无视正常的细胞生长与分裂限制进行繁殖'''；（2）它们会'''侵入并占据通常属于其他细胞的领域'''。正是这两种特性的结合使得癌症尤为危险。一个异常细胞若经历连续且异常的增殖循环，失控地增生，便会形成'''肿瘤（tumor）'''或'''赘生物/新生物（neoplasm）'''——字面意为"新的生长物"。然而，只要这些肿瘤细胞尚未具备侵袭能力，该肿瘤便被称为良性肿瘤（'''benign'''）。对于大多数此类肿瘤，通过局部切除或摧毁肿块通常可实现彻底治愈。
[[文件:MBOC-20.1.png|缩略图|329x329像素]]
只有当肿瘤是恶性的（'''malignant'''），即其细胞获得了侵袭周围组织的能力时，才被视为真正的癌症。侵袭性是癌细胞的一个基本特征。这使得它们能够脱离原发部位，进入血液或淋巴管，并在身体其他部位形成被称为转移灶('''metastases''')的继发性肿瘤（图20-1）。通常，癌症扩散得越广泛，就越难以根除。正是这些转移灶通过导致重要器官功能衰竭，通常成为癌症患者死亡的原因。

图 20-1 转移。恶性肿瘤通常会导致转移，使癌症难以根除。这张融合图像显示的是一位转移性非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 患者的全身扫描图。背景图像由 CT（计算机 X 射线断层扫描）扫描获得。叠加在此图像上的 PET（正电子发射断层扫描）扫描显示了肿瘤组织（黄色），该组织通过其对放射性标记的氟脱氧葡萄糖 (FDG) 的异常高摄取率被发现。高 FDG 摄取率发生在葡萄糖摄取和代谢异常活跃的细胞中，这是癌细胞的特征（见图 20-18）。腹部的黄色斑点揭示了多处转移灶。
[[文件:MBOC-20.2.png|居中|缩略图|486x486像素| 图20-2 美国癌症发病率与死亡率。2018年美国新确诊癌症病例估计总数为1,762,450例，癌症死亡总数为606,880例。需注意，死亡数据反映了不同阶段确诊的病例，且实际罹患癌症者中死于该疾病的比例远低于半数。最常见癌症类型包括消化器官癌（含结肠癌、胰腺癌和肝癌）、呼吸系统癌（主要为肺癌与支气管癌）、生殖道癌（前列腺癌与子宫癌）及乳腺癌。非黑色素瘤皮肤癌未计入这些数据，因其绝大多数易治愈且多数未登记记录。每个大类根据特定细胞类型、体内位置及肿瘤显微形态特征可细分为多种亚型。英国数据与此相似。然而世界其他地区发病率存在差异，这反映了不同传染性病原体与环境毒素的广泛暴露差异。（数据来源：美国癌症协会《2019年癌症事实与数据》）]]
传统上，癌症是根据其起源的组织和细胞类型进行分类的。'''癌（Carcinoma）'''是指'''起源于上皮细胞'''的癌症，它们是迄今为止人类'''最常见'''的癌症，约占所有癌症的 85% 。成年人中，通过增殖和死亡实现的正常细胞更新主要发生在上皮组织，而经历最多细胞分裂周期的细胞类型积累致癌所需多重突变的概率最大。此外，上皮组织最易暴露于各种有利于癌症发展的物理和化学损伤中。图 20-2 显示了美国诊断出的癌症类型及其发病率和死亡率。继癌之后，最常见的癌症类型包括各种'''骨髓瘤（myelomas）'''、'''白血病（leukemias）'''和'''淋巴瘤（lymphomas）'''，这些源自白细胞及其前体（造血细胞）。起源于结缔组织或肌肉细胞的'''肉瘤（Sarcomas）'''以及源自神经系统细胞的癌症则较为罕见。
[[文件:MBOC-20.3.png|居中|缩略图|437x437像素| 图20-3 良性肿瘤与恶性肿瘤对比。良性腺瘤（粉色细胞；腺瘤）仍位于标志正常结构（本例为导管）边界的基底层（黄色）内。相反，恶性腺瘤（红色细胞；腺癌）可由良性肿瘤细胞发展而来，并如图所示破坏组织完整性。此类肿瘤可能呈现多种不同形态。]]
与恶性肿瘤的命名体系相对应，存在一组相关的良性肿瘤命名：例如，腺瘤是一种具有腺体结构的良性上皮肿瘤；其对应的恶性肿瘤类型为腺癌（图20-3）。

大多数癌症具有反映其起源的特征。例如，源自皮肤角质形成细胞干细胞的基底细胞癌，其细胞通常持续合成细胞角蛋白中间丝；而源自皮肤色素细胞的黑色素瘤细胞，则往往（并非总是）继续制造色素颗粒。一般而言，起源于不同细胞类型的癌症是截然不同的疾病。以皮肤基底细胞癌为例，它们仅具有局部侵袭性且很少转移，而黑色素瘤可能恶性程度更高并常形成转移灶。基底细胞癌通过手术或局部放疗即可治愈，而恶性黑色素瘤一旦广泛转移，往往致命。

稍后我们将看到，还有一种更新、更不同的癌症分类方法，它跨越了传统的原发部位分类法：现在我们可以根据使特定肿瘤细胞癌变的突变来对多种癌症进行分类。本章最后一节将展示这些信息如何对治疗方案的设计与选择起到关键作用。

=== 大多数癌症源于单个异常细胞 ===
即使癌症已经发生转移，我们通常仍可追溯其根源至某个特定器官中的单个原发肿瘤。原发肿瘤被认为是由最初经历某种可遗传变化的单个细胞通过分裂而产生的。随后，该细胞的部分后代中积累了更多变化，使它们能够比邻近细胞生长更快、分裂更多且通常存活更久。
[[文件:MBOC-20.4.png|缩略图|259x259像素| 图20-4 典型人类肿瘤（如乳腺肿瘤）的生长过程。肿瘤直径以对数刻度表示。肿瘤可能需要数年时间才能被察觉。例如，典型乳腺肿瘤的倍增时间约为100天。但特别具有侵袭性的肿瘤可能生长得更快。]]
当首次被发现时，一个典型的人类癌症通常已经发展了多年，并已包含十亿个或更多的癌细胞（图20-4）。肿瘤通常还包含多种其他细胞类型和相关的细胞外基质，称为肿瘤间质。例如，在癌相关的支持性结缔组织中，除了免疫细胞和血管内皮细胞外，还会存在成纤维细胞。我们如何确定癌细胞是单个异常细胞的克隆后代？

证明克隆起源的一种方法是对肿瘤细胞染色体进行分子分析。例如，在几乎所有慢性髓系白血病（CML）患者中，我们可以通过特定的染色体异常区分白血病白细胞与个体的正常细胞：即所谓的费城染色体，这是由 9 号和 22 号染色体长臂之间的易位形成的（图 20-5）。当对易位位点的 DNA 进行克隆和测序时，发现所有白血病细胞中易位片段的断裂和重接位点在特定个体内完全一致，但在不同个体间存在细微差异（相差几百至几千个碱基对）。这个结果当且仅当每个个体的癌症都源于单个细胞发生的独特事故时，才符合预期。（后续我们将看到这种特殊易位如何通过创建编码促进细胞增殖蛋白的新型杂交基因来推动 CML 的发展。）

来自多种不同类型癌症的大量其他证据都指向同一结论：'''大多数癌症起源于单个异常细胞。'''

=== 癌细胞含有体细胞突变 ===
如果一个异常细胞要发展成肿瘤，它必须将其异常性传递给后代：这种畸变必须是可遗传的。因此，癌细胞克隆的发展依赖于基因变化。肿瘤细胞含有体细胞突变：它们的 DNA 序列中存在一个或多个可检测的共享异常，使其区别于肿瘤周围的正常细胞，正如刚才描述的慢性髓性白血病（CML）例子所示。（这些突变被称为体细胞突变，因为它们发生在体细胞中，而非生殖细胞系。）癌症也受到表观遗传变化的驱动——这些持久、可遗传的基因表达变化源于染色质结构的修饰，而非细胞 DNA 序列的改变。但改变 DNA 序列的体细胞突变似乎是一个基本且普遍的特征，从这个意义上说，癌症是一种遗传性疾病。

导致基因变化的因素往往会诱发癌症的发展。因此，癌变（癌症的产生）可与诱变（DNA 序列变化的产生）相关联。这种关联在两类外部因素中尤为明显：（1）化学致癌物（通常引起核苷酸序列的简单变化），以及（2）辐射，如 X 射线（通常导致染色体断裂和易位）或紫外线（UV）光（引起特定 DNA 碱基改变）。

正如预期的那样，遗传了某种 DNA 修复机制缺陷的人，其细胞会以较高速度积累突变，因此患癌症的风险增加。例如，患有色素性干皮病的人，其修复紫外线引起的 DNA 损伤的系统存在缺陷，他们患皮肤癌的发病率大大增加。总体而言，遗传突变被认为在所有癌症中占 5-10%的比例，而体细胞突变和表观遗传变化则更为普遍。

=== 单一突变不足以将正常细胞转变为癌细胞 ===
据估计，一个普通体型的人类体内约有 3.7 × 10<sup>13</sup> 个细胞（不包括细菌），在典型生命周期中会发生 10<sup>16</sup> 次细胞分裂。这种细胞增殖主要发生在上皮组织和造血系统，并通过细胞死亡保持平衡以维持正常的组织稳态。即使在无诱变剂的环境中，突变仍会以每个细胞分裂约三次的自发频率发生，相当于每个基因每次细胞分裂约 10<sup>-6</sup> 次突变。这一不可避免的误差率由 DNA 复制与修复精度的根本限制所决定（参见第 253-254 页）。这意味着，在典型生命周期中，人体每个基因都会在体内经历约 10<sup>10</sup> 次独立突变。由此产生的突变细胞中，将有大量细胞在调控生长分裂的基因中积累有害突变，导致细胞违背正常更替规则。考虑到人类这样大型生物体内不可避免的巨量突变，癌症问题看似不应纠结于为何发生，而应探究其为何如此罕见。

图 20-5 导致慢性粒细胞白血病的 9 号与 22 号染色体易位。顶部显示的是 9 号和 22 号染色体的正常结构。当它们在指定位置发生相互易位时，结果形成底部所示的异常染色体对。其中较小的异常染色体 (22q^{-}) 被称为费城染色体，得名于首次记录该异常的城市。

如果单个基因的突变足以将典型的健康细胞转化为癌细胞，我们就不可能成为可存活的生物体。多项证据表明，癌症的发生通常需要在一个单细胞衍生的谱系中，积累大量独立且罕见的遗传和表观遗传意外事件。其中一个证据来自对癌症发病率随年龄变化的流行病学研究（图20-6）。如果癌症由单一突变引起，且每年发生概率固定，那么在任何年龄段患上癌症的几率应与年龄无关。事实上，大多数癌症类型的发病率随年龄增长而急剧上升——这符合癌症是由细胞谱系中一系列突变的渐进性随机积累所引起的预期。然而值得注意的是，'''癌症发病率在极高龄人群中显著下降'''。对此现象的一种解释是，细胞增殖减少（八旬老人干细胞功能衰退的典型特征）降低了突变发生的机会。

正如后文所述，这些将累积突变数量与癌症发展相关联的间接论证，现已通过对个体癌症患者肿瘤细胞基因组进行系统性测序并汇编其包含的突变而得到证实。

=== 许多癌症通过随机遗传变异的连续循环及自然选择逐步发展而成 ===
对于那些已知具有特定外部诱因的癌症，疾病通常在接触致病因素很久之后才会显现。例如，肺癌的发病率往往在重度吸烟数十年后才开始急剧上升（图20-7）。同样，广岛和长崎遭受强辐射暴露的人群中，白血病发病率直到原子弹爆炸约五年后才出现显著增长。而有限期接触工业致癌物的工人，通常要在暴露10年、20年甚至更久之后，才会出现职业特征性癌症。在这漫长的潜伏期内，潜在癌细胞经历了一系列变化，这种情况同样适用于那些初始基因损伤没有明显外部诱因的癌症。

癌症的发展需要细胞内多个不同基因逐渐积累突变，这一事实有助于解释众所周知的肿瘤进展现象，即最初轻微的细胞行为异常逐渐演变为全面发展的癌症（图20-8）。

在进展的每个阶段，某些单个细胞会获得额外的突变或表观遗传变化，使其比邻近细胞更具选择优势，从而更能在恶劣环境中茁壮成长——这种肿瘤内部环境可能缺氧、营养匮乏，并受到周围正常组织形成的天然生长屏障限制。肿瘤细胞数量越多，至少有一个细胞发生有利于其生存的变异几率就越高。因此，随着肿瘤生长，进展速度加快。适应能力最强的细胞后代持续分裂，最终在发展中的病灶内形成优势克隆群（图20-9）。因此，肿瘤进展包含大量随机因素且通常历时多年，这或许是大多数人最终死于非癌症原因的重要解释。

图 20-6 癌症患病率与年龄的关系。图中绘制了 2000 年监测、流行病学和最终结果（SEER）9 个癌症登记处女性恶性癌症患病率随年龄变化的情况。癌症患病率随年龄增长急剧上升。若仅需单次突变即可引发癌症，且突变在任何时间点发生概率均等，则各年龄段癌症患病率应保持一致。（数据来源：G. Harding 等人，《癌症》118 卷 1371-1386 页，2012 年，doi 10.1002/cncr:26376）

图20-7 吸烟与肺癌。20世纪初开始的吸烟量大幅增长（蓝线）导致约20年滞后周期后肺癌死亡人数急剧上升（红线）。由于吸烟量在1980年达到峰值，经过类似滞后周期后，目前肺癌死亡人数呈下降趋势。（数据来源：美国疾病控制与预防中心国家卫生统计中心，2017年）

正如动植物进化过程中常出现物种分化一样，癌细胞谱系也会发生某种'''分化'''：原始癌细胞可多样化产生许多遗传特性各异的亚克隆细胞群。这些亚克隆可能共存于同一肿瘤组织块中；也可能迁移并殖民于适合各自特性的不同微环境，在那里定居、增殖并作为独立演化的转移灶发展。随着每个肿瘤内部不断产生新突变，不同亚克隆可能获得生长优势并占据主导地位，但很快又会被其他亚克隆超越或被自身的次级亚克隆淘汰。大多数肿瘤中存在的高度遗传多样性是导致癌症难以根治的主要因素之一，这也凸显了尽早检测肿瘤的重要性。

=== 遗传不稳定性可导致癌症急剧演化 ===
如果癌细胞仅通过单个有害突变的逐渐积累而进化，那么从癌前病变转变为转移性癌症的时间尺度对于特定癌症类型应该是可预测的。然而事实并非如此。正如物种进化一样，癌症进化可能经历长时间无明显变化，随后突然产生新的表型。癌症进化的"大爆炸"理论认为，除了逐渐的诱变和对最适细胞的筛选外，周期性的灾难性基因组破坏可以促进癌细胞向恶性发展的快速演进。
[[文件:MBOC-20.11.png|居中|缩略图|592x592像素| 图 20-11 染色体分离异常可导致非整倍体和/或染色体碎裂。正确的染色体分离要求每条染色体的复制副本（称为姐妹染色单体）附着于相反的纺锤体极。图中描绘了这一过程中的错误：一对染色单体中的一条同时附着于两个纺锤体极，因此在分裂后期被反向拉扯，导致其在细胞中央滞后，形成滞后染色体。（A）滞后染色体可能最终与姐妹染色体进入同一子细胞，导致产生 n + 1 与 n - 1 核型的非整倍体（ n = 染色体数目）。（B）另一种可能是滞后染色体在子细胞中与其他染色体保持分离，在接下来的间期形成独立的"微核"。微核中的 DNA 复制通常不完整，DNA 损伤持续累积，但这不会延缓细胞周期。在后续有丝分裂中，孤立染色体在染色体凝缩过程中易发生断裂，这一过程称为染色体碎裂。（C）微核可在数代细胞分裂过程中持续存在，经历染色体片段化与重组的循环，或可重新整合至子细胞核中（参见影片 20.2）。荧光显微图像显示同一细胞内存在主核与微核。由于正常核亚结构的存在，核 DNA 染色（蓝色）呈现不均匀分布。（C，引自 M.L. Leibowitz 等，《遗传学年评》49:183-211, 2015。经 Annual Reviews 许可使用。）]]
与正常分裂细胞不同，'''大多数人类癌细胞以异常快速的速度积累遗传变化'''，被称为具有'''遗传不稳定性'''。这种不稳定性通过加速肿瘤进展过程提供了选择优势——使得后续能够积累许多额外的突变，而这对癌症的发生是必需的。然而，这种不稳定的程度及其分子根源在不同癌症类型和不同个体之间，无论是在严重性还是性质上，都存在差异。在某些情况下，癌细胞的核型——即有丝分裂时染色体组的形态——是正常或接近正常的，但在个别基因中检测到许多点突变，这表明通常纠正 DNA 序列复制或维护错误的修复机制出现了故障。然而，'''常见的情况是，癌细胞的核型严重紊乱，伴随着许多染色体断裂和重排，导致基因组部分区域的缺失、重复和扩增'''（图 20-10）。这种高度破坏的基因组表明发生了灾难性事件，很可能是由于有丝分裂过程中染色体复制或分离的缺陷所致。例如，许多癌细胞的一个共同特征是未能正确将所有染色体附着到有丝分裂纺锤体上，这可能导致染色体断裂或非整倍性，即个别染色体的增加或丢失。更为显著的是，'''有丝分裂缺陷还可能导致单个染色体被隔离在子细胞的"微核"中'''，这种情况极易引发大规模 DNA 损伤和染色体重排，这一现象被称为"'''染色体碎裂chromothripsis'''"（图 20-11）。

图20-9 肿瘤进展过程中的克隆演化。本示意图展示肿瘤通过多轮突变与增殖发展形成完全恶性癌细胞克隆的过程。每个阶段中，单个细胞发生增强增殖能力或降低死亡率的突变，使其后代成为肿瘤中的优势克隆。各克隆群的增殖通过扩大可能发生额外突变的细胞群体，加速肿瘤进展的下一阶段发生。此处描绘的最终步骤是突破基底膜的侵袭——转移的初始阶段。实际上，根据肿瘤类型不同，可能涉及超过三个发展阶段，且往往伴随遗传学与表观遗传学改变的共同作用。未在图中展示的是，随时间推移，肿瘤内常会涌现多种竞争性亚克隆。正如后续将讨论的，这种异质性使癌症治疗变得复杂。

图 20-8 展示了子宫颈上皮癌发展进程的各个阶段。病理学家采用标准化术语对在此类组织切片中观察到的病变类型进行分类。（A）在复层鳞状上皮中，分裂细胞仅限于基底层。（B）在这张低度上皮内瘤变的图像（右半部分）中，分裂细胞可见于上皮下三分之一区域；表层细胞仍呈扁平状并显示分化迹象。（C）在高度上皮内瘤变中，所有上皮层的细胞均呈现增殖状态并表现出异常分化。（D）当细胞突破或破坏上皮下方的基底层，侵入下方结缔组织时，真正的恶性肿瘤开始形成。（由 Andrew J. Connolly 提供。）

图 20-10 显示不同类型遗传不稳定性的结肠癌染色体组（核型）。(A) 典型癌症的核型显示染色体数量和结构存在大量显著异常。细胞间也可能存在相当大的变异（未显示）。(B) 具有稳定染色体组且染色体异常较少的肿瘤核型；这些肿瘤中的遗传异常大多不可见，由 DNA 修复缺陷造成。本图中所有染色体均按图 4-11 方法染色，每条人类染色体的 DNA 均采用不同组合的荧光染料标记。（由 Wael AbdelRahman 和 Paul Edwards 提供。）

从进化角度看，这一切都不足为奇：任何能增加基因功能随机变化概率（这些变化可在细胞代际间遗传且不致过于有害）的因素，都可能加速细胞克隆向恶性方向的演化，从而使该特性在肿瘤进展过程中被筛选出来。基因组不稳定性很可能也导致了单个肿瘤内常见癌细胞异质性的形成。通过引发多重异常核型、染色体错误分离、非整倍体——以及更罕见的染色体碎裂——这些机制如同洗牌般重组遗传信息，使得癌细胞能够尝试多种不同表型，并让不同克隆在群体中共存。

=== 某些癌症可能潜藏少量干细胞群 ===
[[文件:MBOC-20.12.png|缩略图| 图 20-12 终生患癌风险与癌症起源细胞的分裂速率相关。该图表展示了特定组织中干细胞分裂次数与该组织终生患癌风险之间的关系。处于较低极端的是骨肉瘤（起源于骨骼的癌症），这类肿瘤源自分裂频率低且罕有癌变的间充质细胞。相比之下，皮肤和消化道的上皮细胞具有高度增殖性，因此更频繁地引发恶性肿瘤。圆点代表特定癌症类型，并通过颜色区分其分类：肉瘤（浅蓝色）；神经源性（深蓝色）；癌（紫色）；皮肤癌（红色）。需注意环境因素会显著放大多种癌症的风险，例如吸烟者与非吸烟者的肺癌风险差异。（数据来源：C. Tomasetti 与 B. Vogelstein，《科学》杂志 347 卷 78-81 页，2015 年，doi 号 10.1126/science.1260825。）]]
自我更新的组织，即细胞分裂在生命过程中持续进行的组织，是绝大多数人类癌症的滋生地。这些组织包括表皮（皮肤的外上皮层）、消化道和生殖道的上皮内衬，以及生成血细胞的骨髓（参见第22章）。每一次细胞分裂周期都伴随着突变的机会，而环境因素可能极大地放大这种突变。因此，特定组织中细胞分裂的频率与癌症发病率之间存在强烈的相关性（图20-12）。

在几乎所有增殖组织中，细胞更新依赖于干细胞的存在——这些干细胞通过分裂产生不再分裂的终末分化细胞。这就形成了基因完全相同、谱系密切关联但处于不同分化状态的细胞混合体。许多肿瘤同样呈现出由不同分化状态细胞群体构成的特征。将肿瘤发展过程与干细胞来源组织的正常稳态进行比较，或许能帮助我们更好地理解某些癌症的起源，以及为何部分肿瘤对治疗具有如此强的抵抗性。

要理解其含义，思考正常干细胞系统的运作方式会有所帮助。当正常干细胞分裂时，每个子细胞都面临选择——它可以继续保持为干细胞，也可以选择走向分化之路。保持干细胞特性的子细胞留在原位，为未来生成更多细胞。而选择分化的子细胞通常会经历几轮细胞增殖（作为所谓的过渡放大细胞），但随后停止分裂，最终分化并更替（可能通过凋亡死亡，其物质被回收利用，或从体内脱落）。因此，干细胞的数量往往远少于那些注定要终末分化的细胞。然而，尽管干细胞数量稀少、分布分散且通常分裂相对缓慢，它们却长期承担着维持组织完整性的全部责任。在健康机体中，反馈调控机制会通过调整细胞命运选择、细胞增殖与细胞死亡的平衡，对任何偏离正常细胞数量的情况进行修正。
[[文件:MBOC-20.13.png|缩略图| 图 20-13 癌症干细胞可能对肿瘤的生长负责，却仅占肿瘤细胞群体的一小部分。（A）干细胞产生过渡扩增细胞的谱系。（B）少量癌症干细胞如何维持肿瘤。尽管数量更为庞大的过渡扩增细胞最终会死亡，但癌症干细胞的数量会缓慢而稳定地增加，从而形成不断生长的肿瘤。]]
在癌症发展过程中，突变可能以多种方式颠覆正常的细胞分化程序；例如，导致过渡扩增细胞过度增殖，或抑制其终末分化或死亡。然而更为隐蔽的是那些导致癌症干细胞生成的突变。某些肿瘤似乎表现出这种病因：它们由具有自我更新能力的稀有癌症干细胞，以及数量远多于前者的分裂中过渡扩增细胞组成——这些过渡扩增细胞虽源自癌症干细胞，但自我更新能力有限（图20-13）。

'''癌症干细胞存在的证据'''来源于实验，其中将癌症中的单个细胞植入小鼠体内，测试其能否产生新肿瘤。半个多世纪以来已知，<u>随机选取的肿瘤细胞以此方式测试时，通常仅有很小的概率——通常远低于 1% ——能生成新肿瘤</u>。这本身并不证明肿瘤细胞具有异质性：如同撒在贫瘠土地上的种子，每个细胞可能仅有微小机会找到存活和生长的地点。然而，'''现代细胞分选技术显示，表达通常在干细胞表面发现的标记物的癌细胞亚群，其形成新肿瘤的能力显著增强'''。此外，'''新肿瘤由表达干细胞标记物和不表达标记物的细胞混合组成，所有这些细胞均源自同一表达标记物的创始细胞。'''癌症干细胞现象，无论其基础如何，意味着即使肿瘤细胞在遗传上相似，它们在表型上也可能多样化。一种能清除某种状态下肿瘤细胞的治疗方法，常会放过其他构成威胁的存活细胞。例如，放疗或细胞毒性药物可能会选择性杀死快速分裂的细胞，将肿瘤体积缩减至近乎为零，却放过少数缓慢分裂的细胞，这些细胞最终会导致疾病复发。这大大增加了癌症治疗的难度，也是为何最初看似成功的治疗往往以复发和失望告终的部分原因。

=== 癌症生长通常具有一组共同特征 ===
显然，要形成癌症，细胞在进化过程中必须获得一系列异常特性——即一套颠覆性的新技能。不同癌症需要这些特性的不同组合。然而，所有癌症都具备某些共同特征。这些决定性特性通常与其他特征（如遗传不稳定性）相结合，助长这些异常细胞的产生和繁衍。癌细胞普遍具有的关键属性包括以下几点：

# 导致细胞生长和分裂速度超过死亡速度的稳态失衡
# 绕过细胞增殖的正常限制
# 逃避细胞死亡信号
# 细胞代谢的改变
# 操纵组织环境以支持细胞存活并规避有害免疫反应
# 细胞逃离其原生组织并在异位增殖（转移）

下文我们将更详细地讨论这些关键特征。在本章下一节中，我们将探讨构成癌细胞这些特性及其他特性的突变与分子机制。

=== 癌细胞表现出生长与稳态控制的改变 ===
[[文件:MBOC-20.14.png|缩略图|图20-14 细胞分裂增加和凋亡减少均可促进肿瘤发生。在正常组织中，细胞凋亡与细胞分裂保持平衡以维持内稳态（参见视频18.1）。在癌症发展过程中，细胞分裂增加或凋亡受抑均可导致细胞数量增多，这对肿瘤发生至关重要。图中注定发生凋亡的细胞以灰色标示。细胞分裂增加和凋亡减少通常共同促进肿瘤生长。]]
变异性和庞大的细胞群体数量为突变的发生提供了机会，但癌症发展的驱动力必须来自于突变细胞所具备的某种选择优势。最明显的是，突变或表观遗传变化可以通过提高细胞克隆的增殖速率，或使其在正常细胞停止增殖或死亡时仍能继续增殖，从而赋予这种优势。许多类型癌细胞最重要的特性之一是，在正常细胞会凋亡的情况下，它们却未能经历凋亡（图20-14）。
[[文件:MBOC-12.15.png|缩略图|图 20-15 癌细胞在细胞培养中丧失接触抑制。大多数正常细胞在铺满培养皿单层后即停止增殖：其增殖似乎依赖于与培养皿的接触，并受细胞间接触的抑制——这种现象称为接触抑制。相反，癌细胞通常无视这些限制继续生长，导致细胞相互堆积（视频 20.3）。（A）示意图。（B 和 C）正常（B）与转化（C）成纤维细胞的显微照片。（B 和 C，由陈兰博惠赠。）]]
能够在培养中生长的癌细胞或人工改造以包含癌症中常见突变类型的培养细胞，通常表现出转化表型。它们在形态、运动性、对培养基中生长因子的反应，以及最典型的是对培养皿表面和彼此接触的反应方式上均表现出异常。大多数正常细胞除非附着于表面否则不会分裂，而转化细胞即使在悬浮状态下也常会分裂。更普遍地说，转化细胞不再需要正常细胞所需的所有来自周围环境的积极信号。此外，转化细胞无法识别某些负面影响。例如，当培养达到汇合（细胞相互接触）时，正常细胞的运动和分裂会受到抑制，而'''转化细胞即使在汇合后仍继续运动和分裂，因此在培养皿中层层堆积'''（图20-15）。
[[文件:MBOC-12.16.png|缩略图|图 20-16 细胞从上皮组织挤出的方向对其命运具有重要影响。（A）正常情况下，当细胞在肠道或乳腺上皮等组织中增殖并变得拥挤时，它们会被挤入管腔以维持细胞数量。由于失去生存信号，被挤出的细胞通常会发生凋亡。（B）荧光显微图像显示一个在三维（3D）培养中生长的乳腺上皮细胞团，其基底边界（红色）和细胞核（蓝色）被染色。随着组织囊的生长，占据管腔的中央细胞通过 caspase-3（绿色）染色显示发生凋亡。（C）具有上调生存信号的肿瘤细胞若被顶端挤出可能存活，但仍可能被清除；例如通过消化道排泄或从乳腺分泌。相比之下，被基底侧挤出的肿瘤细胞更容易启动侵袭。（B 图由 J. Debnath 提供。）]]
'''癌细胞在其自然环境中——即嵌入组织内部时——同样行为异常'''。例如，肠道上皮的正常细胞通过不断的分裂与死亡实现更新换代，却能通过将老化或受损细胞无缝排出至肠腔的方式维持屏障功能。'''这些细胞一旦脱离基质及相关的生存信号，便会通过细胞凋亡走向死亡'''。'''而癌变细胞通过颠覆正常的死亡信号，即便被排出上皮层仍可能存活。'''但由于细胞排出的正常方向是朝向肠腔，它们终究会被排泄通道清除。不过，癌症进展过程中筛选出的某些突变能够改变排出方向，从而使肿瘤细胞突破基底膜侵袭周围组织，可能导致转移。 (图 20-16)。

'''总之，通过违背"何处生存、何时死亡"的正常规则，癌细胞既逃避了生长抑制，又获得了繁荣增殖的新机遇。'''

=== 人类癌细胞突破细胞增殖的内在限制 ===
许多正常人类细胞在培养中受刺激增殖时，其分裂次数存在内在限制：经过特定次数的群体倍增后（例如人类成纤维细胞为25-50次），它们会永久停止分裂。这种细胞分裂计数机制被称为'''复制性细胞衰老'''，通常取决于染色体末端端粒的逐渐缩短——这一过程最终会改变其结构（第17章将讨论）。如第5章所述，端粒 DNA 在 S 期的复制依赖于端粒酶，这种酶能维持特殊的端粒 DNA 序列，促进形成保护染色体末端的蛋白质帽结构。由于许多增殖中的人类细胞（干细胞除外）缺乏端粒酶，其端粒会随着每次分裂而缩短，保护帽逐渐退化，产生 DNA 损伤信号——因为未受保护的染色体末端类似于双链断裂。最终，改变的染色体末端会引发永久性细胞周期停滞或导致细胞死亡。

人类癌细胞通过两种方式之一规避复制性细胞衰老。最常见的是，它们在增殖过程中'''重新激活端粒酶基因，使端粒不再缩短或脱帽'''；或者，它们可以'''激活一种基于同源重组 DNA 修复机制的途径来延长染色体末端（称为 ALT）'''。无论采用哪种策略，结果都是癌细胞在正常细胞因端粒侵蚀而停止增殖的条件下仍能持续分裂。

=== 癌细胞具有异常规避死亡信号的能力 ===
一个大型多细胞生物需要强大的安全机制来防范受损和异常细胞带来的麻烦。这些机制至关重要，因为如前所述，大量突变细胞将不可避免地产生。通常情况下，内部紊乱会在故障细胞中引发危险信号，激活保护措施以逆转并治愈这种紊乱，或者如果失败，则激活导致细胞通过凋亡死亡的决策（参见第18章）。为了生存，癌细胞需要通过突变来规避或突破这些旨在清除缺陷细胞的防御机制。
[[文件:MBOC-20.17.png|缩略图|图 20-17 大型肿瘤内部缺氧且缺乏营养。这幅转移至肺部的结肠腺癌横截面图显示，结直肠癌细胞已形成紧密的结节（深染区域）。转移灶中央呈粉红色的坏死区域中，濒死的癌细胞因超出血液供应范围而破裂，释放出其内容物。此类缺氧区域常见于肿瘤内部。（由 Andrew J. Connolly 提供。）]]
癌细胞通常含有驱动细胞进入异常状态的突变，此时代谢过程可能失衡，必需细胞成分可能以比例失调的方式产生。这类细胞稳态机制无法应对所受干扰的状态，通常被笼统地称为细胞应激状态。例如，在癌症发展过程中常见染色体断裂及其他形式的 DNA 损伤，这反映了癌细胞表现出的遗传不稳定性。因此，为了无限生存和分裂，潜在的癌细胞必须积累使正常安全机制失效的变化，否则这些机制会促使应激细胞通过凋亡方式自杀。

虽然癌细胞倾向于逃避凋亡，但这并不意味着它们很少死亡。相反，'''在大型实体瘤内部，细胞死亡往往大规模发生：生存条件恶劣，癌细胞之间为争夺氧气和养分展开激烈竞争。'''这些细胞大多通过另一种称为坏死（图20-17）的细胞死亡机制走向死亡。

肿瘤的生长是因为细胞增殖速度超过了细胞死亡速度，但通常仅以微弱优势。因此，肿瘤体积翻倍所需的时间可能远长于肿瘤细胞的细胞周期时间。

=== 癌细胞的糖代谢发生改变 ===
[[文件:MBOC-20.18.png|缩略图| 图 20-18 肿瘤细胞中的瓦博格效应反映了葡萄糖摄取与糖代谢的剧烈变化。（A）非增殖细胞通常会氧化从血液中摄入的几乎所有葡萄糖，通过线粒体中的氧化磷酸化过程产生 ATP。只有在缺氧情况下，这些细胞才会主要通过糖酵解产生 ATP，并将生成的丙酮酸转化为乳酸，以再生维持糖酵解所需的 NAD+ （参见图 2-50）。（B）相比之下，肿瘤细胞即使在有氧条件下通常也会产生大量乳酸。这是由于糖酵解速率大幅提升，而这一过程又得益于葡萄糖摄入速率的大幅增加。通过这种方式，肿瘤细胞类似于胚胎中快速增殖的细胞，这些细胞同样需要大量小分子构建块供应以进行生物合成，而这些构建块可由摄入的葡萄糖产生（另见图 2-60）。]]
在氧气充足的情况下，大多数成体组织中的分化细胞会将摄入的葡萄糖中几乎所有的碳完全氧化为 CO2 ，最终由肺部作为废物排出。不断生长的肿瘤需要大量营养物质来提供构建新大分子的基础材料。相应地，大多数肿瘤在代谢上更类似于发育中的胚胎，而非正常成人组织。'''肿瘤细胞贪婪地消耗葡萄糖，从血液中摄取葡萄糖的速率可达邻近正常细胞的100倍之多。'''此外，这些被摄入的葡萄糖中只有一小部分通过线粒体氧化磷酸化，这通常能高效生产 ATP。相反，葡萄糖中碳原子的代谢被重新调整，以支持合成蛋白质、核酸和脂质所需的原材料生产，从而促进细胞增殖（图 20-18）。换言之，尽管糖酵解是一种比氧化磷酸化效率低得多的 ATP 生产方式，但在缺氧环境中的癌细胞中，它可以持续不断地进行，并且具有产生丰富细胞构建模块的关键附加益处。

'''肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下也倾向于弱化氧化磷酸化，同时大量摄取葡萄糖，'''这种特性对许多癌细胞的快速增殖至关重要，被称为'''瓦博格效应'''——因奥托·瓦博格在二十世纪初首次发现此现象而得名。正是这种异常高的葡萄糖摄取能力，使得肿瘤能够在全身扫描中被选择性成像（见图20-1），从而为监测癌症进展及治疗反应提供了一种方法。

=== 肿瘤微环境影响癌症发展 ===
虽然肿瘤中的癌细胞携带有危险突变且通常明显异常，但肿瘤中的其他细胞——尤其是支持性结缔组织或间质中的细胞——绝非被动的旁观者。'''肿瘤的发展依赖于癌细胞与肿瘤间质之间的双向通讯'''，正如上皮器官的正常发育依赖于上皮细胞与间质细胞之间的通讯（第22章将讨论）。
[[文件:MBOC-20.19.png|缩略图|图20-19 肿瘤微环境在肿瘤发生中发挥作用。肿瘤由多种细胞类型组成，包括癌细胞、内皮细胞、周细胞（血管平滑肌细胞）、成纤维细胞和炎症性白细胞。这些细胞类型之间的通讯在肿瘤发展中起着重要作用。但需注意，一般认为只有肿瘤中的癌细胞含有使其基因异常的突变。]]
基质为肿瘤提供了结构框架。就正常结缔组织而言，基质由成纤维细胞、炎性白细胞以及形成血管和淋巴管内皮细胞及其伴随的平滑肌细胞构成（图20-19）。随着癌瘤的发展，癌细胞通过分泌信号蛋白改变基质细胞行为，并通过蛋白水解酶修饰细胞外基质，从而诱导基质发生变化。反过来，基质细胞通过分泌刺激癌细胞生长分裂的信号蛋白以及进一步重塑细胞外基质的蛋白酶，作用于肿瘤细胞。如此，'''肿瘤与其基质共同演化'''，犹如杂草与其入侵的生态系统，'''肿瘤可能变得依赖于其特定的基质细胞。'''利用小鼠进行的实验表明，'''某些移植的癌瘤的生长依赖于肿瘤相关成纤维细胞，而正常成纤维细胞则无法满足需求。'''

癌细胞与基质中的免疫系统细胞存在复杂的相互作用，这些免疫细胞若识别出肿瘤为异常组织则具有摧毁肿瘤的潜力，但也能通过提供刺激癌细胞增殖的信号来促进肿瘤生长。肿瘤至少能以两种方式操纵免疫系统为己所用：首先，'''肿瘤可能引发类似正常组织损伤时的炎症反应，这有助于其获取生存和生长所需的基质'''。因此，肿瘤常被比作'''无法愈合的伤口'''，引发包括附近血管通透性增加（允许信号分子自由进出血管）、细胞外基质沉积等相同反应。肿瘤还会刺激新血管形成（该过程称为血管生成），随着肿瘤体积增大内部出现缺氧时，血管生成能促进其存活。其次同样重要的是，'''肿瘤通过阻断可能导致其毁灭的白细胞活化，建立起免疫抑制微环境。''' 克服肿瘤抑制免疫反应能力的策略最近已成为癌症治疗中的有力工具，这些策略将在本章最后一节详细阐述。

=== 癌细胞必须在异质环境中生存与增殖 ===
为了致命，癌细胞通常需要通过一种称为转移的过程在体内新部位扩散并增殖。这是癌症最致命且最不为人知的方面，导致了 90% 的癌症相关死亡。癌细胞通过全身扩散，使得无论是手术还是局部放疗都几乎无法根除。转移本身是一个多步骤过程：癌细胞首先必须侵入局部组织和血管，通过循环系统移动，离开血管，然后在远处部位建立新的细胞群落（图20-20）。每个环节都极为复杂，其中涉及的大多数分子机制尚未明确，'''但最终步骤——远处部位的定植——是整个过程的限速环节。'''
[[文件:MBOC-20.20.png|缩略图|图 20-20 转移过程的步骤。此示例展示了肿瘤从其原发部位（如膀胱）扩散至另一器官（如肝脏）的过程。肿瘤细胞可通过穿越血管壁直接进入血流（如图所示），或者更常见的是通过穿越淋巴管壁进入——淋巴管最终将其内容物（淋巴液）排入血流。进入淋巴管的肿瘤细胞常会沿途滞留于淋巴结，从而引发淋巴结转移。动物研究表明，通常每千个进入血流的恶性肿瘤细胞中，存活超过 24 小时的不足一个，且这些存活的循环肿瘤细胞（CTCs）中仅有不到0.1%能够在新组织中定植，从而在新部位形成可检测到的肿瘤。]]
癌细胞若要变得恶性，必须摆脱那些约束正常细胞、使其保持在适当位置并防止侵入邻近组织的限制。因此，侵袭性是恶性肿瘤的一个决定性特征，这些肿瘤呈现出无序的生长模式和参差不齐的边界，并向周围组织延伸（例如，参见图20-8）。尽管其背后的分子变化尚未完全明了，但侵袭性几乎肯定需要破坏那些通常将细胞束缚在适当邻居和细胞外基质上的粘附机制。

转移过程的下一步——在远处器官建立集落——始于进入循环系统：侵袭性癌细胞必须穿透血管或淋巴管壁。淋巴管比血管更大且管壁更脆弱，允许癌细胞以小团块形式进入；这些团块随后可能被困在淋巴结中，形成淋巴结转移。相比之下，进入血管的癌细胞则以单个或极少数小簇形式存在。借助根据细胞表面特性分选细胞的现代技术，现已能够在癌症患者的血液样本中检测到这些循环肿瘤细胞（CTCs），尽管它们仅占血细胞总数的极小部分。值得注意的是，在小鼠模型中，CTC 团块形成转移的比率显著高于单个 CTC。据推测，上皮源性癌细胞之间的相互粘附有助于克服死亡信号并抑制细胞凋亡。

进入淋巴管或血液的癌细胞中，仅有极少数能成功脱出、在新部位定居，并在那里存活增殖成为转移灶的奠基者。要探究转移过程中哪个后续环节对癌细胞构成最大障碍，可用荧光染料或绿色荧光蛋白（GFP）标记细胞，将其注射入小鼠血液后追踪其命运（参见影片 20.4）。此类实验表明，无论源自易转移或非转移性肿瘤，多数细胞都能在循环系统中存活，滞留于微小血管并渗入周围组织。部分细胞在进入异体组织后立即死亡；另一些虽能成功侵入异质环境却无法增殖。另一些细胞分裂数次后便停止，形成包含十个至数千个细胞的小型转移灶。极少数能形成完全发展的转移瘤。实验表明，成功完成这一壮举的细胞不足千分之一，甚至可能是百万分之一。定植的最后一步似乎最为艰难：正如维京人在格陵兰荒凉海岸登陆时的遭遇，迁移的细胞可能无法在陌生环境中存活，或只能短暂繁衍形成一个小型群落——即微小转移灶——随后便消亡（参见影片20.5）。

许多癌症在形成转移灶前就被发现，通过清除原发肿瘤即可治愈。但偶尔会有未被发现的远处微小转移灶潜伏多年，直到原发肿瘤被切除很久后，才突然生长形成大型继发性肿瘤而显露踪迹。

=== 摘要 ===
癌细胞，顾名思义，是在违背正常调控的情况下生长和增殖（即具有肿瘤性），并获得侵袭周围组织并在远处器官定植的能力（即具有恶性）。通过形成继发性肿瘤或转移灶，它们变得难以通过手术或局部放疗根除。癌症被认为起源于单个经历了初始突变的细胞，但该细胞的后代必须经历许多进一步的变化才能癌变。肿瘤进展通常需要多年时间，反映了类似达尔文进化过程的作用，其中体细胞经历突变和表观遗传变化，伴随着自然选择以及偶尔爆发的基因组混乱，从而产生异质性。

癌细胞在演化、增殖和扩散过程中获得多种特殊属性。其突变基因组使它们能够无视正常严格控制细胞增殖的信号而生长分裂。作为肿瘤进展演化过程的一部分，癌细胞获得了诸多额外异常特征，包括：永久停止细胞分裂或响应细胞应激及 DNA 损伤而诱导凋亡的控制机制缺陷，以及阻止细胞偏离其正常位置的常规机制缺陷。所有这些变化增强了癌细胞在原始组织中生存、生长和分裂的能力，进而发生转移，在异质环境中建立新的病灶。肿瘤的演化还取决于肿瘤微环境中存在的其他细胞——统称为基质细胞，这些细胞被癌症吸引并受其操纵。

由于需要许多改变才能赋予这一系列非社会性行为，大多数癌细胞在遗传和/或表观遗传上不稳定并不令人意外。这种不稳定性被认为是在能够产生肿瘤的异常细胞克隆中被选择的，因为它极大地加速了肿瘤进展所需的进一步遗传和表观遗传变化的积累。

== 癌症关键基因：发现方式与功能解析 ==
正如我们所知，癌症依赖于体细胞中可遗传变化的积累；也就是说，这些变化会通过细胞传递给其后代。要在分子层面理解这一点，我们需要识别出相关的突变和表观遗传改变，并揭示它们如何导致癌细胞行为。找到相关细胞通常较为容易；它们受到自然选择的青睐，并通过形成肿瘤而引起注意。但是，我们如何在癌细胞的所有其他基因中识别出那些经历了促癌变化的基因呢？典型的癌症依赖于一整套突变和表观遗传变化，这些变化在两位不同患者中从未完全相同，尽管某些肿瘤类型之间存在共性。此外，一个给定的癌细胞还会包含大量体细胞突变，这些突变是其遗传不稳定性的偶然副产品——即所谓的“乘客”而非“驱动”突变，并且很难将这些偶然变化与关键变化区分开来。

从那些在疾病中具有因果作用的变化中区分出来。尽管存在这些困难，过去40年间，许多在人类癌症中反复发生改变的基因已被识别。我们暂且将这些基因称为癌症关键基因，意指所有其改变可能促成癌症发生或演化的基因。

在本节中，我们将首先讨论如何识别癌症关键基因。随后我们将审视它们的功能及其在赋予癌细胞本章第一部分所述特性中所起的作用。最后，我们将以结肠癌作为扩展案例结束本节，展示癌症关键基因中的一系列变化如何使肿瘤从一种不良行为模式演变为更恶劣的另一种模式。

=== 功能获得性与功能缺失性癌症突变的识别传统上需要不同的方法 ===
癌症关键基因根据其风险源于基因产物活性过高或过低，被划分为两大类。'''第一类基因中，功能获得性突变可驱动细胞癌变，称为原癌基因；其突变型、过度活跃或过度表达的形式则称为癌基因。第二类基因中，功能丧失性突变可能促成癌症，称为抑癌基因'''。无论哪种情况，突变都可能直接导致癌症（如使本不应增殖的细胞异常增殖），或间接导致癌症；例如，通过引发遗传或表观遗传不稳定性，从而加速其他直接刺激肿瘤生长的遗传变化的发生。那些因改变而导致基因组不稳定性的基因，构成了癌症关键基因的一个亚类，有时被称为基因组维护基因genome maintenance genes。

正如我们将要看到的，癌基因和抑癌基因的突变在促进癌症发展方面可能产生相似效果；例如，细胞增殖信号的过度产生可能源于任何一种突变。因此，从癌细胞的角度来看，癌基因与抑癌基因——以及影响它们的突变——实为一体两面。然而，导致这两类基因被发现的研究技术却截然不同。
[[文件:MBOC-20.21.png|缩略图|图 20-21 癌症关键突变可分为显性和隐性两个明显不同的类别。图中，实心红框代表激活突变，空心红框代表失活突变。（A）癌基因以显性方式作用：单个癌症关键基因副本的功能获得性突变即可驱动细胞癌变。（B）而抑癌基因的突变通常以隐性方式作用：必须同时丧失两个等位基因的功能才能驱动细胞癌变。虽然图中抑癌基因的第二个等位基因因突变而失活，但实际上该基因常因第二条染色体的缺失而失活。未图示的是，某些抑癌基因的突变即使仅损坏两个基因副本中的一个，也可能产生效应。]]
原癌基因单拷贝突变转化为癌基因时，会对细胞产生显性的促生长效应（图 20-21A）。因此，我们可以通过将癌基因添加到合适的测试细胞或实验动物基因组中（例如通过 DNA 转染或病毒载体转导）时产生的效应来识别它。相反，对于抑癌基因而言，由突变产生的致癌等位基因通常是隐性的：通常（但并非总是）需要移除或灭活二倍体体细胞中的两个正常基因副本才能观察到效应（图 20-21B）。这为采用不同的实验方法提供了依据，即专注于发现癌细胞中缺失的内容。

我们首先讨论几类癌症关键基因的实例以阐明基本原理。这些案例的选择也基于其历史重要性：导致它们被发现的实验——在不同时期通过不同方法——标志着癌症认知历程的转折点。

=== 逆转录病毒引领了癌基因的鉴定 ===
人类癌症遗传原因的探索走过了一条曲折的道路，始于对肿瘤病毒研究提供的线索。尽管病毒仅与少数人类癌症有关，但一组感染动物的病毒为研究癌症提供了关键的早期工具。

首个被证实与癌症相关的动物病毒之一是在 100 多年前于鸡体内发现的，当时一种导致结缔组织肿瘤（即肉瘤）的传染源被确认为病毒——劳斯肉瘤病毒。与之后发现的所有其他 RNA 肿瘤病毒一样，它属于逆转录病毒。当它感染细胞时，其 RNA 基因组通过逆转录过程被复制成 DNA，并插入宿主基因组中，可在其中持续存在并被后续细胞世代遗传。劳斯肉瘤病毒插入的 DNA 中有某种物质使宿主细胞癌变，但这究竟是什么呢？答案令人意外。原来是一段对病毒自身生存或繁殖并非必需的 DNA；相反，它是一个“乘客”，一个名为 Src 的基因，是病毒在其传播过程中获取的。Src 基因与所有脊椎动物基因组中都存在的一个基因——c-Src 基因——明显相似但不完全相同，后者编码一种蛋白酪氨酸激酶。 c-Src 显然是被逆转录病毒意外地从先前感染宿主细胞的基因组中获取，并在此过程中发生突变成为致癌基因（ v - Src）。

在这项诺贝尔奖获奖成果之后，涌现出大量关于其他逆转录病毒携带的致癌基因的发现，这些病毒会导致非人类动物罹患癌症。每一个这样的致癌基因都被证实与正常脊椎动物基因组中的原癌基因相对应。与 Src 的情况类似，这些其他致癌基因通常在结构或表达水平上与其正常对应基因存在差异。

但这与典型的人类癌症有何关联？在那些癌症中，逆转录病毒并未被确认发挥作用。在一项旨在识别人类致癌基因的实验中，研究人员从人类肿瘤细胞中提取 DNA，将其分割成片段，并引入培养的小鼠细胞中。培养皿中开始偶尔出现异常增殖的细胞集落，这些细胞展现出转化表型，其生长速度超过培养皿中未转化的细胞，并层层堆积（见图 20-15）。每个集落都是一个克隆，源自单个细胞，该细胞整合了驱动癌性行为的 DNA 片段。经分离和测序后，这些 DNA 片段被发现含有一个人类版本的基因，该基因此前已在研究一种导致大鼠肿瘤的逆转录病毒时为人所知——一种名为 v - Ras 的致癌基因。这一新发现的致癌基因显然是由正常人类基因突变而来，属于一小类名为 Ras 的原癌基因家族。20 世纪 80 年代初，人类肿瘤细胞与动物肿瘤病毒中同一致癌基因的发现令人震惊。癌症由少数关键癌症基因突变引起的这一观点，彻底改变了我们对癌症分子生物学的理解。

如第 15 章所述，正常的 Ras 蛋白是单体 GTP 酶，协助将信号从细胞表面受体传递至细胞内部（参见影片 15.7）。从人类肿瘤中分离出的 Ras 致癌基因含有位点突变，这些突变会产生过度活跃的 Ras 蛋白，使其无法通过水解结合的 GTP 为 GDP 来自行关闭。由于这种突变导致蛋白质过度活跃，其效应呈显性；即细胞的两个基因副本中只需一个发生改变即可产生影响。在所有人类癌症中，约 30% 存在三种人类 Ras 家族成员中某一种的突变。因此，Ras 基因成为所有关键癌症基因中最为重要的成员之一。

=== 癌症中突变的基因可通过多种方式变得过度活跃 ===
图 20-22 总结了原癌基因转变为癌基因的几种机制。(1)DNA 序列的微小变化，如点突变或缺失，若发生在蛋白质编码区内可能产生过度活跃的蛋白质，若发生在基因调控区域则可能导致蛋白质过量表达。(2)基因扩增事件（例如由 DNA 复制错误引起）可能产生额外的基因拷贝，从而导致蛋白质过量生成。(3)染色体重排——涉及 DNA 螺旋的断裂与重连——可能改变蛋白质编码区域形成过度活跃的融合蛋白，或改变基因调控区域导致正常蛋白质的过度表达。
[[文件:MBOC-20.22.png|居中|缩略图|577x577像素|图20-22 原癌基因转化为癌基因的意外突变类型]]
[[文件:MBOC-20.23.png|缩略图|图 20-23 表皮生长因子（EGF）受体的突变可使其在缺乏 EGF 时仍保持活性，从而具有致癌性。正常情况下，EGF 与受体胞外结构域结合会导致胞内结构域磷酸化，进而激活信号传导。胞外结构域的截断会导致过度磷酸化和异常激活。在不同癌症中还观察到其他类型的激活突变。]]
例如，表皮生长因子（EGF）这种胞外信号蛋白的受体，可通过缺失部分胞外结构域的突变而被激活，导致其在缺乏 EGF 的情况下仍保持活性（图 20-23）。这种突变的 EGF 受体因此会产生不当的刺激信号，就像故障的门铃即使无人按动也会自鸣。此类突变常见于最常见的人类脑肿瘤——胶质母细胞瘤中。

再举一例，Myc 蛋白在细胞核内促进细胞生长与分裂（参见第 17 章），其正常形式的过量产生通常会导致癌症。某些情况下，该基因会发生扩增，即 DNA 复制错误导致单个细胞内产生大量基因拷贝。或者点突变可使这种通常快速更新的蛋白质变得稳定。更常见的是，过量生产似乎源于作用于该基因的调控元件发生变化。例如，染色体易位可能错误地将强效基因调控序列与 Myc 蛋白编码序列相邻，从而产生异常大量的 Myc mRNA。因此，在伯基特淋巴瘤中，易位使 Myc 基因受控于通常驱动 B 淋巴细胞中抗体基因表达的序列，导致突变 B 细胞过度增殖并形成肿瘤。不同的特异性染色体易位在其他癌症中也较为常见。

=== 对罕见遗传性癌症综合征的研究首次鉴定出抑癌基因 ===
识别癌细胞基因组中失活的基因需要不同于寻找过度活跃基因的策略：例如，无法通过细胞转化实验来识别根本不存在的东西。导致首个抑癌基因发现的关键洞见来自于对一种罕见人类癌症——视网膜母细胞瘤的研究，这种癌症源于视网膜细胞，仅需极少数突变即可转化为癌变状态。正如生物学中常见的那样，这一发现始于对特殊案例的考察，但最终揭示了一个具有广泛重要性的基因。

视网膜母细胞瘤多发于儿童期，肿瘤由未成熟视网膜中的神经前体细胞发展而来。约每两万名儿童中有一名患病。该疾病分为遗传性和非遗传性两种形式。遗传性病例通常双眼独立出现多个肿瘤；而非遗传性病例仅单眼受累，且通常只有一个肿瘤。少数视网膜母细胞瘤患者可见染色体核型异常，表现为13号染色体特定区带的缺失——若该缺失被遗传，将显著增加患病风险。在部分非遗传性患者的肿瘤细胞中也发现了相同区域的缺失，这表明该癌症是由该关键基因位点的缺失所引发。

通过定位这一染色体缺失的位置，科学家得以识别出 Rb 基因。随后发现，患有遗传性该疾病的患者在每一个体细胞中，其 Rb 基因的一个拷贝存在缺失或功能丧失突变。这些细胞虽具有癌变倾向，但只要保留一个完好的基因拷贝就不会癌变。而癌变的视网膜细胞由于体细胞事件消除了先前完好拷贝的功能，导致 Rb 基因的两个拷贝均存在缺陷。

相比之下，在非遗传性该疾病患者中，非癌变细胞的 Rb 基因两个拷贝均无缺陷，而癌变细胞的两个拷贝则均出现缺陷。这类非遗传性视网膜母细胞瘤极为罕见，因为它们需要两个独立事件在同一视网膜细胞谱系中使两条染色体上的相同基因失活（图 20-24）。

在几种常见的散发性癌症中， Rb 基因同样缺失，包括肺癌、乳腺癌和膀胱癌。这些更为常见的癌症是由一系列比视网膜母细胞瘤更为复杂的遗传变化引发的，且发病时间通常较晚。但在所有这些癌症中， Rb 功能的丧失似乎常常是向恶性进展的关键一步。

该 Rb 基因编码的 Rb 蛋白，是体内几乎所有细胞周期的一种普遍调节因子（见图 17-59）。它作为细胞分裂周期进程的主要制动器之一，其缺失可能导致细胞不适当地进入细胞周期，这一点我们将在后面讨论。

图 20-24 导致视网膜母细胞瘤的遗传机制。在遗传性病例中，体内所有细胞都缺失两个正常功能性抑癌基因副本中的一个，而肿瘤则源于某个细胞克隆，其中剩余的副本因体细胞事件（突变或表观遗传沉默）而丢失或失活。在非遗传性病例中，所有细胞最初均含有该基因的两个功能性副本，肿瘤的发生是由于两个体细胞事件巧合地发生在同一细胞系中，导致两个副本均丢失或失活。

=== 遗传与表观遗传机制均可导致抑癌基因失活 ===
[[文件:MBOC-20.25.png|缩略图|图 20-25 通过 DNA 序列改变或表观遗传机制使抑癌基因剩余完好拷贝失活的六种方式。仅两个抑癌基因拷贝中一个存在缺陷的细胞——例如 Rb 基因——通常表现为正常健康细胞；示意图展示了该细胞如何可能进一步丧失另一个基因拷贝功能，从而向癌症发展。]]
遗传与表观遗传机制均可导致抑癌基因失活对于抑癌基因而言，其失活状态才是危险的。这种失活可通过多种方式发生，不同的异常组合可导致两个基因拷贝同时被消除或功能受损。例如，第一个拷贝可能因染色体微小缺失而丢失，或因 DNA 复制过程中的随机错误导致点突变失活；第二个拷贝则更常通过非特异性机制被清除——这种机制易发生于向癌症发展且已出现基因组不稳定的细胞中。例如，携带剩余正常拷贝的染色体可能在细胞分裂过程中丢失（见图 20-11），或由于染色体分离错误受损；亦或正常基因及其邻近遗传物质可能通过有丝分裂重组事件或伴随的基因转换被突变版本取代（参见 305-306 页）。表观遗传改变则为抑癌基因的永久性失活提供了另一重要途径。最常见的情况是，其启动子中 CG 序列的 C 核苷酸可能以可遗传的方式发生甲基化，这能在细胞及其所有后代中不可逆地使该基因沉默（参见第 435-436 页）。图 20-25以 Rb 基因为例，总结了通过 DNA 序列或表观遗传变化导致抑癌基因剩余完好拷贝功能丧失的各种途径。

=== 癌细胞基因组的系统测序彻底改变了我们对这种疾病的理解 ===
我们上述所描述的方法揭示了一组以零散方式被识别的癌症关键基因。与此同时，癌细胞基因组的其余部分仍处于未知之中：那里潜藏着多少其他突变、属于何种类型、出现在哪些癌症种类中、频率如何、个体间差异多大以及带来什么后果，都是未解之谜。随着人类基因组的测序完成和 DNA 测序技术的巨大进步（见图 8-44），现在我们已经能够一览全貌——全面审视癌细胞基因组。这彻底改变了我们对这种疾病的理解。

癌细胞基因组可通过多种不同方式进行系统性扫描。最极端的方法——虽然成本最高但已不再令人望而却步——是对肿瘤进行全基因组测序。更经济的方式是仅关注人类基因组中约 21,000 个编码蛋白质的基因（即外显子组），寻找癌细胞 DNA 中导致产物氨基酸序列改变或阻碍其合成的突变（图 20-26）。此外，DNA 测序还能检测基因组中发生缺失或重复的区域，揭示拷贝数变异及染色体增减（非整倍性）。基因组扫描还可检测表观遗传变化，揭示 DNA 甲基化模式的改变或伴随转录沉默或激活而不影响 DNA 序列的其他变化。通过系统性 RNA 测序，可分析 mRNA（见图 7-5）及调控性非编码 RNA 水平，从而揭示基因表达水平的变化。最后，为了通过检测已知关键癌症基因的蛋白质产物来直接测量其表达，可以利用质谱技术对肿瘤细胞裂解液进行定量分析。这些方法涉及将癌细胞与正常对照组进行比较——理想情况下，对照组应来自同一组织且同一患者的非癌细胞。

通过美国国立卫生研究院协调的"癌症基因组图谱"联盟，上述高通量方法的组合已应用于涵盖 33 种癌症类型的超过 10,000 个肿瘤样本。其他国际性免费资源，如 COSMIC（癌症体细胞突变目录），正在持续汇编新的癌症数据。正如我们下文将讨论的，这些大规模项目重要地揭示了癌症基因组中存在哪些类型的变异、不同癌症类型之间及内部哪些基因或通路发生改变，以及肿瘤内癌细胞的异质性有多大，以及疾病进展和治疗过程中改变模式随时间演变的特点。

图 20-26 癌基因与抑癌基因中发现的 DNA 序列变化类型对比。本图中，改变氨基酸的突变用蓝色箭头标示，而截断多肽链的突变则用黄色箭头标示。（A）如此例所示（产生磷酸肌醇 3-激酶亚基的 PIK3CA 基因），癌基因突变可通过基因错义突变中反复出现的相同核苷酸变化来识别。（B）如此例所示（ Rb 基因），抑癌基因中以产生终止密码子中断蛋白质合成的错义突变为主。需注意蛋白质编码序列中仅少数可能突变具有激活作用，而失活可能是错义、无义和移码突变的结果。（改编自 B. Vogelstein 等人，《科学》339 卷 1546-1558 页，2013 年。）

=== 许多癌症具有高度紊乱的基因组 ===
癌症基因组分析首先揭示了癌细胞中大规模遗传破坏的程度。这在癌症类型之间以及不同癌症患者之间差异巨大，无论是严重程度还是性质特征。如前所述（见第 1169 页），染色体核型可能看似正常，但由于修复机制失效——这些机制通常负责纠正 DNA 序列复制或维护过程中的错误——导致单个基因中存在大量点突变。然而，核型常常极度紊乱，伴随着许多染色体断裂、重排以及完全混乱的染色体序列，这表明 DNA 发生了广泛断裂后随机重组（如染色体碎裂现象；见图 20-11）。从这些变化模式可以推断，在肿瘤进化过程中破坏性事件反复发生，遗传紊乱呈渐进性加剧。

许多人类癌症的一个共同特征是染色体非整倍性——即染色体核型从正常数目（46 条）发生改变。一项针对超过 10,000 个癌症基因组的染色体水平增益或缺失的研究显示，大多数癌症类型都具有特征性的染色体异常模式，不同臂或整条染色体以不同频率发生改变。在许多情况下，由于细胞分裂完全失败，整套染色体被复制或四倍化，产生多倍体细胞，随后经历额外的染色体增益和丢失。几乎 90% 的被调查癌症都显示出某种程度的非整倍性。图 20-27 展示了部分数据，呈现了特定肿瘤类型，每种类型都显示出独特的非整倍性模式。例如，虽然 74% 的甲状腺癌显示出正常核型，但仅有不到 5% 的胶质母细胞瘤和宫颈癌肿瘤拥有正常染色体数目。尽管非整倍性程度通常是癌症类别的特征，但异质性也同样明显。例如，胶质母细胞瘤的一个亚型以7号染色体增益和10号染色体缺失为特征，但这种缺陷组合并非在所有病例中都存在，表明存在多种基因组紊乱途径，可导致不同的癌症亚型。

癌症基因组研究还揭示了导致基因组紊乱的根本缺陷。例如，在卵巢癌中，染色体断裂、易位和缺失极为常见，这些异常与同源重组修复 DNA 双链断裂所需基因（尤其是 Brca1 和 Brca2）的高频突变和表观遗传沉默密切相关（参见第 300-301 页）。另一方面，在部分子宫内膜癌中，则发现大量点突变遍布基因组，这可能是由 DNA 复制过程中校对所需酶类突变所致（参见第 267-269 页）。由此可见，不同癌症及其亚型具有高度可变的突变率，范围从某些儿科癌症每个外显子组仅一个碱基替换，到诱变剂诱导的恶性肿瘤（如肺癌和黑色素瘤）每个外显子组数千个突变不等。

=== 表观遗传与染色质改变助推多数癌症发生 ===
迄今为止，我们主要关注的是直接促成癌症特征的癌症关键基因突变。然而，对癌症发生同样重要的是表观遗传上改变基因表达而不改变 DNA 序列的变化。如前所述，增加如 Rb 等基因启动子区域的 DNA 甲基化可永久沉默该基因。此外，可逆的共价修饰如甲基化和乙酰化也发生在将 DNA 包装成染色质的组蛋白上。这些组蛋白标记通过改变染色质的构象及其对转录因子和染色质重塑复合物等调控因子的可及性来调节基因表达（参见第七章）。大规模基因组测序项目的一个重要发现是，大约 50% 的人类癌症在染色质蛋白中存在突变，这包括那些负责添加、移除或识别组蛋白和 DNA 上共价标记的酶的突变。许多由此产生的缺陷有可能导致可遗传的表观遗传变化，这些变化调节基因表达并促进肿瘤发生。

图 20-27 不同肿瘤类型中非整倍体的普遍性。每种肿瘤类型检测到的染色体臂总数绘制于 X 轴。正常核型中的染色体臂数量已标注。同时展示了基因组倍性状态（黑色表示未倍增，蓝色表示一次基因组倍增，红色表示两次或更多次基因组倍增）。各肿瘤类型中拥有相应染色体臂数量的肿瘤样本数通过 Y 轴上条形长度表示。需注意，某些肿瘤类型的样本主要呈现正常核型，而其他肿瘤类型的样本则因广泛存在的非整倍体现象表现出染色体臂数量急剧增加的极端异质性。（改编自 A.M. Taylor 等人，《癌细胞》33:676-689, 2018。）

通常，遗传和表观遗传变化共同作用导致癌症（图 20-28）。在某些情况下，表观遗传变化先于特征性的致癌突变，甚至可能引发这些突变，例如当负责修复 DNA 损伤的基因因表观遗传沉默而增加突变率时。在其他情况下，DNA 序列的意外变化可能破坏染色质和表观遗传调控。一个例子是编码异柠檬酸脱氢酶（IDH）的基因发生功能获得性突变，已知这是包括胶质瘤、白血病和其他肿瘤在内的多种癌症中常见的起始事件。突变的 IDH 产生高水平的代谢物 2-羟基戊二酸，该物质抑制 DNA 去甲基化酶。因此，IDH 突变细胞中的 DNA 在基因组随机位点出现超甲基化。正如 DNA 突变一样，那些在生长或生存方面提供选择优势的表观遗传变化将使受影响的细胞及其后代得以持续存在并积累更多变化，从而促进癌症进展。

突变 IDH 对 DNA 超甲基化的间接影响揭示了另一个重要观点：代谢条件会影响染色质状态，进而可能影响基因表达。值得注意的是，只有少数具有异常 DNA 甲基化的癌症可由潜在的遗传事件解释。这些观察结果表明，环境条件本身可能并不具有诱变性，但可以作为表观遗传变化的来源。许多 DNA 和组蛋白修饰酶需要代谢物作为辅因子，这为已知的人类癌症风险因素（如饮食和炎症）与癌症发展之间提供了潜在联系。

除了调控单个基因的表达外，表观遗传变化还能对染色质状态产生更全局性的影响，从而调控决定细胞行为程序的基因网络。例如，由表观遗传标记决定的不同基因表达模式，可能限制细胞启动凋亡的能力，或阻止其退出细胞周期并发生分化。癌症中存在此类变化的证据来源于对罕见儿童脑肿瘤的研究——这些肿瘤缺乏体细胞突变，却表现出异常的 DNA 甲基化谱。

必须牢记的是，由表观遗传调控导致的基因激活与沉默模式改变，是细胞分化的正常特征。通过精确的发育程序，同一基因组得以产生并维持多种不同细胞类型（参见第21章）。因此，与癌细胞的其他特性一样，表观遗传变化并非新的生物学现象，而是对现有细胞机制的颠覆。

=== 数百种人类基因与癌症发生相关 ===
在目前已识别的数十亿个癌细胞体细胞突变中，我们如何发现哪些是癌症的驱动因素，即疾病发展中的致病因子？显然，大多数突变仅仅是乘客突变——由于基因不稳定性，这些突变恰好与驱动突变发生在同一细胞中，但与癌症的发展无关。一个判断标准是发生频率。影响疾病相关基因的驱动突变会在许多患有特定类型癌症的不同个体中反复出现。相反，不赋予癌细胞选择性优势的乘客突变可能只会罕见地出现。

通过汇编不同类型癌症的基因组序列数据（每种癌症都有其特定的一组已识别驱动突变），我们可以建立一个被强烈怀疑至少对一种肿瘤类型至关重要的癌症关键基因的全面的目录。目前估计这类基因总数约为 '''300 个'''，约占人类基因组基因数量的 1% 。这些癌症关键基因惊人地多样化，揭示了机制上意想不到的广度。虽然部分新发现的癌症基因编码了可能预期会在癌细胞中发生突变的经典信号传导和细胞周期蛋白，但其他基因则归属于新颖且有时令人惊讶的类别。这些功能涵盖代谢、染色质生物学、RNA 剪接、蛋白质稳态和细胞分化等多个方面。显然，在任何组织中，这些过程的改变都可能促使细胞演化出第 1172 页所列的癌变特性。

图20-28 表观遗传与遗传机制可协同促进癌症的演变。基因突变和环境因素（如代谢状态）均可导致表观遗传变化。如图所示，这些表观遗传变化反过来会加速遗传及进一步表观遗传变化的积累——通过改变基因表达的方式促进癌细胞增殖，并在细胞克隆中遗传，从而加快癌症进展的进程。

显然，导致癌症的分子变化是复杂的。然而，正如我们现在所要说明的，这种复杂性并不像最初看起来那么令人生畏。

=== 少数关键通路的紊乱常见于多种癌症 ===
某些基因，如 Rb 和 Ras ，在多种癌症及不同类型癌症病例中频繁发生突变。像 Rb 和 Ras 这类基因参与癌症发生并不令人意外，鉴于我们已了解其正常功能：它们调控细胞分裂与生长的基本过程。但即便是这些常见元凶，在个体病例中的占比也远低于半数。在众多癌症案例中，当例如 Rb 保持完整或 Ras 未发生突变时，这些过程的调控机制究竟出现了什么问题？其他数百个癌症关键基因的突变在疾病发展中扮演着怎样的角色？随着对人类基因组中基因正常功能认知的不断深入，我们越来越容易从已收录的驱动突变中发现规律，并为这些问题提供简明的解答。

为了阐明所揭示的模式类型，以致命疾病胶质母细胞瘤——人类最常见脑癌为例。对 91 名患者肿瘤细胞基因组的分析共识别出至少 79 个在多个个体中发生突变的基因。这些基因中大多数正常功能已知或可推测，因此能够将其归类至特定生化或调控通路。其中三个功能组别尤为突出，涵盖了 21 个高频突变基因。第一组由 Rb 通路基因构成（即 Rb 本身及其直接调控基因 Rb ），该通路主导细胞分裂周期的启动；第二组包含与 Ras 处于同一调控子网络的基因——以其三个核心组分命名为 RTK/Ras/PI3 激酶通路，负责将细胞生长与分裂信号从胞外传递至胞内；第三组由调控应激反应与 DNA 损伤修复的通路基因组成——即 p53 通路。关于这些通路，我们将在下文进一步阐述。

在 91 例胶质母细胞瘤中， 74% 所有三种通路均存在可识别的突变。若进一步追溯这些通路上游，并纳入所有已知和未知的依赖组件，这一比例几乎必定更高。换言之，几乎在每一例胶质母细胞瘤中，都存在破坏三种基本调控机制的突变：细胞生长调控、细胞分裂调控，以及应激与 DNA 损伤应答调控。

值得注意的是，在任何特定的肿瘤细胞克隆中，每个通路中通常只有一个基因发生突变。显然，对肿瘤进化而言，关键在于控制机制的破坏，而非实现这一破坏的遗传手段。例如，在某个肿瘤细胞的 Rb 基因本身未发生突变的个体中，通常会在 Rb 通路的其他组分中发现突变，从而产生相似的生物学效应。这表明，若某通路已因其他位置的突变而失活，则该通路中的突变体不会受到进一步的选择压力。

类似模式在其他类型癌症中亦有体现。例如，在对主要类型卵巢癌的大量样本调查中，发现 67% 的个体具有 Rb 通路突变， 45% 在 Ras/PI3 激酶通路中（定义比胶质母细胞瘤研究中的更狭义），以及超过 96% 在 p53 通路中。考虑到分析中未包含的其他通路成分，似乎这种癌症的大多数病例也都有突变破坏了相同的三种控制机制，导致细胞生长失调、细胞增殖失调以及对压力和 DNA 损伤的异常忽视。

图 20-29 导致肿瘤发生的三大主要细胞通路。此处列出的具体案例将在本章详述。由 Rb 控制的细胞周期事件详见第 17 章。

似乎这三种基本控制在几乎所有类型的癌症中都以某种方式被颠覆。然而，由于特化组织可能依赖不同的机制将环境信号传递至核心控制机制，这些控制在不同类型的癌症中可通过不同的方式被颠覆。事实上，在细胞发育和组织维持过程中进行通信的所有主要信号通路中（第15、21和22章讨论），几乎都能找到驱动突变的例子。

图 20-29 概括了刚刚描述的三种核心通路，将其简称为细胞周期、细胞增殖和细胞存活。我们先前已讨论过 Rb 蛋白（参见第 1182-1183 页），并用整个章节（第 17 章）专门阐述了细胞周期调控机制。接下来将回顾图 20-29 中另外两条调控通路的重要细节。

=== PI3 激酶/Akt/mTOR 通路的突变驱动癌细胞生长 ===
细胞增殖不仅仅是细胞周期的推进过程，还需要协调的细胞生长——这涉及复杂的合成代谢过程，通过该过程细胞能从小分子前体合成所有必需的大分子（图20-30）。因此，癌症的发生不仅依赖于细胞周期进程约束的缺失，还取决于细胞生长调控机制的紊乱。

RTK/Ras 激活的下游，PI3 激酶/Akt/mTOR 细胞内信号通路对细胞生长调控至关重要。如第 15 章所述，包括胰岛素和胰岛素样生长因子在内的多种细胞外信号蛋白通常激活此通路。然而，在癌细胞中，该通路因突变而被激活，使得细胞能在缺乏此类信号的情况下生长。如图 20-30B 所示，由此导致的 Akt 和 mTOR 蛋白激酶的异常激活不仅刺激蛋白质合成，还显著增加葡萄糖摄取以及细胞质中用于脂质合成的乙酰辅酶 A 的生成。

PI3K/Akt/mTOR 通路的异常激活通常出现在肿瘤进展早期，这有助于解释肿瘤细胞中观察到的糖酵解速率异常升高现象——即如前所述（见图 20-18）的瓦博格效应。根据我们之前的讨论可以预期，癌症可通过多种不同方式激活该通路。例如，生长因子受体可能发生异常激活，如图 20-23 所示。癌症中同样常见的是磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）磷酸酶的缺失，该酶正常情况下起抑制该通路的作用。PTEN 通过使磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸去磷酸化来抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路 \left[\mathrm{PI}(3,4,5)\mathrm{P}_3\right]

图 20-30 细胞增殖似乎需要两类信号。(A)为成功增殖，大多数正常细胞既需要驱动细胞周期进程的胞外信号（此处显示为蓝色有丝分裂原），也需要驱动细胞生长的胞外信号（此处显示为红色生长因子）。有丝分裂原如何通过 Rb 通路激活信号传导以驱动细胞进入周期，详见图 17-59。(B)展示通过激活 Akt 和 mTOR 驱动细胞生长的信号系统示意图，该系统极大刺激葡萄糖摄取与利用，包括将线粒体中糖代谢中间产物产生的过量柠檬酸转化为胞质脂质合成和新膜生成所需的乙酰辅酶 A。如图所示，蛋白质合成亦随之增强。该信号系统在肿瘤进展早期即异常激活。TCA 循环指三羧酸循环（柠檬酸循环）。

PI3 激酶生成的分子（见第 920 页）。PTEN 在肿瘤中常见突变。

=== p53 通路突变使癌细胞在应激和 DNA 损伤条件下仍能存活并增殖 ===
癌细胞必须打破控制细胞生长和分裂的正常规则，这一点显而易见：这正是癌症定义的一部分。但为何癌细胞在应对压力和 DNA 损伤时也表现异常，这一点却不那么明显，然而这几乎是一个普遍特征。位于这一反应核心的基因—— p53 基因，在所有癌症病例中约有 50% 发生突变，这一比例高于任何其他已知的关键癌症基因。当我们将与 p53 功能密切相关的其他基因一并考虑时，发现大多数癌症病例在 p53 通路中存在突变。为什么会这样？要回答这个问题，我们首先必须考虑这一通路的正常功能。

与 Rb 蛋白不同，在正常情况下，体内大多数细胞所含的 p53 蛋白非常少：尽管该蛋白会被合成，但会迅速降解。基因的两个拷贝均被删除或失活的小鼠，除了一个共同特征——普遍在 10 月龄前罹患癌症外，通常在所有方面都表现正常。这些观察结果表明，p53 的功能仅在特殊情况下才需要。事实上，细胞会在一系列条件下提高 p53 蛋白的浓度，这些条件只有一个明显的共同点：从细胞的角度来看，它们都是病理性的，使细胞面临死亡或严重损伤的风险。这些条件包括 DNA 损伤、

图 20-31 p53 肿瘤抑制因子的作用模式。p53 蛋白是一种细胞应激传感器。响应于过度增殖信号、DNA 损伤、缺氧、端粒缩短以及其他多种应激因素，细胞内的 p53 水平会上升。如图所示，这可能导致细胞周期停滞，使细胞得以调整并存活；也可能触发细胞通过凋亡自杀；或引起细胞衰老——一种不可逆的细胞周期停滞，阻止受损细胞分裂。

这使细胞面临基因组错误的风险；端粒丢失或缩短，同样危及基因组完整性；缺氧使细胞无法获得维持线粒体呼吸所需的氧气；渗透压应激导致细胞肿胀或萎缩；氧化应激则产生危险水平的高活性自由基。

能够激活 p53 通路的另一种应激形式似乎出现在调控信号过于强烈或不协调时——这种信号驱使细胞突破正常界限进入危险区域，导致其调控与协调机制崩溃，犹如超速运转的发动机。例如当 Myc 癌基因过度表达至致癌水平时，p53 浓度就会升高。

所有这些情况都要求采取极端行动，可能表现为两种形式之一：细胞可以阻止分裂周期的任何进一步进展，以便腾出时间修复或从病理状态中恢复；或者它可以接受自己必须死亡，并以最小化对机体损害的方式结束生命。从这个角度来看，理想的死亡方式是凋亡。在凋亡过程中，细胞被邻近细胞吞噬，其内含物被高效地回收利用。而不良的死亡方式则是坏死。在坏死过程中，细胞破裂或解体，其内含物泄漏到细胞外空间，引发炎症反应。

因此，p53 通路如同一种天线，能够感知多种危险状况的存在，并在检测到任何异常时触发相应行动——要么暂时或永久地阻止细胞周期，要么通过细胞凋亡促使细胞自杀（图 20-31）。这些反应旨在防止异常细胞增殖。癌细胞确实普遍存在异常，其存活和增殖因此依赖于 p53 通路的失活。若 p53 通路在癌细胞中保持活跃，它们将会被阻止或死亡（视频 20.6）。例如，如果 p53 通路功能正常，具有未修复 DNA 损伤的细胞将停止分裂或死亡；它无法增殖。

p53 蛋白主要通过作为转录调节因子发挥作用（参见影片 17.8）。事实上，在人类肿瘤中观察到的 p53 最常见突变位于其 DNA 结合域，这些突变削弱了 p53 与其 DNA 靶序列结合的能力。如第 17 章所述，p53 蛋白对细胞周期的抑制作用至少部分是通过诱导 p21 的转录实现的，该基因编码的蛋白质能够结合并抑制细胞周期进程所需的细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）复合物。通过阻断这些 Cdk 复合物的激酶活性，p21 蛋白阻止细胞进入 S 期并复制其 DNA。

p53 诱导细胞凋亡的机制包括刺激多种促凋亡基因的表达，如第 18 章所述。

=== 利用小鼠的研究有助于界定癌症关键基因的功能 ===
基因在癌症中作用的最终验证必须来自对完整成熟生物体的研究。实验研究中最受青睐的生物体是小鼠。为了探索候选癌基因或抑癌基因的功能

图 20-32 使用发光报告基因监测小鼠肿瘤生长与转移。通过基因工程技术改造小鼠，使其前列腺中 PTEN 抑癌基因的两个拷贝均能失活，同时在前列腺特异性激活一个经改造能产生萤火虫来源荧光素酶的基因。向小鼠血液注射荧光素（荧光素酶的底物分子）后，前列腺细胞会发光，可通过活体生物发光检测观察到，如左侧 67 天龄小鼠所示。缺乏 PTEN 磷酸酶的细胞含有升量的 Akt 激活剂𝑃。 1 ( 3 , 4 , 5 ) 𝑃 3 P1(3,4,5)P 3 ，这导致前列腺细胞异常增殖，并随时间推移逐渐形成癌症。通过这种方式，可以在同一动物体内追踪长达一年的转移过程。在这些实验中，光强度与前列腺细胞后代的数量成正比，从浅蓝逐渐增强至绿色、黄色，再到红色表示。（改编自 C.-P. Liao 等人，《癌症研究》67:7525-7533, 2007。经美国癌症研究协会许可使用。）

通过基因操作，可以培育出过度表达特定基因的转基因小鼠或缺失该基因的敲除小鼠。利用第八章所述技术，可以设计出仅在特定细胞群中错误表达或删除基因的小鼠，或者能够在选定时间点随意开启基因表达的小鼠，甚至两者兼备，以观察肿瘤是否及如何形成。此外，为实时追踪活体小鼠体内肿瘤的每日生长情况，可通过基因标记使目标细胞表达荧光或发光报告基因而变得可见（图20-32）。通过这些方法，人们能够逐步阐明每个癌症关键基因在癌症发生或进展过程中所起的作用。

例如，转基因小鼠研究证实，单一癌基因通常不足以使正常细胞转变为癌细胞。因此，在经基因改造表达 Myc 或 Ras 致癌转基因的小鼠中，部分表达该癌基因的组织可能出现细胞增殖增强现象，随着时间的推移，偶有细胞会经历进一步变化而发展成癌症。然而，大多数表达癌基因的细胞并不会形成癌症。但从整体动物角度来看，这种遗传性癌基因构成严重威胁，因为它极大提高了机体某处发生癌症的风险。同时表达 Myc 和 Ras 两种癌基因的小鼠，其癌症发生时间更早、发病率远高于仅表达单一基因的小鼠（图 20-33）；但需注意的是，这些癌症仍以分散、孤立的肿瘤形式起源于非癌组织之中。

图 20-33 转基因小鼠中的癌基因协同作用。图表展示了三种转基因小鼠品系的肿瘤发生率，分别为携带 Myc 癌基因、携带 Ras 癌基因以及同时携带两种癌基因的小鼠。在这些实验中，首先培育了两个转基因小鼠品系：一个品系通过将原癌基因 Myc 与小鼠乳腺肿瘤病毒调控 DNA 融合（从而在乳腺组织中驱动 Myc 过表达），插入了该构建的癌基因拷贝；另一个品系则在相同调控元件控制下插入了 Ras 癌基因拷贝。两个品系小鼠的肿瘤发生率均显著高于正常水平，且多发生于乳腺或唾液腺。通过杂交这两个品系获得同时携带两种癌基因的小鼠，这些杂交后代肿瘤发生率进一步提高，远超过两种癌基因单独作用时的发生率之和。然而，肿瘤仅延迟发生，且仅出现在两种基因表达组织中少数细胞中。除了这两种癌基因外，显然还需要进一步的偶然变化才能导致癌症的发展（引自 E. Sinn 等人，《细胞》49:465-475, 1987 年）。

因此，即使是表达这两种癌基因的细胞也必须经历进一步随机产生的变化才能癌变。这强烈表明肿瘤发生需要多重突变，正如之前讨论的大量其他证据所支持的那样。使用抑癌基因缺失小鼠进行的实验也得出了类似结论。

=== 癌症在进展过程中变得越来越具有异质性 ===
尽管研究癌症驱动基因在体内的功能与相互作用十分有用，但人类癌症的小鼠模型存在重要局限性。小鼠肿瘤体积小，形成周期仅需数月甚至数日，而人类肿瘤可能达到小鼠体型或更大，且通常已生长数十年。通过观察染色组织切片的简单组织学分析可见，某些肿瘤包含明显不同的区域——虽均属癌变组织，但因遗传或表观遗传差异呈现不同形态：癌细胞群体具有异质性。显然，在最初的癌细胞克隆中，产生了赋予选择性优势（如加速生长）的额外突变，从而形成多样化亚克隆。如今，癌症基因组分析能力使我们能更深入探究这一过程。通过比较肿瘤不同区域及其转移灶的样本，揭示出达尔文进化的经典图景——这一过程虽以月或年而非百万年为时间尺度，却遵循着同样的自然选择法则。

研究肿瘤异质性发展的一种方法利用了在体外培养的人类细胞，即“类器官”（详见第 22 章）。与先前描述的适应了人工二维生活方式的永生化癌细胞系不同（见图 20-15），类器官是在更接近生理条件的三维基质中由成体干细胞培养而成。在这种环境中，单个干细胞能够增殖并分化成自组织结构，模拟来源器官的简化微型版本，具有真实的微观解剖特征。一项研究应用这种类器官系统来考察结直肠癌个体肿瘤内的遗传异质性（图 20-34A）。研究人员从肿瘤不同区域及邻近正常组织中分离出单个细胞培养类器官。基因组分析揭示了每个类器官的详细突变模式，这些模式指示了它们之间的亲缘关系，并据此可绘制出家族树。源自同一肿瘤部位的类器官相似度最高，且均携带相同的致癌突变簇——这些突变源于进化树主干上的共同祖细胞，对应着肿瘤生长的早期阶段。

显然，癌细胞在不断突变、增殖、竞争、进化并多样化的过程中，不断开拓新的生态位并应对治疗手段（图 20-34B）。当它们转移并殖民新领域时，多样化进程会加速，因为这些新环境带来了新的选择压力。进化过程持续越久，就越难用同一张网捕获并消灭所有癌细胞。

=== 结直肠癌通过一系列可见变化的缓慢演进 ===
在本章开头，我们了解到大多数癌症都是由单个异常细胞逐渐发展而来，通过一系列独立的遗传和表观遗传变化的积累，从良性肿瘤进展为恶性肿瘤。我们已经从分子层面讨论了其中一些变化的本质，并了解了它们如何促成癌变行为。现在我们将更深入地研究一种常见的人类癌症，以此为例阐释并拓展我们已介绍的一些普遍原理和分子机制。我们以结直肠癌作为研究范例。

图 20-34 癌症如何以一系列亚克隆形式进展。（A）利用类器官进行癌症分析。从人类结直肠肿瘤的四个不同区域（颜色编码）以及附近健康组织（未显示）中分离出单个细胞，随后利用这些细胞培育类器官，从而获得大量分析材料。通过 DNA 测序确定每个类器官的突变情况，这些数据进而构建出系统发育树，揭示了原始肿瘤中突变发生的顺序。（B）描绘了驱动突变如何被认为在长时间内导致癌症进展，最终形成足够大的增殖细胞克隆而被检测为肿瘤。数据显示，驱动突变仅在长期存在的细胞亚克隆背景下罕见发生，这些亚克隆持续积累乘客突变却未获得生长优势。（A，改编自 C.J. Kuo 和 C. Curtis，《自然》556:441-442, 2016，经 Springer Nature 许可使用；B，改编自 S. Nik-zainal 等人，《细胞》149:994-1007, 2012。）本文依据知识共享署名许可协议条款发布。

结直肠癌起源于结肠（大肠）和直肠（肠道末端）的上皮组织。该组织的结构与第22章（第1281-1282页）讨论的小肠组织大体相似。无论是小肠还是大肠，其上皮组织都以极快的速度更新，约需一周时间即可基本完成整个上皮层的更替。这两个区域的组织更新都依赖于位于上皮深层凹陷处（称为肠隐窝）的干细胞。如第22章所述，目前对维持干细胞功能、调控上皮正常结构与更替的信号机制已有了较为深入的认识。大多数结直肠癌的肿瘤进展过程，正是始于破坏这些信号通路的基因突变（参见影片20.7）。

结直肠癌较为常见，目前在美国每年导致近 6 万人死亡，约占癌症总死亡人数的 10% 。与大多数癌症类似，这类癌症通常直到晚年才被确诊（90%发生在 55 岁之后）。然而，通过结肠镜（一种用于观察结肠和直肠内部的光纤设备）对正常成年人进行常规检查时，常会发现肠道上皮存在小型良性肿瘤或腺瘤，表现为称为息肉的组织突起。这些腺瘤性息肉被认为是
{| class="wikitable"
| colspan="4" |表20-1 结直肠癌细胞中检测到的部分遗传异常
|-
|基因
|类别
|受影响通路
|人类结肠癌（%）
|-
|K-Ras 基因
|癌基因
|受体酪氨酸激酶信号传导
|40
|-
|β-连环蛋白¹
|癌基因
|Wnt 信号通路
|5–10
|-
|腺瘤性结肠息肉病基因¹
|肿瘤抑制因子
|Wnt 信号通路
|>80%
|-
|p53
|肿瘤抑制因子
|应激反应与 DNA 损伤应答
|60
|-
|TGFβ受体 II²
|肿瘤抑制因子
|TGFβ信号传导
|10
|-
|Smad4²
|肿瘤抑制因子
|TGFβ信号通路
|30
|-
|MLH1 及其他 DNA 错配修复基因（常因 DNA 甲基化而沉默）
|肿瘤抑制因子（维持遗传稳定性）
|DNA 错配修复
|15
|}
1.2 带有相同上标数字的基因作用于同一通路，因此在个体癌症中仅有一个组分发生突变。

这些是大肠癌中大部分癌症的前体。由于疾病进展通常非常缓慢，通常存在约10年的时间窗口，在此期间缓慢生长的肿瘤可被检测到但尚未恶变。因此，当人们在五十多岁时接受结肠镜检查并通过结肠镜（一种快速简便的操作）切除息肉后，结直肠癌的发病率会大幅降低：根据某些研究，其发病率不到未筛查情况下的四分之一。

在直径小于1厘米的息肉显微切片中，上皮细胞及其排列通常呈现近乎正常状态。息肉越大，越可能包含形态异常且排列紊乱的细胞。有时单个息肉内可区分出两个或多个明显区域，其中某个区域的细胞相对正常，而其他区域的细胞则明显癌变，仿佛是由腺瘤细胞原始克隆中突变产生的亚克隆。疾病后期阶段，少数息肉中的部分肿瘤细胞会获得侵袭性：首先突破上皮基底层，继而穿透包裹肠道的肌层，最终通过淋巴管转移至淋巴结，或经血管转移至肝、肺及其他器官。

=== 少数关键基因损伤常见于大部分结直肠癌病例 ===
哪些突变随时间积累导致这一系列事件发生？在目前已发现的与结直肠癌相关的基因中，有三个突变频率最高：原癌基因 K （Ras 基因家族成员），约占 40% 的病例； p53 ，约占 60% 的病例；以及抑癌基因 Apc （下文将讨论），超过 80% 的病例。其他基因在较少结肠癌病例中起作用，部分列于表 20-1。

Apc 的作用最初是通过研究某些家族发现的，这些家族表现出一种罕见的遗传性结直肠癌易感性，称为家族性腺瘤性息肉病（FAP）。在此综合征中，数百至数千个息肉沿结肠生长（图 20-35）。这些息肉最初

图 20-35 家族性腺瘤性息肉病患者结肠与正常结肠对比。（A）正常结肠壁呈平缓起伏但表面光滑。（B）息肉病结肠完全被数百个突出息肉覆盖，肉眼观察每个息肉形似微型花椰菜。（由 Mark Arends 提供。）

通常在成年早期出现，若不予以切除，几乎总有一个或多个会发展为恶性肿瘤；从首次发现息肉到确诊癌症的平均时间为 12 年。该病可追溯至抑癌基因 Apc （以该综合征命名）的缺失或失活。患有家族性腺瘤性息肉病（FAP）的个体，其所有细胞中的一个 Apc 基因拷贝均存在失活性突变或缺失，且在肿瘤中表现出杂合性丢失，这意味着即使是在良性息肉中，两个基因拷贝也已丢失或失活。大多数结直肠癌患者并非遗传性疾病所致。然而，在超过 80% 的病例中，其癌细胞（而非正常细胞）通过个体生命周期中获得的突变，使 Apc 基因的两个拷贝均失活。因此，通过类似于我们讨论视网膜母细胞瘤时所涉及的途径， Apc 基因的突变被确认为结直肠癌的核心因素之一。

APC 蛋白是 Wnt 信号通路（第 15 章讨论）的一个抑制性组分。它与 \beta -连环蛋白（Wnt 通路的另一组分）结合，并协助诱导该蛋白降解。通过这种方式抑制 \beta -连环蛋白，APC 阻止其定位到细胞核——在核内它会作为转录调节因子驱动细胞增殖并维持干细胞状态（见图 15-61）。APC 的缺失导致游离 \beta -连环蛋白过量，进而引发干细胞群体的不受控扩增。这会造成肠道隐窝数量和尺寸的急剧增加（见图 22-4）。

当对一批结直肠肿瘤中的 \beta -连环蛋白基因进行测序时，发现许多不存在 Apc 突变的肿瘤反而存在 \beta -连环蛋白的激活突变。因此，Wnt 信号通路的过度活化才是引发此类癌症的关键，而非该通路包含的某个特定癌基因或抑癌基因。

既然如此，为何 Apc 基因尤其成为结直肠癌中最常见的罪魁祸首？APC 蛋白体积庞大，不仅与 \beta -连环蛋白相互作用，还与包括微管在内的多种其他细胞组分产生联系。APC 的缺失似乎会增加有丝分裂纺锤体缺陷的频率，导致细胞分裂时出现染色体异常。这种独立且额外的促癌效应或许能解释为何 Apc 突变在结直肠癌的成因中如此突出。

=== 部分结直肠癌存在 DNA 错配修复缺陷 ===
除了与 Apc 突变相关的遗传性疾病（FAP）外，还存在第二种更为常见的结肠癌遗传易感性，其发展过程与我们描述的 FAP 有所不同。这种更为常见的状况被称为遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC），或称林奇综合征，其结肠癌风险增加，但结直肠息肉（腺瘤）的数量并未增多。此外，这些癌细胞异常之处在于它们具有正常（或近乎正常）的核型。相比之下，非 HNPCC 个体中的大多数结直肠肿瘤具有明显的染色体异常，包括多重易位、缺失及其他畸变，且染色体数量远超正常水平（参见图 20-10）。

导致遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）患者易患结直肠癌的突变，发生在编码 DNA 错配修复系统核心组件的若干基因之一。这些基因在结构和功能上与细菌及酵母中的 MutL 和 MutS 基因同源（参见图 5-20）。由于仅有两个基因拷贝中的一个存在缺陷，修复系统仍能清除个体细胞中不可避免的 DNA 复制错误。然而，如前所述，这些个体面临风险，因为剩余正常基因拷贝的意外丢失或失活会立即使自发突变率提高百倍甚至更多（详见

第五章）。这些基因不稳定的细胞随后可加速经历突变和自然选择的标准进程，促使细胞克隆向恶性肿瘤发展。

这种特定类型的基因不稳定性会在染色体中产生不可见的变化——最显著的是单个核苷酸的改变以及单核苷酸和双核苷酸重复序列（如 AAAA...或 CACACA...）的短扩增和收缩。一旦识别出 HNPCC 个体的缺陷，便发现约 15% 的无遗传易感突变人群中发生的结直肠癌存在错配修复基因的表观遗传沉默或突变。

因此，许多结直肠癌中发现的基因不稳定性至少可通过两种方式获得。大多数癌症表现出一种导致染色体明显改变的形式，而其他癌症的不稳定性发生在更小的尺度上，反映了 DNA 错配修复的缺陷。事实上，许多癌变要么显示染色体不稳定性，要么存在错配修复缺陷——但很少两者兼具。这些发现清楚地表明，基因不稳定性并非恶性行为的偶然副产品，而是一个促成因素——且癌细胞可通过多种方式获得这种不稳定性。

=== 肿瘤进展的步骤常可与特定突变相关联 ===
这些已识别的结直肠癌关键基因—— K 、 p53 、 Apc 及其他基因——以何种顺序发生突变？它们各自对癌细胞非社会性行为有何贡献？答案并非唯一，因为结直肠癌可通过多种途径发生：例如在某些病例中，首发性突变可能位于 DNA 错配修复基因；而在其他病例中，则可能出现在调控细胞增殖的基因上。此外，如前所述，诸如遗传不稳定性或异常增殖倾向等普遍特征，可通过不同基因的突变以多种方式产生。

然而，某些突变组合在结直肠癌中尤为常见，并且按照特定顺序发生。因此，在大多数情况下，使 Apc 基因失活的突变似乎是最早或至少是非常早期的步骤，因为它们在小型良性息肉和大型恶性肿瘤中检测到的高频率相同。导致遗传和表观遗传不稳定的变化可能也在肿瘤进展早期出现，因为这些变化是驱动后续步骤所必需的。

在 K -Ras 基因中发生的激活突变出现较晚，因为它们在小型息肉中罕见，但在显示细胞分化和组织学模式紊乱的较大息肉中却很常见。

失活突变在 p53 中被认为出现得更晚，因为它们在息肉中罕见，但在癌中常见（图 20-36）。我们已经看到， p53 功能的丧失使癌细胞能够承受压力并避免凋亡和细胞周期停滞。此外， p53 的缺失与癌基因（如 Ras ）的高度激活有关。小鼠实验表明，初始低水平的癌基因

图20-36 结直肠癌发展过程中遗传变化的典型顺序建议。这个过于简化的示意图提供了突变与肿瘤发展关系的一般概念。但通常还涉及许多其他突变，并且不同的结肠癌可能通过不同的突变序列（和/或表观遗传变化）进展。

激活可能导致肿瘤缓慢生长，即使 p53 功能正常：毕竟像 Ras 这样的基因是正常生长调控机制的一部分，适度激活对细胞不会造成压力，也不会引发 p53 蛋白的作用。然而，肿瘤从缓慢生长进展为快速恶性增长，涉及癌基因激活超出正常生理限度达到更高、更具压力的水平。如果 p53 蛋白存在且功能正常，这应导致细胞周期停滞或死亡。只有失去 p53 功能，携带过度活跃癌基因的癌细胞才能存活并进展。

我们刚刚描述的步骤只是整体情况的一部分。需要强调的是，每种结直肠癌病例都有其独特性，具有各自详细的突变组合，即使是常见的突变，其发生顺序也可能各不相同。

=== 导致肿瘤细胞转移的变化在很大程度上仍是个谜 ===
或许我们对癌症理解中最显著的空白在于侵袭性和转移性（见图20-20）。在结直肠癌多步骤进展首次被描述超过25年后，尚未发现具有转移性疾病特征性相关的基因突变。迄今为止，即使是大规模的基因组测序工作也未能揭示足以解释癌细胞从原发肿瘤逃逸、扩散并在远处组织定植的重复性突变。一种可能性是，转移可能由改变基因表达模式的表观遗传变化启动。这些变化可能使癌细胞在没有进一步遗传改变的情况下获得新特性，从而重新编程其行为以促进侵袭性和运动性，或产生癌症干细胞。重要的是，细胞编程和行为的变化在细胞分化过程中的多种情境下通常是正常运作的。与转移最为相关的例子是上皮-间质转化（EMT），这是一个高度调控但尚未被充分理解的过程，它使上皮细胞失去其特有的极性和粘附性，转而呈现间质表型，包括增强的迁移行为。EMT 程序在胚胎发生的多个阶段以及伤口愈合过程中发挥作用，其在癌细胞中的激活可以解释它们如何从原发肿瘤逃逸并侵入新组织。然而，EMT 不太可能解释主要谜团：即播散细胞如何在新组织的微环境中获得生存能力，面对其中陌生的生长因子和细胞外基质成分组合。由于 EMT 程序（如同几乎所有细胞分化程序）涉及基因表达的变化，它不会改变 DNA 序列，因此通过测序转移癌细胞的基因组无法检测到这一过程。

对肿瘤发生多个阶段和多样特征的观察表明，癌细胞并非发明了新的生物学现象，而是在不恰当的时间和地点利用了现有的机制和通路。正如我们将在本章最后一节讨论的那样，更好地理解正常的底层细胞生物学，以及癌症中颠覆这些生物学过程的分子变化，将为癌症治疗提供有前景的研究方向。

=== 摘要 ===
癌细胞分子分析揭示了两类癌症关键基因：癌基因与抑癌基因。这些基因中的一部分会因遗传和表观遗传意外的共同作用而发生改变，从而驱动肿瘤进展。许多癌症关键基因编码社会调控通路的组成部分，这些通路调控细胞的生长、分裂、分化或死亡时机。此外，一类肿瘤抑制因子可归类为基因组维护基因，因其正常功能是协助维持基因组完整性。

p53 通路的失活——这种现象见于几乎所有人类癌症——使得基因受损的细胞能够逃避凋亡并持续增殖。

Rb 通路的失合同样常见于多数人类癌症，这彰显了每条通路在保护机体抵御癌症方面的重要性。更广泛而言，癌细胞基因组的大规模测序表明，癌症的发生需要获得三种正常调控——即细胞周期、细胞增殖和细胞存活通路——的可遗传性紊乱。

癌细胞基因组的测序表明，除儿童期癌症外，多数癌症在漫长的肿瘤进展过程中会积累多个驱动突变，以及数量更为庞大但无实质影响的乘客突变。相同研究方法揭示了随着肿瘤发展，细胞亚克隆如何产生与消亡。因此，肿瘤内部存在异质性细胞群，其中某些被称为癌症干细胞的亚群比其他细胞危险得多。

我们常能将肿瘤进展阶段与激活特定癌基因、失活特定抑癌基因的突变相关联，结肠癌便是典型例证。但不同癌症类型甚至同种癌症的不同个体中，突变表现组合与表观遗传变化各不相同，这反映了这些遗传变异产生的随机性。然而，相同变异模式的反复出现表明，突破人体抗癌防御体系的途径实则有限。不过，对于癌症最终也是最致命阶段——转移的分子机制，科学界仍知之甚少。

== 癌症防治：现状与未来 ==
我们可以运用日益增长的癌症分子生物学知识，在三个层面加强对该疾病的攻势：预防、诊断和治疗。预防总胜于治疗，事实上许多癌症是可以预防的，尤其是通过戒烟。高灵敏度分子检测技术为更早、更精确的诊断带来新机遇，旨在检测尚处于微小未转移阶段的原发肿瘤。如我们在结直肠息肉案例中所见，早期发现的癌症通常可以通过手术或放疗及时根除。然而，在未来许多年里，全面发展的恶性疾病仍将普遍存在，癌症治疗的需求将持续存在。

本节首先探讨癌症的可预防病因，继而分析分子层面的认知进展如何开始改变疾病治疗格局。

=== 流行病学揭示多数癌症病例可预防 ===
无论环境如何，某种不可降低的癌症基础发病率是预期之中的。正如第五章所讨论的，突变永远无法完全避免，因为它们是 DNA 复制和修复准确性存在根本性局限的必然结果。如果一个人能活得足够长，其体内至少有一个细胞最终会积累足够导致癌症发生的一系列突变，这是不可避免的。

然而，环境因素似乎在决定癌症风险中起着重要作用。这一点通过比较不同国家的癌症发病率得到了最清晰的证明：几乎每一种在某个国家常见的癌症，在另一个国家其发病率要低得多。由于移民群体往往会采纳其新居住国典型的癌症发病模式，这些差异被认为主要归因于环境因素而非遗传因素（图 20-37A）。根据美国癌症协会汇编的流行病学研究，估计至少有 45% 的癌症死亡可归因于可改变的风险因素，这表明超过一半的癌症本可避免（图 20-37B）。
{| class="wikitable"
|原因
|死亡（占总数的百分比）
|美国死亡人数（2018年）
|可能减少的估计（百分比）
|-
|所有风险因素
|45%
|265,150
|50%
|-
|香烟烟雾
|29%
|169,180
|75%
|-
|超重
|6.6%
|38,230
|50%
|-
|饮食
|4.9%
|28,630
|50%
|-
|酒精
|4.0%
|23,510
|50%
|-
|病毒
|2.7%
|16,100
|100%
|-
|缺乏运动
|2.2%
|12,800
|85%
|-
|紫外线辐射
|1.5%
|8,750
|50%
|}
图 20-37 癌症发病率与环境影响因素相关。（A）这张世界地图显示了特定人群从一个地区迁移至另一地区时，癌症发病率上升（红色箭头）或下降（蓝色箭头）的情况。此类观察结果表明环境因素（包括饮食）在决定癌症风险方面的重要性。（B）环境与生活方式对美国癌症影响的部分估计数据。表格显示了美国每年可归因于各因素的死亡人数，以及通过预防可能消除的死亡人数预估百分比。（B，数据来源：F. Islami 等，《CA 临床癌症杂志》68:31-54, 2018；以及 G.A. Colditz 等，《科学转化医学》4:127rv4, 2012。）

遗憾的是，不同类型的癌症具有不同的环境风险因素，一个群体即便避开了某种危险，通常也会面临另一种。然而，这并非不可避免。存在一些人类亚群，他们的生活方式显著降低了特定年龄段的总体癌症死亡率。在目前美国和欧洲的条件下，大约每五人中就有一人将死于癌症。但在犹他州严格遵守教规的摩门教徒中——他们远离酒精、咖啡、香烟、毒品和不安全性行为——其癌症发病率仅为同家族非实践成员或普通美国人的大约一半。

尽管对人类群体的此类观察表明癌症通常可以避免，但在大多数情况下——吸烟是一个显著例外——很难精确指出造成这些巨大群体差异的具体环境因素，或确定它们的作用机制。不过，目前已识别出几类重要的环境致癌风险因素（图 20-37B）。但还存在许多其他影响因素——包括环境中的化学物质、体内循环的激素，以及我们使组织遭受的刺激、感染和损伤——这些因素同样重要，并通过其他方式促使疾病发展。

=== 灵敏检测法可识别那些损害 DNA 的致癌物质 ===
许多截然不同的化学物质在被喂食给实验动物或反复涂抹于其皮肤上时具有致癌性。例如，一系列芳香烃及其衍生物，如芳香胺、亚硝胺以及像芥子气这样的烷化剂。尽管这些化学致癌物结构各异，但其中很大一部分至少有一个共同特性——它们会引发突变。在一个常见的致突变性测试（艾姆斯试验）中，将致癌物与从大鼠肝细胞制备的活化提取物混合（以模拟完整动物体内发生的生化过程）。然后将该混合物加入特殊设计的测试细菌培养物中，并测量细菌突变率。通过这种快速便捷的细菌检测方法判定为致突变的大多数化合物，在哺乳动物细胞测试中也会引起突变或染色体畸变。

图 20-38 部分已知致癌物。（A）致癌物活化过程。许多化学致癌物需经肝脏代谢转化激活后，才能通过与 DNA（标为橙色）反应引发突变。图示为黄曲霉毒素 B1，这是一种由霉菌（黄曲霉）产生的毒素，常见于潮湿热带条件下储存的谷物和花生中。黄曲霉毒素是热带地区肝癌的重要致病因素。（B）不同致癌物引发不同癌症类型。（B，数据来源：医学研究所，《癌症与环境：基因-环境相互作用》，华盛顿特区：国家学术出版社，2002 年。）

其中一些致癌物直接作用于 DNA。但通常来说，化学性质相对惰性的致癌物更具效力；这些化学物质只有在经过肝脏代谢过程（由一组称为细胞色素 P-450 氧化酶的细胞内酶催化）转化为更具反应性的分子后，才会产生破坏作用。这些酶通常有助于将摄入的毒素转化为无害且易于排泄的化合物。不幸的是，它们对某些化学物质的活性会产生高度致突变的产物。以此方式激活的致癌物包括苯并[a]芘（一种存在于煤焦油、烟草烟雾中的致癌多环芳烃）以及真菌毒素黄曲霉毒素 B1（图 20-38）。

=== 百分之五十的癌症可通过改变生活方式预防 ===
烟草烟雾是当今世界上最重要的致癌物质。尽管已识别出许多其他风险因素，但似乎没有任何一个因素导致的癌症死亡人数能与烟草烟雾相提并论。人们有时认为，癌症的主要环境原因源于高度工业化的生活方式——污染加剧、食品添加剂使用增加等等——但支持这一观点的证据甚少。这种想法可能部分源于对工业中使用的一些高致癌物质的识别，如2-萘胺和石棉。然而，除了吸烟导致的癌症增加外，过去半个世纪中，大多数常见人类癌症的年龄调整死亡率基本保持不变，甚至在某些情况下显著下降（图20-39）。

已知具有显著致癌性的因素大多并非现代社会所特有。根据某些检测方法，目前已知效力最强的致癌物是黄曲霉毒素 B1（见图 20-38）。这种由天然污染热带花生等食物的真菌产生的毒素，是非洲和亚洲肝癌的重要致病因素。

除烟草外，化学毒素和诱变剂作为癌症诱因的重要性低于人类行为相关因素。例如，当前美国近四分之三的成年人与三分之一的儿童及青少年存在超重或肥胖问题。体重超标、酒精摄入、不良饮食和缺乏运动这四项风险因素的叠加，现已导致女性癌症病例占比达到最高，在男性中仅次于吸烟。据估算，多达

图 20-39 美国 1930-2018 年经年龄调整的癌症死亡率。图中绘制了（A）女性和（B）男性经调整至美国人口年龄分布的选定死亡率数据。注意两性肺癌死亡率的急剧上升与吸烟模式相符，而胃癌死亡率的下降被认为与幽门螺杆菌感染率降低有关。近期其他癌症死亡率的下降可能归因于检测和治疗手段的进步。对数据进行年龄调整是必要的，以抵消人们平均寿命延长导致的癌症发病率必然上升的影响。（改编自美国癌症协会《2021 年癌症事实与数据》。亚特兰大：美国癌症协会有限公司。数据来源：1930-1959 年美国死亡率卷宗、1960-2016 年美国死亡率数据，国家卫生统计中心，疾病控制与预防中心。注：由于 1970 年前编码限制，子宫数据包含子宫颈和子宫体合并统计。经美国癌症协会许可使用。）

作为 50% 的所有癌症可以通过改变可识别的生活方式来避免（见图 20-37B）。

=== 病毒和其他感染在人类癌症中占有显著比例 ===
人类癌症虽不具传染性，但仍有相当一部分癌症直接或间接与病毒感染有关，较少情况下与细菌或寄生虫感染相关。这类感染约占全球癌症的 15% ，且在发展中国家更为常见。其相关证据部分来源于癌症患者体内的病毒检测，部分来自流行病学研究。例如，子宫颈癌与乳头瘤病毒感染相关，而在乙型肝炎病毒感染常见的地区（非洲和东南亚），肝癌极为普遍。全球已有 1.7 亿人感染的丙型肝炎病毒，其慢性感染也与肝癌发生明确相关。

如表 20-2 所示，主要元凶是 DNA 病毒。DNA 肿瘤病毒通过最直接的途径——干扰细胞周期和凋亡的控制——引发癌症。要理解这类病毒致癌机制，有必要回顾病毒的生命历程。许多 DNA 病毒利用宿主细胞的 DNA 复制机制来复制自身基因组。然而，为在单个宿主细胞内产生大量传染性病毒颗粒，DNA 病毒必须劫持这套机制并强力驱动它，突破 DNA 复制的正常限制，这个过程通常会导致宿主细胞死亡。多数 DNA 病毒仅以此方式繁殖。但部分病毒还有第二种选择：它们可以让基因组作为安静守序的"乘客"在宿主细胞内传播，在常规细胞分裂周期中与宿主细胞 DNA 同步复制（或整合进宿主基因组，或以染色体外质粒形式存在）。这些病毒会根据情况在两种生存模式间切换，长期保持潜伏且无害状态，但偶尔会在某些细胞中大量增殖，这一过程会杀死宿主细胞并产生大量传染性颗粒。

这两种情况都不会使宿主细胞转变为癌性特征，这样做也不符合病毒的利益。但对于具有潜伏期的病毒，可能会发生意外，过早激活某些病毒蛋白，这些蛋白
{| class="wikitable"
| colspan="3" |表20-2 与人类癌症相关的病毒
|-
|病毒
|相关癌症
|高发区域
|-
| colspan="3" |DNA 病毒
|-
| colspan="3" |乳头瘤病毒科
|-
|乳头瘤病毒（多种不同毒株）
|疣（良性）
|全球范围
|-
|乳头瘤病毒（多种不同毒株）
|子宫颈癌
|全球范围内
|-
| colspan="3" |嗜肝 DNA 病毒科
|-
|乙型肝炎病毒
|肝癌（肝细胞癌）
|东南亚、热带非洲
|-
| colspan="3" |疱疹病毒科
|-
|爱泼斯坦-巴尔病毒
|伯基特淋巴瘤（B 淋巴细胞癌）
|西非、巴布亚新几内亚
|-
|爱泼斯坦-巴尔病毒
|鼻咽癌
|中国南方，格陵兰岛
|-
|人类疱疹病毒8型
|卡波西肉瘤
|非洲中南部
|-
| colspan="3" |RNA 病毒
|-
| colspan="3" |逆转录病毒科
|-
|人类 T 细胞白血病病毒 I 型（HTLV-1）
|成人 T 细胞白血病/淋巴瘤
|日本，西印度群岛
|-
|人类免疫缺陷病毒（HIV，艾滋病病毒）
|卡波西肉瘤（通过人类疱疹病毒8型传播）
|中非和南非
|-
| colspan="3" |黄病毒科
|-
|丙型肝炎病毒
|肝癌（肝细胞癌）
|全球范围
|-
| colspan="3" |对于所有这些病毒，感染人数远多于发展为癌症的人数：病毒必须与其他因素共同作用。正如文中所述，不同病毒以不同方式促进癌症的发生。
|}
病毒通常会利用其复制阶段使病毒 DNA 独立于细胞周期进行复制。如下文所述的人乳头瘤病毒案例，这类意外事件可能激活宿主细胞自身的持续增殖，从而导致癌症。

=== 通过接种人乳头瘤病毒疫苗可以预防子宫颈癌。 ===
乳头瘤病毒是 DNA 肿瘤病毒的典型代表。它们导致人类疣的形成，并且作为子宫颈癌的病因尤为重要：这是全球范围内女性第二常见的癌症，约占所有人类癌症的 6% 。人类乳头瘤病毒（HPVs）感染宫颈上皮细胞，并在基底细胞层以染色体外质粒的形式保持潜伏状态，与染色体同步复制。在外层上皮组织中，随着这些细胞的后代开始分化并最终从表面脱落，病毒通过切换到复制阶段产生感染性病毒颗粒。正常情况下，此处细胞分裂应停止，但病毒干扰了这种细胞周期停滞，因此

图 20-40 某些乳头瘤病毒如何引发子宫颈癌的机制示意图。乳头瘤病毒拥有约 8000 个核苷酸对的双链环状 DNA 染色体。这些染色体通常以质粒形式（红色圆圈）稳定存在于上皮基底层细胞中，其复制受到调控以与宿主染色体保持同步。（A）正常情况下，只有当病毒在外层上皮组织中按程序产生感染性子代时，才会干扰宿主细胞周期，这一过程相对无害。（B）罕见意外可能导致此类质粒片段整合到宿主染色体中，从而改变病毒基因在上皮基底层细胞中的微环境。这会破坏病毒基因表达的正常调控。某些病毒蛋白（命名为 E6 和 E7）的失控产生会干扰基底层细胞的细胞分裂调控，进而促使癌症发生（下图所示）。

以便复制其自身的基因组。通常，这种影响仅限于细胞外层且相对无害，如疣。然而，偶尔遗传意外会导致编码阻止细胞周期停滞蛋白质的病毒基因整合到宿主染色体中，并在上皮干细胞所在的基底层活跃（见图22-6）。这可能导致癌症，病毒基因充当癌基因（图20-40）。

从初始感染到侵袭性癌症的整个过程进展缓慢，需要多年时间。它包括一个漫长的中间阶段，此时受影响的宫颈上皮区域明显紊乱，但细胞尚未开始侵入下方的结缔组织——这种现象称为上皮内瘤变。许多此类病变会自行消退。此外，在此阶段，通过破坏或手术切除异常组织仍易于治愈该病症。幸运的是，通过刮取宫颈表面细胞样本并在显微镜下观察（巴氏涂片技术）可以检测到此类病变的存在。

更令人欣喜的是，现已研发出一种能够有效预防相关人乳头瘤病毒株感染的疫苗。若在女孩青春期前、即尚未开始性行为时接种，该疫苗已被证实能显著降低其罹患宫颈癌的风险。鉴于该病毒通过性接触传播，目前建议对青少年男女进行常规接种。多个国家已启动大规模免疫计划。

=== 传染性病原体可通过多种途径诱发癌症 ===
在乳头瘤病毒中，主要起致病作用的病毒基因被称为 E6 和 E7。这些病毒癌基因的蛋白质产物与多种宿主细胞蛋白相互作用，但特别值得注意的是，它们会结合宿主细胞的两个关键肿瘤抑制蛋白，使两者失去功能，从而允许细胞以不受控制的方式复制其 DNA 并进行分裂。其中一种宿主蛋白是 Rb；另一种是 p53。其他 DNA 肿瘤病毒采用类似机制抑制 Rb 和 p53，这突显了改变细胞周期控制通路和细胞存活通路对于细胞逃脱正常增殖限制的核心重要性，正如我们先前讨论的那样。

在其他癌症中，病毒具有间接促癌作用。例如，乙型和丙型肝炎病毒通过引发慢性炎症（肝炎）促进肝癌发展，这种炎症刺激肝脏大量细胞分裂，最终促使肿瘤细胞演化。在艾滋病中，人类免疫缺陷病毒（HIV）通过破坏免疫系统，导致原本罕见的卡波西肉瘤发生——这使得具有直接致癌作用的人类疱疹病毒（HHV-8）得以继发感染。寄生虫和细菌引起的慢性感染同样可通过引发严重炎症促进某些癌症发展。例如，导致胃溃疡的幽门螺杆菌慢性感染被认为是胃癌的主要诱因；过去半个世纪胃癌发病率的显著下降（见图 20-39）与幽门螺杆菌感染率降低呈现相关性。

A) 良性增生或疣

=== 寻找癌症治愈方法虽艰难但并非无望 ===
寻找癌症疗法虽艰难却非无望。治愈癌症的难度堪比清除杂草，癌细胞可通过手术切除或用有毒化学物质或辐射摧毁，但难以彻底根除每一个癌细胞。手术很少能找出所有转移灶，而杀死癌细胞的治疗方法通常对正常细胞也有毒性。此外，与正常细胞不同，癌细胞能快速突变，常会对所用毒剂和辐射产生耐药性。

尽管存在这些困难，针对某些曾经高度致命的癌症——包括霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、绒毛膜癌以及某些白血病和其他儿童癌症——已经找到了使用抗癌药物（单独或联合其他疗法）的有效治愈方法。即使对于目前似乎无法治愈的癌症类型，也有延长生命或至少缓解痛苦的疗法。但对于那些仍造成巨大痛苦和众多死亡的最常见癌症，我们有多大希望能做得更好并找到治愈方法呢？

=== 传统疗法利用癌细胞中的遗传不稳定性及细胞周期检查点应答缺失 ===
抗癌疗法需要利用癌细胞区别于正常细胞的某些分子特性。其中一种特性是基因不稳定性，这反映了染色体维持、细胞周期检查点和/或 DNA 修复方面的缺陷。值得注意的是，尽管最初开发这些治疗方法的科学家并不知晓，但最广泛应用的癌症疗法似乎正是通过利用这些异常来发挥作用。电离辐射和大多数抗癌药物会损伤 DNA 或干扰有丝分裂中的染色体分离，它们优先杀死癌细胞，因为癌细胞存活于损伤的能力较弱。例如，经辐射处理的正常细胞会暂停其细胞周期，直到修复 DNA 损伤，这得益于第 17 章讨论的细胞周期检查点反应。由于癌细胞通常存在检查点反应缺陷，它们在辐射后可能继续分裂，结果几天后因基因损伤未修复而死亡。更普遍地说，大多数癌细胞在生理上紊乱到了应激程度：它们生活在危险之中。尽管肿瘤细胞已经进化到对轻微的 DNA 损伤异常耐受，但它们对辐射和 DNA 损伤药物可能造成的更严重损伤却极为敏感。遗传损伤的微小增加足以打破增殖与死亡之间的平衡。然而不幸的是，DNA 损伤疗法通常会对消化系统、骨髓和黏膜中正常且快速分裂的细胞造成严重的副作用。此外，这些治疗方法本身具有致癌性，可能导致继发性癌症。

此外，虽然癌细胞中存在的分子异常通常增强了它们对细胞毒性药物的敏感性，但也可能增加其耐药性。例如，正常细胞在 DNA 损伤时可能通过 p53 介导的应激反应发生凋亡，而癌细胞由于缺乏 p53 可能逃避免疫性死亡。不同癌症对细胞毒性治疗的敏感性差异很大，有些对某种药物有反应，有些则对另一种药物有反应，这可能反映了特定癌症在 DNA 修复过程、细胞周期检查点及凋亡控制方面存在的特定缺陷类型。

=== 新药通过靶向特定突变选择性杀死癌细胞 ===
放疗和传统细胞毒性药物的选择性较弱：它们不仅伤害癌细胞，也会损伤正常细胞，且安全边际狭窄。由于剂量往往无法提高到足以杀死所有癌细胞的程度，

这将导致患者死亡，而可实现的治愈性治疗通常需要多种细胞毒性药物的联合使用。副作用可能严重且难以忍受。我们如何才能做得更好？

理想的治疗方法是与癌细胞中存在的某种病变结合时具有细胞致死性，但对不存在这种病变的细胞无害。这种治疗方法被称为合成致死（源自合成一词的本意，即“组合在一起”）：它仅在与癌症特异性突变合作时才会杀死细胞。随着我们越来越能够精确定位癌细胞中使其与正常邻近细胞不同的特定分子改变，这类精准靶向治疗的新机遇正逐渐显现。我们以一些已投入实践的新治疗方法为例结束本章。

=== PARP 抑制剂可杀死携带 Brca1 或 Brca2 基因缺陷的癌细胞 ===
正如我们所强调的，癌细胞的基因不稳定性使其既危险又脆弱——危险在于它们进化与增殖的能力增强，脆弱则是因为治疗若引发更极端的基因紊乱，便可能将其推过生存临界点导致死亡。在某些癌症中，基因不稳定性源于正常细胞依赖的众多 DNA 修复与维护机制中某一环节的明确缺陷。此时，针对性地阻断 DNA 修复机制中互补环节的药物，可造成如此严重的基因损伤，以致癌细胞死亡。

第五章中讨论的 DNA 维护机制详细研究揭示出惊人的表面冗余性。因此，敲除特定 DNA 修复途径通常比预期造成的损害要小，因为存在替代修复途径。例如，当复制叉遇到模板链上的单链断裂时，可能会形成停滞的 DNA 复制叉，但细胞可以通过直接修复这些单链断裂来避免灾难性后果；若此方法失效，还可通过同源重组修复断裂的复制叉（见图 5-49）。假设某种癌细胞因获得突变而导致遗传不稳定，该突变降低了其通过同源重组修复断裂复制叉的能力。那么，是否可以通过使用抑制单链断裂修复的药物来治疗这种癌症，从而大幅增加断裂复制叉的数量，最终根除癌细胞？这种药物治疗对正常细胞可能相对无害，但对癌细胞可能是致命的。

该策略似乎能有效杀死至少一类癌细胞——那些 Brca1 或 Brca2 抑癌基因的两个拷贝均失活的癌细胞。如第五章所述，Brca2 是一种辅助蛋白，在通过同源重组修复 DNA 双链断裂过程中与 Rad51 蛋白（人类中的 RecA 类似物）相互作用。Brca1 是这一修复过程中同样必需的另一种蛋白。与 Rb 类似，Brca1 和 Brca2 基因最初是作为使人类易患癌症的突变被发现的——具体而言，主要是乳腺癌和卵巢癌（尽管与 Rb 不同，它们似乎只与这类癌症中的一小部分有关）。遗传了一个 Brca1 或 Brca2 突变拷贝的个体会发展出使同一基因第二个拷贝失活的肿瘤，这可能是因为这种变化使细胞遗传不稳定并加速肿瘤进展。

虽然 Brca1 和 Brca2 是修复 DNA 双链断裂所必需的，但单链断裂则由其他机制修复，涉及一种名为 PARP（聚 ADP-核糖聚合酶）的酶。对 DNA 修复基本机制的这项理解带来了一个惊人发现：阻断 PARP 活性的药物能以极高的选择性杀死 Brca 缺陷细胞。与此同时，PARP 抑制对正常细胞影响甚微；事实上，经基因改造缺乏 PARP1（参与 DNA 修复的主要 PARP 家族成员）的小鼠在实验室条件下仍保持健康。这一结果表明，

图 20-41 如何利用肿瘤的遗传不稳定性进行癌症治疗。如第五章所述，DNA 序列的维持对生命至关重要，因此细胞进化出了多种修复 DNA 损伤和减少 DNA 复制错误的途径。如图所示，当 DNA 复制叉遇到 DNA 模板链断裂时会停滞。在此例中，正常细胞拥有两种不同的修复途径（途径 1 和途径 2）来帮助避免这一问题。因此，它们不会因使用阻断修复途径 1 的药物而受损。但由于肿瘤细胞在进化过程中选择了修复途径 2 的失活，同样的药物治疗却能杀死肿瘤细胞。

在本例所依据的实际案例中，修复途径 1（需要文中讨论的 PARP 蛋白）的功能是在移动的复制叉遇到之前，清除 DNA 单链上持续存在的意外断裂。途径 2 是依赖于重组的修复过程（需要 Brca2 和 Brca1 蛋白），用于修复图 5-49 中所示的停滞复制叉。PARP 抑制剂常用于治疗具有 Brca2 或 Brca1 抑癌基因缺陷的癌症。

虽然需要 PARP 的修复途径提供了对抗 DNA 链持续断裂的第一道防线，但这些断裂在正常细胞中可通过遗传重组途径高效修复。相比之下，因 Brca1 或 Brca2 缺失而获得遗传不稳定性的肿瘤细胞则失去了这第二道防线，因此它们对 PARP 抑制剂具有独特的敏感性（图 20-41）。

PARP 抑制剂已取得一些显著成果，使许多 Brca 基因缺陷患者的肿瘤消退，并延缓了疾病进展，且副作用相对较少。这些药物似乎也适用于其他导致细胞同源重组机制缺陷的突变癌症——这在癌症病例中虽占比不大，但具有重要意义。

PARP 抑制疗法体现了癌症治疗中理性且高度靶向的新型策略，这类方法正逐渐成为可能。结合下文将讨论的其他新疗法，它为治疗多种其他癌症带来了巨大希望。

=== 小分子药物可被设计用于抑制特定致癌蛋白 ===
治疗癌症的一个明显策略是使用专门设计用于阻断癌基因产生蛋白质功能的药物来攻击表达该癌基因的肿瘤。但这样的治疗如何避免伤害那些依赖于癌基因进化前原癌基因功能的正常细胞？又为何药物会杀死癌细胞而非仅仅使其镇静？答案或许在于癌基因依赖现象。一旦癌细胞经历了致癌突变，往往会进一步发生突变、表观遗传改变或生理适应，使其依赖于初始癌基因的过度活跃，正如吸毒者对高剂量毒品的依赖。阻断致癌蛋白的活性可能因此杀死癌细胞，而不会对其正常邻居造成显著伤害。通过这种方式已取得了一些显著成功。

如前所述，慢性髓系白血病（CML）通常与特定的染色体易位相关，表现为费城染色体（见图 20-5）。这种现象源于两条特定基因 Abl 和 Bcr 所在位置的染色体断裂与重接。这两个基因的融合形成了一个名为 Bcr-Abl 的杂合基因，该基因编码一种嵌合蛋白，由 Bcr 的 N 端片段与 Abl 的 C 端部分连接而成（图 20-42）。Abl 是一种参与细胞信号传导的酪氨酸激酶。Bcr 片段替代 Abl 正常 N 端后使其过度活跃，从而刺激含有该基因的造血前体细胞异常增殖，并阻止这些细胞通过凋亡死亡——而正常情况下许多细胞会经历这一过程。最终，过量白细胞在血液中积聚，导致慢性髓系白血病的发生。

嵌合 Bcr-Abl 蛋白是治疗干预的明确靶点。在寻找能够抑制酪氨酸激酶活性的合成药物分子过程中，科学家发现了一种名为伊马替尼（商品名格列卫）的化合物，可有效阻断 BcrAbl 活性（图 20-43）。当该药物首次用于慢性粒细胞白血病患者时，几乎

图 20-42 慢性粒细胞白血病患者体内 Abl 原癌基因向癌基因的转化过程。该染色体易位将 22 号染色体上的 Bcr 基因与 9 号染色体的 Abl 基因连接，从而形成费城染色体（参见图 20-5）。由此产生的融合蛋白包含 Bcr 蛋白的 N 端与 Abl 酪氨酸蛋白激酶的 C 端结合，导致 Abl 激酶结构域异常激活，进而驱动骨髓中造血细胞克隆的过度增殖。

图 20-43 伊马替尼（格列卫）如何阻断 Bcr-Abl 蛋白活性并抑制慢性粒细胞白血病。(A) 伊马替尼位于 Bcr-Abl 酪氨酸激酶结构域的 ATP 结合口袋中，从而阻止 Bcr-Abl 将 ATP 中的磷酸基团转移至底物蛋白的酪氨酸残基上。这阻断了细胞增殖和存活的信号传导。(B) 通过 X 射线晶体学测定的伊马替尼（蓝色实体）与 Abl 蛋白酪氨酸激酶结构域（带状图）复合物的结构。(C) 该药物的化学结构。可口服给药；存在副作用，但通常耐受性良好。(B, 来自 T. Schindler 等人，《科学》289:1938-1942, 2000。经 AAAS 许可使用。PDB 代码：3K5V)

所有患者均显示出显著反应，费城染色体阳性细胞在超过 80% 的患者中明显消失。这种反应似乎相对持久：经过多年持续治疗，许多患者并未进展至疾病晚期——尽管在治疗初期，每年出现伊马替尼耐药性癌症的概率约为 5% 。

对于已经进展到更急性阶段，即进入所谓“母细胞危象”的髓性白血病患者来说，治疗效果并不理想。在这个阶段，基因不稳定性已经形成，疾病进展速度显著加快。这些患者最初会显现治疗反应，但随后会复发，因为癌细胞对伊马替尼产生了耐药性。这种耐药性通常与 Bcr-Abl 基因中编码激酶结构域的部分发生二次突变有关，这些突变破坏了伊马替尼与 Bcr-Abl 激酶结合的能力。目前已经开发出第二代抑制剂，能有效对抗一系列伊马替尼耐药突变体。通过将一种或多种这类新型抑制剂与伊马替尼作为初始治疗联合使用，慢性髓性白血病——至少在慢性（早期）阶段——似乎正朝着可治愈疾病的方向迈进。

尽管存在耐药性的复杂性，伊马替尼的非凡成功足以阐明一个重要原则：一旦我们精确理解了癌症中发生的基因病变，就能开始设计有效的理性治疗方法来应对。这一成功案例推动了针对其他致癌蛋白激酶的小分子抑制剂的研发，并利用它们精准攻击相应的癌细胞。越来越多的此类药物正在开发中，其中包括靶向 EGF 受体的分子——目前已被批准

图 20-44 Ras-MAP 激酶信号通路中的部分抗癌药物及靶点。该通路由多种受体酪氨酸激酶（RTKs）激活，包括 EGF 受体（参见图 15-48 和 15-50）。Raf 激酶抑制剂包含多种特异性靶向致癌蛋白 B-Raf 的药物。按照惯例，抗体类药物以"单抗"（mab）结尾，而小分子药物以"尼布"（nib）结尾。（改编自 R. Vogelstein 等人，《科学》339 卷 1546-1558 页，2013 年）

用于治疗某些肺癌，以及专门针对黑色素瘤中 B-Raf 致癌蛋白的药物。

蛋白激酶相对容易被小分子（如伊马替尼）抑制，许多制药公司正在生产多种激酶抑制剂，希望它们能有效治疗某些类型的癌症。许多癌症并不存在蛋白激酶的致癌突变。但大多数肿瘤含有异常激活的信号通路，有望在该通路的某个环节找到靶点（参见视频20.8）。例如，图20-44展示了当前正在测试的针对癌症中常见激活通路的某些抗癌药物及药物靶点。

=== 通过增强免疫反应可能治愈多种癌症 ===
癌症与免疫系统存在复杂互动，其各组分有时可能助长也可能抑制肿瘤发展。但一个多世纪以来，癌症研究者一直梦想能以可控且高效的方式利用我们的免疫系统来消灭癌细胞，就像清除病原微生物那样。终于有迹象表明，这个梦想或许有一天能够实现，至少对某些类型的癌症是如此。

从概念上讲，最简单的免疫疗法类型是向患者注射靶向癌细胞的抗体。这种方法已取得一定成功。例如，约 25% 的乳腺癌会异常高表达 Her2（人类表皮生长因子受体 2）蛋白——这是一种与 EGF 受体相关的受体酪氨酸激酶，在乳腺上皮正常发育过程中发挥作用。名为曲妥珠单抗（商品名赫赛汀）的单克隆抗体能结合 Her2 并抑制其功能，可减缓过度表达 Her2 的人类乳腺癌生长，现已成为这类癌症的标准疗法（见图 20-44）。另一种相关方法利用抗体向癌细胞递送毒素。针对特定癌细胞表面高表达而正常细胞缺乏的蛋白质抗体，可与毒素结合，从而杀死抗体所结合的细胞。

当前大量研究热点聚焦于另一种基于 T 淋巴细胞的新型免疫疗法。正如

图 20-45 免疫系统识别肿瘤特异性抗原。由于体细胞突变，肿瘤细胞会产生多种不同的突变蛋白。如第 24 章所述，这些蛋白质的肽段将作为新抗原呈现在肿瘤细胞表面，并有可能激活 T 细胞反应以杀死该细胞（参见图 24-42）。

如第 24 章详述，细胞毒性 T 细胞能够杀死表面呈现外源肽抗原的宿主细胞。由于这些肽通常源自入侵病原体，该反应有助于终止感染。当前挑战在于寻找方法，以类似效率与特异性招募细胞毒性 T 细胞攻击癌细胞——前提是癌细胞表达肿瘤特异性抗原。需注意的是，通过对迄今确定的数千个肿瘤基因组序列分析，我们已知典型癌细胞含有约 50 种发生氨基酸序列改变的突变蛋白，其中绝大多数为先前所述的乘客突变（参见第 1186 页）。无论是乘客突变还是驱动突变引发的氨基酸变化，都有可能产生能被 T 细胞识别为异物的细胞表面新抗原，从而导致癌细胞死亡（图 20-45）。然而，由于细胞毒性 T 细胞会杀死受感染的宿主细胞，其活性受到严格调控以确保处于安全范围内。此外，癌细胞通常缺乏病原体感染细胞中存在的某些成分，这些成分对于启动强烈的 T 细胞反应至关重要。因此，肿瘤反应性 T 细胞数量极少，而增加其数量的疗法正处于免疫治疗的前沿。

增强 T 细胞对癌细胞反应的一种方法是，从患者血液中采集其自身的 T 细胞，扩增具有抗癌活性的细胞群，然后将其重新输回患者体内。这种方法通过引入大量已能识别携带癌症特异性抗原肿瘤细胞的 T 细胞，在转移性黑色素瘤患者中显示出显著疗效，完全缓解率高达 20% 。在这一策略的更精细变体中，患者的 T 细胞可在扩增前进行基因改造，这一过程称为嵌合抗原受体 T 细胞（CAR T）疗法（参见影片 20.9）。经过改造的 CAR T 细胞不仅能识别患者的肿瘤特异性抗原，还具备共刺激活性以增强 T 细胞反应。该疗法对某些血癌极为有效，但不幸的是，由于免疫系统过度激活，也会引发严重副作用。

=== 免疫抑制是癌症免疫疗法面临的主要障碍 ===
如果癌细胞的新抗原被识别为外来物，为何免疫系统不能更有效地在初期清除癌症？如前所述（参见第 1175-1176 页），癌细胞通过操纵其周围的基质（包括免疫细胞）来创造一个既促进肿瘤生长又抑制免疫反应的微环境。对肿瘤如何逃避免疫破坏的研究揭示了关键的免疫抑制机制——癌细胞表面表达一种或多种蛋白质，这些蛋白质与包括活化 T 细胞在内的多种免疫细胞上的抑制性受体结合。因此，即使细胞毒性 T 细胞识别出肿瘤抗原，它们也无法杀死肿瘤细胞。T 细胞表面表达的抑制性受体是免疫检查点的一部分，在感染期间防止过度、组织损伤性免疫反应中发挥重要的正常功能。但在癌症背景下，免疫

图 20-46 免疫系统如何与癌症相互作用。（A）克服肿瘤免疫抑制微环境的抗体疗法。癌细胞通常通过在表面表达与 T 细胞抑制性受体结合的蛋白质来保护自身免受免疫攻击。如图所示示例中，癌细胞表达 PDL1，该蛋白与 T 细胞上的 PD1 受体结合并干扰 T 细胞活化。这使得肿瘤易受释放 T 细胞攻击的抗体影响。（B）树突状细胞通过从肿瘤获取肿瘤细胞抗原并在淋巴结中呈递（如图所示），在激活 T 细胞过程中起关键作用，而某些癌症已进化出干扰此过程的机制（未显示）。

检查点机制可能阻止个体杀死威胁其生存的癌细胞。

为了克服免疫抑制环境并提供强烈的 T 细胞激活信号，一种前景广阔的新型抗癌疗法致力于开发免疫检查点抑制剂，例如能够阻止肿瘤细胞与 T 细胞上抑制性受体结合的抗体。如图 20-46A 所示，通过抗体靶向抑制性受体或其配体，可以释放对癌细胞的免疫攻击。重要的是，多种新抗原被识别为外来物质，使得癌细胞无法通过单个新抗原的突变丢失来逃避免疫攻击，从而让肿瘤难以对抗体治疗产生耐药性。相当一部分转移性黑色素瘤患者在反复注射与 PD1（程序性细胞死亡蛋白 1）或其配体 PDL1（存在于癌细胞表面）结合的单克隆抗体后，出现了显著疗效，其癌症得以缓解数年之久。遗憾的是，该治疗方法对患有同类癌症的其他患者并未奏效。

关于为何免疫疗法对部分患者有效而对另一些无效的重要线索，源自本章第二部分所述的对癌症基因组的广泛分析。肿瘤样本的一个偶然特性是，它们不仅包含癌细胞，还包括相关的基质细胞，如成纤维细胞、内皮细胞及各种免疫细胞。由于每种细胞类型都表达一组特征性的 RNA，因此可以评估肿瘤中每种细胞类型的存在和比例，包括 T 细胞。对数千种不同肿瘤的免疫细胞谱进行比较后，发现了有趣的相关性。例如，正如人们可能预测的那样，与基因组突变较少的癌症相比，基因组含有大量点突变的癌症通常拥有更高比例的 T 细胞，这可能是由于新抗原的增加。反过来，这种肿瘤特征与使用免疫检查点抑制剂治疗后更好的治疗效果相关。

某些癌症似乎通过阻止 T 细胞最初渗入肿瘤来避免免疫破坏。这一现象的细胞基础尚不明确，是当前重要的研究领域。已知 T 细胞的激活需要其与称为树突状细胞的抗原呈递细胞发生物理性相互作用。树突状细胞具有高度迁移性，能在感染部位摄取病原体或其产物，并将其输送至淋巴系统。

淋巴结或其他淋巴器官中的树突状细胞捕获这些抗原，并将其呈递给 T 细胞。在癌症情况下，树突状细胞会将新抗原呈递给 T 细胞，使 T 细胞能够追踪并摧毁表达这些抗原的癌细胞（图 20-46B）。某些癌细胞通过阻止树突状细胞与其相互作用及获取新抗原，来抑制这一过程。

这些观察结果说明了免疫系统如何受到多层次的调控，以及癌细胞如何被选择以利用这些调控机制。重要的是，对这些现象背后的细胞生物学机制进行研究，不仅有助于开发新的癌症治疗方法，还将教会我们系统运作的基本原理，正如第24章所述。

=== 癌症对疗法产生耐药性 ===
高期望必须与严峻的现实相调和。我们已经看到，基因不稳定性可能成为癌症疗法可利用的弱点，但与此同时，它也可能使癌细胞以惊人的速度进化出对治疗药物的抗药性，从而使根除疾病变得更加困难。这一点甚至适用于那些针对基因不稳定性本身的药物。因此，PARP 抑制剂能够有效缓解病情，但从长远来看，疾病通常会复发。例如，Brca 缺陷型癌症有时会通过对受影响的 Brca 基因进行二次突变来恢复其功能，从而对 PARP 抑制剂产生抗药性。到那时，癌症已经失控，可能为时已晚，无法通过额外治疗来影响疾病的进程。

癌症对抗癌药物产生耐药性的策略多种多样。通常，初始药物治疗会使肿瘤体积显著缩小，所有可检测到的肿瘤细胞似乎都已消失。但数月或数年后，癌症会以改变后的形态复发，并对原本疗效显著的药物产生耐药性。这种情况下，初始药物治疗显然未能彻底清除原始肿瘤细胞群中的微小部分细胞。这些细胞可能因携带保护性突变或表观遗传变化而逃过一死，亦或仅仅是因为藏匿于受保护的环境中。更隐蔽的是，表型独特的肿瘤细胞亚群可能发挥着癌症干细胞的作用。这些存活细胞通过持续增殖最终使癌症再生，并在此过程中进一步发生突变和进化。联合疗法——即同时使用两种合适药物靶向相同癌细胞——原则上应能极大帮助解决这类问题。

然而，在某些情况下，暴露于某种抗癌药物的细胞不仅会对该药物产生耐药性，还会对从未接触过的其他药物产生耐药性。这种多药耐药现象通常与基因组中一个名为 Mdr1 或 Abcb1 基因所在区域的扩增有关。该基因编码一种质膜结合的 ABC 转运蛋白超家族（第 11 章将讨论）的 ATP 酶，能够将亲脂性药物泵出细胞（参见视频 11.5）。癌细胞过度产生这种蛋白质（或其家族其他成员）会阻止多种细胞毒性药物在细胞内的积累，从而使细胞对这些药物不敏感。

在晚期转移性癌症与治疗专家之间的拉锯战中，按照现行医疗实践，癌症通常最终会获胜。但情况必须如此吗？正如我们下文将探讨的，有理由认为通过同时使用多种武器攻击癌症——而非逐一使用每种手段直至其失效——我们很有可能取得更好的疗效。

=== 如今我们已具备设计个性化联合疗法的技术手段 ===
现今，早期发现的癌症通常可通过手术、放疗或药物治愈。然而对于大多数已广泛进展和转移的癌症，治愈仍常常难以实现。如前所述的治疗方案

虽能带来宝贵的缓解期，但迟早往往会面临复发。

尽管如此，针对某些类型的晚期癌症，目前正在开发结合多种策略的治疗方法；例如，将化疗和放疗与免疫疗法相结合。理想情况下，联合用药的选择应针对个体患者量身定制。癌症的演变本质上是一个随机过程，且每个个体都有所不同，但现代基因组分析方法使我们能够详尽地分析肿瘤活检细胞，从而发现特定病例中哪些关键癌症基因受到影响。诚然，这并非易事：个体内的肿瘤细胞具有异质性，并非所有细胞都含有相同的基因损伤。然而，随着对癌症演变途径理解的加深，以及从众多不同病例中积累的经验，我们应能做出关于最佳治疗方案的明智决策。

组织取样技术、基因组学及生物统计学的进步使得直接表征人类原发性肿瘤成为可能。然而，这些分析并未考虑全身系统的影响。癌症治疗领域的进展还源于疾病模型的精细化发展——这些模型既能用于探究肿瘤生长与转移的影响因素，也可用于检验治疗反应。其中一种方法是通过基因工程技术改造小鼠，使其携带特定组合的人类基因突变（见图 20-33）。第二种手段是人体肿瘤异种移植模型：将人类癌细胞移植到免疫缺陷小鼠体内（皮下或癌源器官部位），这类小鼠不会排斥人类细胞。而绕过小鼠模型的第三种方法，是利用患者来源的健康组织和肿瘤组织在三维培养体系中培育类器官（见图 20-34A）。这些系统为患者特异性药物测试及个体化治疗方案制定提供了有力支撑。

从患者的角度看，癌症研究的进展速度可能显得令人沮丧地缓慢。每种新药都必须在临床中进行测试，先检验安全性再验证有效性，才能获准普遍使用。若药物需与其他药物联合使用，联合疗法也必须经历同样漫长的过程。严格的伦理规范制约着试验的开展，这意味着试验需要时间——通常需要数年之久。但朝着正确方向系统迈出的缓慢而谨慎的步伐，终将带来重大突破。虽然任重道远，但我们讨论过的实例已提供了原理验证和乐观的依据。

通过癌症研究，我们获得了关于正常细胞分子生物学的绝大部分认知。如今，我们正越来越多地发现如何将这些知识运用于对抗癌症本身的战役中。

=== 摘要 ===
我们对癌症细胞生物学的日益深入理解，已经开始催生出更有效的预防、诊断和治疗这些疾病的方法。通过利用癌细胞区别于正常细胞的特性——包括癌细胞对致癌蛋白的依赖及其 DNA 修复机制中的缺陷——可以设计出优先摧毁癌细胞的抗癌疗法。现有充分证据表明，随着对正常细胞调控机制及其在特定癌症中如何被颠覆的精确理解，我们终将能够研制出通过攻击癌细胞增殖和存活所必需的关键分子来精准杀灭癌症的药物。此外，通过复杂的免疫学方法治疗癌症最近也取得了重大进展。而且，随着我们能够更准确地测定任何特定肿瘤细胞中发生改变的基因，我们开始能够为每位患者量身定制更精准的治疗方案。

= 多细胞生物的发育 =
每个多细胞生物，无论是动物还是植物，其生命都始于单个细胞——一个受精卵或合子。在发育过程中，这个细胞不断分裂，产生许多不同类型的细胞，最终排列成极其复杂且精确的模式。发育细胞生物学的目标是理解指导这一惊人转变的细胞和分子机制（视频21.1）。

植物和动物有着截然不同的生活方式，并采用不同的发育策略。在本章中，我们主要关注动物。动物发育的三个基本过程是：（1）细胞增殖，即从一个细胞产生许多细胞；（2）细胞特化或分化，使细胞获得不同的特性和功能；（3）形态发生，即细胞重新排列形成结构化的组织和器官（图21-1）。

受精卵的发育始于多轮细胞分裂，产生大量可特化为不同功能的细胞群。在发育的每个后续阶段，细胞都面临有限的选择，使其发育路径不断分叉，反映出大量连续决策过程。正如我们人生中的抉择，细胞的选择基于其内在状态——这主要反映其历史经历——以及来自其他细胞特别是邻近细胞的即时影响。要理解发育过程，我们需要了解每个选择如何受控、如何依赖于先前的决策。更重要的是，我们需要理解决策如何影响细胞的化学特性与行为方式，以及细胞行为如何协同作用最终决定机体的结构与功能。

随着细胞特化，它们不仅改变自身的生物化学特性，还改变形态及与其他细胞和细胞外基质的连接方式。它们通过移动和重组构建出人体复杂的架构，包括所有精确构造且尺寸明确的组织和器官。要理解这种形态发生的过程，我们需要同时考虑细胞间的机械相互作用和生物化学相互作用。

乍看之下，人们不会期望蠕虫、跳蚤、雄鹰和巨型乌贼由相同的发育机制产生，就如同不会假设制鞋与造飞机采用相同方法。然而令人惊讶的是，研究发现发育的基础机制在所有动物中本质上是一致的——不仅在所有脊椎动物中，在所有无脊椎动物中也是如此。可识别相似、进化相关的分子

图21-1 多细胞生物发育所需的三个基本细胞过程

图 21-2 同源蛋白通常具有保守功能。（A）无眼蛋白（亦称 Pax6）调控果蝇眼睛发育。在野生型果蝇中（上排），无眼/Pax6 基因在发育中的眼部表达，并指导形成右侧扫描电镜图像所示的眼睛结构。该基因在腿部错误表达（下排）会导致腿前体细胞（B）（参见图 7-38）或翅前体细胞（C）形成眼组织。乌贼同源 Pax6 蛋白在果蝇发育腿部错误表达时会产生相同效果（D）。（果蝇图像由 Katy Ong 和 Justin Kumar 提供；电镜图像引自 S.I. Tomarev 等，《美国国家科学院院刊》94 卷 2421-2426 页。1997 年版权归美国国家科学院所有，经美国国家科学院许可使用。）

定义特化的动物细胞类型，标记不同身体区域的差异，并协助构建动物体型模式。同源蛋白在不同物种中常发挥相同作用且功能可互换。例如，人工在果蝇体内表达的小鼠或鱿鱼蛋白，能够执行与该果蝇自身版本蛋白相同的功能（图21-2）。基于机制的内在统一性，发育生物学家在系统理解动物发育方面取得了重大进展。

本章首先概述动物发育过程中的若干基本机制，重点探讨那些研究最深入且能引发细胞差异的机制。随后依次讨论：胚胎细胞如何分化形成空间模式、发育事件的时间调控机制、细胞行为变化如何驱动形态发生，以及动物体型大小的调节方式。

= 发育概述 =
动物通过摄食其他生物生存。因此，尽管存在显著多样性，从蠕虫、软体动物到昆虫和脊椎动物等形态各异的动物，都共享与这种生存方式密切相关的基本解剖特征。表皮细胞构成保护性外层；肠道细胞吸收摄入食物中的营养；肌肉细胞实现向食物源移动；神经元和感觉细胞则调控行为。这些不同类型的细胞被组织成组织和器官，形成覆盖体表的皮肤层、用于摄食的口腔以及负责消化的内部肠道管道——肌肉、神经及其他组织分布于皮肤与肠道之间的空间。许多动物具有明确的身体轴线：前后轴（口与脑部居前，肛门居后）、背腹轴（背部向上，腹部向下）以及左右轴。本节将探讨动物基本体型构建的核心机制，以及这种细胞类型多样性是如何形成的。

= 保守机制构建动物核心组织体系 =
动物共有的解剖特征通过保守的机制发育而成。受精后，合子通常会迅速分裂或卵裂，形成许多称为卵裂球的小细胞。在此卵裂阶段，尚不能自主获取营养的胚胎并不生长。这一发育步骤最初完全由母体沉积在卵子中的物质驱动和控制。

图 21-3 以青蛙为例展示的早期发育阶段。(A) 受精卵分裂产生大量

胚胎基因组在很大程度上保持休眠状态，直至母源 mRNA 和蛋白质被耗尽或突然降解的转折点。随后胚胎基因组被激活——即我们后续将讨论的母源-合子转换——细胞相互粘附形成囊胚，通常呈现为实心或中空充满液体的细胞团。

即使在胚胎发生的这些早期阶段，遗传程序已然启动，催生出基本组织类型。一种称为原肠胚形成（源自希腊语 gaster，意为“腹部”）的复杂细胞重排过程，很快将囊胚转化为包含原始内部肠道的多层结构（图 21-3）。囊胚的部分细胞保留在外层，形成外胚层，这些细胞将发育成表皮和神经系统；其他细胞内陷形成内胚层，未来将形成肠道管及其附属器官，如肺、胰腺和肝脏。在大多数动物中，另一群细胞迁移至外胚层与内胚层之间的空隙，形成中胚层，这些细胞将发育成肌肉、结缔组织、血液、肾脏以及其他多种组织成分。进一步的细胞运动及伴随的细胞分化过程，不断塑造并完善着胚胎的结构架构。

原肠胚形成过程中形成的外胚层、中胚层和内胚层构成了早期胚胎的三个胚层。这一初始划分是确定发育过程中将出现的众多细胞命运的第一步。许多后续的发育转化将产生结构精细的器官。但在原肠胚形成阶段以微型规模建立的基本身体蓝图和轴线会一直保留到成年期，此时生物体的体积可能增长数十亿倍（参见影片21.2）。

= 细胞的发育潜能逐渐受限 =
随着身体结构的精细化，谱系内的单个细胞——即特定增殖母细胞的后代——其发育潜能变得越来越受限。在囊胚阶段，细胞通常具有全能性或多能性，即有能力分化形成成人身体的所有或几乎所有细胞类型。随着原肠胚形成的进行，这种多能性逐渐丧失：例如位于内胚层的细胞

形成上皮层的囊胚细胞通常围绕一个空腔排列。在原肠胚形成过程中，部分细胞内陷形成中胚层（绿色）和内胚层（黄色）。外胚层细胞（蓝色）则保留在外侧。（B）通过两栖动物胚胎躯干的横截面展示了基本的动物体结构规划：外侧为外胚层，内部为内胚层形成的管状结构，中胚层夹在两者之间。内胚层构成了从口腔到肛门的肠道上皮内衬，不仅发育出咽、食管、胃和肠道，还形成许多相关结构。例如唾液腺、肝脏、胰腺、气管和肺部都源自消化道壁，逐渐发育成分支管状系统并开口于肠道或咽部。内胚层仅形成这些结构的上皮组成部分——如肠道内衬和胰腺分泌细胞，而支撑性的肌肉与纤维成分则源于中胚层。

中胚层发育为结缔组织——最初形成胚胎中称为间充质的疏松细胞网，最终形成软骨、骨骼和纤维组织，包括真皮（皮肤的内层）。中胚层还形成肌肉、整个血管系统——包括心脏、血管和血细胞——以及肾脏和生殖腺的小管、导管和支持组织。脊索由中胚层形成，作为未来脊柱的核心，并作为协调周围组织发育的信号源。

外胚层将形成表皮（皮肤的外上皮层）和表皮附属器，如毛发、汗腺和乳腺。它还将发育成整个神经系统，包括中枢和周围神经系统，不仅包括神经元和神经胶质细胞，还包括鼻、耳、眼和其他感觉器官的感觉细胞。（B，引自 T. Mohun 等人，《细胞》22:9–15, 1980。）

例如，能够产生将排列在肠道内或形成肠道衍生器官（如肝脏或胰腺）的细胞类型，但它不再具有形成中胚层衍生结构（如骨骼、心脏或肾脏）的潜力。这样的细胞被称为已决定走向内胚层命运。因此，细胞决定开始得早，并随着细胞逐步经历一系列程序化的中间状态——在每一步都受到其基因组、历史以及与邻近细胞相互作用的引导——而逐渐缩小选择范围。当细胞经历终末分化，形成成年体内高度特化的细胞类型之一时，这一过程达到极限（图21-4）。成年体内一些保持分裂能力的细胞类型也保留了一定程度的多能性，尽管选择范围通常较窄。这些成体干细胞将在第22章讨论。

= 细胞记忆是细胞决策的基础 =
发育过程中丰富且极其复杂的成果背后，是细胞记忆在起作用（参见第435页）。细胞表达的基因及其行为方式既取决于细胞的过去，也受当前环境的影响。我们体内的细胞——肌肉细胞、神经元、皮肤细胞、肠道细胞等——能够保持其特化特征，主要因为它们保留了祖先在发育过程中接收的细胞外信号记录，而非持续从周围环境获取此类指令。尽管表型差异巨大，几乎所有细胞都保留着与受精卵中相同的完整基因组。它们的差异反而源于差异基因表达，这可能导致特定细胞程序的稳定遗传。我们在前几章讨论了基因调控、细胞记忆、细胞分裂、细胞信号传导和细胞运动的分子机制。本章将探讨这些基本过程如何协同作用，使发育中的动物实现自我组装。

= 几种模式生物对理解发育过程至关重要 =
动物共有的解剖特征在进化过程中经历了诸多极端变化。因此，物种间的差异在我们人类眼中通常比相似之处更为显著。但在分子机制及所涉及特定大分子的层面上，情况恰恰相反：所有动物之间的相似性既深刻又广泛。经过超过五亿年的进化分化，所有动物都保留着明显相似的基因和蛋白质组合，这些基因和蛋白质负责构建它们的身体蓝图，并形成特化的细胞和器官。

这种惊人的进化保守性并非通过对动物多样性的广泛调查发现，而是通过对少数实验便利物种——即第一章讨论的模式生物——的深入研究而揭示。对于动物发育生物学而言，最重要的模式生物包括果蝇''黑腹果蝇'' 、非洲爪蟾''光滑爪蟾'' 、线虫''秀丽隐杆线虫'' 、小鼠''家鼠''以及斑马鱼''斑马鱼'' 。在探讨发育机制时，我们将主要从这几种物种中选取案例，同时谨记它们仅代表了动物生命树的一部分。

= 调控 DNA 似乎是造成动物物种间差异的主要原因 =
尽管许多发育机制具有保守性，但它们最终产生的动物却可能截然不同。这些差异主要源于关键发育控制基因活性的变异。如第七章所述，多细胞生物中每个基因都关联着数千个核苷酸的非编码 DNA，其中包含调控元件。这些

图 21-4 从卵裂球到终末分化细胞谱系的演变过程。随着发育的推进，细胞变得越来越特化。卵裂球具有分化产生大多数或全部细胞类型的潜能。在信号分子和基因调控因子的作用下，细胞命运逐渐受限，最终分化为高度特化的细胞类型，例如分泌胰岛素激素的胰腺 \beta 细胞。

图 21-5 调控 DNA 决定发育过程中的基因表达模式。肌肉细胞与皮肤细胞拥有相同的基因组，但由于这些细胞表达不同的转录调控因子（这些因子会与基因调控元件结合），导致不同基因被激活。例如，皮肤细胞中的转录调控因子识别基因 1 的调控元件并激活该基因，而肌肉细胞中则存在另一组调控因子，它们结合并激活基因 3。激活基因 2 表达的转录调控因子同时存在于这两种细胞类型中。

调控元件根据特定细胞中存在的转录调节因子和染色质结构，决定基因产物何时、何地以及以多强的程度表达（图 21-5）。因此，进化过程中调控 DNA 序列的改变，即使编码 DNA 未发生任何变化，也可能改变基因调控网络的逻辑并影响发育结果。

如第四章所述，当我们比较不同动物物种的基因组时，发现进化对编码 DNA 和调控 DNA 的改变程度各不相同。编码 DNA 可能相当保守，但非编码调控 DNA 通常保守性要低得多。调控 DNA 的变化似乎是造成不同动物类群间显著差异的主要原因（参见第 239 页）。我们可以将保守编码序列的蛋白质产物视为通用分子零件工具箱，而调控 DNA 则是组装说明书：通过不同的指令，同一套零件工具箱可用来构建各种不同的身体结构。我们稍后将重新讨论这一重要概念。

= 少量保守的细胞间信号通路协调空间模式形成 =
发育动物的空间模式形成要求细胞根据其在胚胎中的位置产生差异，这意味着细胞必须对其他细胞（尤其是邻近细胞）产生的细胞外信号作出反应。在最常见的空间模式形成方式中，一组细胞最初具有相同的发育潜能，随后来自该群体外部细胞的信号诱导其中一个或多个成员改变其特性。这一过程被称为诱导信号传导。通常，诱导信号在时间和空间上受到限制，因此只有能够响应的细胞子集——即靠近信号源的细胞——才会呈现诱导特性（图21-6）。部分诱导信号依赖于细胞间直接接触；另一些则作用于更长距离，通过细胞外介质中扩散的分子或经由血液运输的分子进行介导（参见图15-2）。

动物发育中已知的大多数诱导事件由少数高度保守的信号通路控制，包括转化生长因子- \beta （TGF- \beta ）、Wnt、Hedgehog、Notch 以及受体酪氨酸激酶（RTK）通路（详见第 15 章）。发育细胞用于细胞间通讯的有限信号词汇的发现，已成为发育生物学的一大简化特征。

= 通过组合调控与细胞记忆，简单信号可生成复杂模式 =
少量信号通路如何能产生如此多样的细胞类型与模式？这主要依靠几种机制。首先，激活信号通路产生的效应取决于细胞先前的经历

图21-6 诱导性信号传导。表达细胞外信号分子的灰色细胞引导邻近蓝色细胞形成新的细胞命运。

图 21-7 对相同诱导信号产生不同应答的两种机制。（A）通过细胞记忆，先前的信号（或其他事件）可留下持久痕迹，改变对当前信号的响应（参见图 7-56）。记忆痕迹在此以细胞核着色表示。（B）在组合信号传导中，信号效应取决于同时接收的其他信号是否存在。

应答细胞：过往影响会留下持久印记，记录在细胞染色质状态以及细胞内转录调节因子和 RNA 分子的选择中。这种细胞记忆使具有不同历史的细胞能够对相同信号作出不同响应（图 21-7A）。其次，细胞对特定信号的应答取决于其同时接收的其他信号（图 21-7B）。因此，不同信号组合可产生多种多样的应答反应。

除了这两种机制外，信号通路的某些组成部分，如配体或受体，是由在进化过程中经历复制并随后功能分化的基因编码的。这些高度同源的基因随后可在不同细胞类型中表达，从而引导不同的信号传导结果。例如，Notch 信号在一个组织中可能由 Notch1 介导，在另一个组织中则由 Notch4 介导，每个同源物诱导不同靶基因的转录。因此，相同的少数信号通路可以在不同时间和地点重复使用并产生不同结果，从而形成无限复杂的模式。

= 形态发生素是可扩散的诱导信号，能产生梯度效应 =
信号分子通常控制简单的"是-否"选择——高浓度时产生一种结果，低浓度或缺失时产生另一种结果。然而在其他情况下，反应呈现更精细的梯度变化：例如高浓度信号分子可能引导细胞进入一种发育途径，中等浓度引导进入另一种途径，而低浓度则引导进入第三种发育途径。

产生信号分子不同浓度的一种常见方式是分子从局部信号源扩散出去，形成浓度梯度。距离信号源不同位置的细胞会根据其所接触的信号浓度，被驱动表现出多种不同的行为方式（图21-8）。以这种方式在整个细胞区域形成模式的信号分子被称为形态发生素。在最简单的情况下，特化的细胞群以稳定速率产生形态发生素，随后该物质在扩散过程中逐渐降解。扩散速度与

图 21-8 梯度形成与解读机制。通过局部产生的诱导剂——形态发生素——从源点向外扩散形成浓度梯度。不同的形态发生素浓度（或不同暴露时长）会在响应细胞中诱导不同的基因表达模式和细胞命运。扩散传输仅能在短距离内形成陡峭梯度，形态发生素通常作用于 1\mathrm{mm} 或更短距离范围内。

形态发生素的半衰期将共同决定其形成梯度的范围和陡峭程度（图21-9）。

随后，邻近细胞根据其接触到的信号量——通过细胞表面受体的结合来检测——解读自身与形态发生素源的距离。这些受体完成信号转导后，只有当形态发生素浓度超过特定阈值时，靶基因才会开始转录；低于此阈值的低浓度则不会激活靶基因。通过这种方式，梯度信号可转化为基因活性的多个离散开关式变化。因此，单个分泌蛋白结合扩散的物理特性及细胞解读信息的能力，能够在细胞区域内产生多种不同的命运走向。

这种简单机制可以通过多种方式进行调整。例如，细胞表面受体可能捕获扩散中的形态发生素，使其被内吞并降解，从而缩短其有效半衰期。或者，形态发生素可能与细胞外基质中的分子（如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，第19章将讨论）结合，从而大幅降低其扩散速率。

= 侧向抑制可产生不同细胞类型的模式 =
形态发生素梯度及其他类型的诱导信号利用胚胎中现有的不对称性来创造进一步的不对称性和细胞间差异：从一开始，某些细胞就特化为产生形态发生素，从而对另一类对其敏感的细胞施加模式。但如果没有明确的初始不对称性呢？在最初完全相同的细胞群中，能否自发形成规则模式？

答案是肯定的。这种全新模式形成的基本原理在于正反馈机制：细胞能够通过信号交换，使得不同位置细胞间任何微小的初始差异自我放大，从而推动细胞走向不同的命运。这一机制在最典型的侧向抑制现象中得到了清晰体现——这种细胞间相互作用迫使相邻细胞产生分化，进而形成精细的不同细胞类型图案。

图 21-9 通过扩散建立信号梯度。每张图显示在原点以恒定速率产生的形态发生素信号分子浓度。在所有情况下，该分子在从源点扩散的同时会发生降解，这些图表基于分子沿空间两个轴向扩散的假设计算得出（例如从上皮组织中的源点径向扩散）。(A) 假设从时间 0 开始产生形态发生素，分子半衰期为 170 分钟，并以有效扩散常数 D = 1\mu \mathrm{m}^2\mathrm{sec}^{-1} （相当于细胞外组织中典型小蛋白分子的扩散能力）进行扩散时的浓度分布。红线展示了形态发生素积累过程中六个连续阶段，其浓度随距离源点的增加呈指数衰减。图 B 和 C 展示了系统特性的简单变化如何改变 160 分钟时间点的梯度分布。(B) 形态发生素扩散常数增加三倍（蓝线）会扩大其作用范围，但会降低源点附近的浓度。(C) 形态发生素半衰期增加三倍（绿线）会提高其在整片组织中的浓度。形态发生素的作用不仅取决于其在某个关键时刻的浓度，还取决于每个靶细胞如何随时间整合其反应。（由 Patrick Müller 提供。）

设想一对起始状态相似的相邻细胞。每个细胞既能产生也能响应某种信号分子 \mathbf{X} ，并遵循一个附加规则：细胞接收到的信号越强，其自身产生的信号就越弱（图 21-10）。若一个细胞产生更多 \mathbf{X} ，另一个则被迫减少产生，例如通过降低编码 X 的基因转录。这形成了一个正反馈循环，倾向于放大两个相邻细胞间的任何初始差异。这种差异可能源于当前或过去外部因素施加的偏向，也可能仅来自自发的随机波动或“噪音”——这是细胞遗传控制回路不可避免的特性（第七章将讨论）。无论哪种情况，侧向抑制意味着，如果细胞 1 产生稍多的 X，它将导致细胞 2 产生更少；由于细胞 2 产生较少的 X，它对细胞 1 的抑制减弱，从而使得细胞 1 中 X 的产量进一步上升；如此循环，直至达到一个稳定状态，其中细胞 1 大量产生 X，而细胞 2 产生极少。结果是这两个细胞被驱动沿着不同的分化路径发展。

在几乎所有组织中，都需要不同细胞类型的平衡混合与分布。侧向抑制提供了一种生成这种混合的常见方式。正如我们将看到的，侧向抑制通常通过细胞间接触经由 Notch 信号通路进行信号交换来介导，通过使表达一组基因的单个细胞引导其紧邻细胞表达另一组基因，从而驱动细胞多样化，这正是我们所描述的方式（另见图 15-60）。

= 不对称细胞分裂也能产生多样性 =
细胞分化并不总是依赖于细胞外信号：在某些情况下，细胞天生就不同，这是由于不对称细胞分裂的结果，即母细胞中存在的某些重要分子在两个子细胞之间不均等分配。这种有丝分裂期间的不对称遗传确保了两个子细胞以不同方式发育（图21-11）。尽管子细胞也可能在分裂后由于先前讨论的外源性诱导信号而变得不对称，但这里的机制是分裂细胞固有的。内在的不对称分裂是早期发育的一个常见特征。受精卵可能已经拥有内部模式，而这个大细胞的分裂将不同的命运决定因子分离到不同的卵裂球中。我们将在后面看到，不对称分裂在后期发育过程以及干细胞中也发挥作用（参见第22章）。

图 21-10 通过侧向抑制与正反馈产生不对称性的机制。本例中，两个相互作用细胞各自产生物质 X，该物质通过侧向抑制效应抑制对方细胞的 X 生成。某个细胞内 X 的增加会引发正反馈，促使该细胞进一步增加 X 产量，同时减少相邻细胞的 X 产量。这种加速不稳定性可能导致两个细胞产生根本性差异。最终，系统会稳定于两种对立稳态中的一种。这种稳态选择代表了一种记忆形式：最初引导选择方向的微小影响无需持续存在即可维持该状态。

图 21-11 使子代细胞差异化的两种方式。子代细胞可通过以下两种途径获得不同命运：(A) 通过细胞质分子差异性遗传的内在不对称分裂，或(B) 通过对称分裂后仅向其中一个子代细胞传递信号。

图21-12 通过连续诱导实现模式形成。从少量细胞出发，通过一系列诱导相互作用可产生多种细胞类型。

= 初始模式在小范围细胞群中建立，并随着胚胎生长通过连续诱导逐步精细化 =
调控胚胎细胞空间模式的信号通常作用于短距离，并支配相对简单的选择。例如，形态发生素通常作用于 1\mathrm{mm} 的范围内——这是扩散的有效作用距离——并指导其作用的细胞在若干发育选项间做出选择。然而最终发育形成的器官远比这更为庞大和复杂。

随着器官通过细胞增殖而生长，其初始模式的精细化过程可解释为：通过一系列连续相互作用，在最初简略的草图基础上不断增添更精细的细节。例如，当发育组织中出现两种细胞类型时，其中一种可产生信号，诱导邻近细胞亚群分化为第三种类型。这种第三类细胞又可反向信号传导至附近另两种细胞，从而产生第四和第五种细胞类型，依此类推（图21-12）。

这种生成渐进复杂模式的策略称为连续诱导。发育动物的身体蓝图最初以微型形式勾勒雏形后，正是主要通过连续诱导作用，随着发育进程不断增添越来越精细的细节。

= 发育生物学为疾病研究和组织维持提供重要见解 =
对动物发育理解的快速进展已成为生物学领域的重大成功案例之一，并具有重要的实际意义。约 2 - 5% 的人类婴儿出生时存在解剖结构异常，如心脏畸形、肢体短缺、腭裂或脊柱裂。发育生物学的进步帮助我们理解这些缺陷是如何产生的，即便目前尚无法预防或治愈大多数此类疾病。

从实践角度来看，虽不那么显而易见却更为重要的是，发育生物学也为理解成体细胞与组织的运作机制提供了洞见。发育过程并非止于出生，而是贯穿生命始终，伴随着组织的维持与修复。细胞生长与分裂、细胞间信号传导、细胞记忆、细胞粘附以及细胞运动等基本机制，不仅参与胚胎发育，同样作用于成体组织的维护与修复。正如我们在第20章所见，这些机制也是肿瘤细胞中主要被扰乱的机制。

胚胎比成体更为简单，使我们能更轻松地分析这些基础过程。例如，对早期果蝇胚胎的研究对发现多个保守信号通路（包括 Wnt、Hedgehog 和 Notch 通路）至关重要。这些研究不仅揭示了这些通路在维持正常人体组织中的核心作用，还为再生医学中调控这些通路奠定了基础。最终，它们为抗击癌症及其他疾病的疗法确定了靶点并提供了合理的作用机制。

在第22章中，我们将探讨这些核心发育机制及其他机制如何在正常成体中运作，特别是在通过干细胞持续更新的组织中——包括肠道、皮肤和造血系统。但现在，我们必须更仔细地观察早期胚胎如何生成其特化细胞的空间模式，从构建成体蓝图的变化过程开始。

= 摘要 =
动物发育是一个奇妙的自我组装过程，其中胚胎最初相似的细胞逐渐彼此分化，并自组织成日益复杂的结构。这一过程始于单个大细胞——受精卵，它通过分裂形成囊胚，囊胚经历原肠运动产生胚胎的三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。随着发育的继续，细胞根据其位置和彼此间的相互作用变得越来越特化，最终形成成体中的某种分化细胞类型。

发育中的细胞差异以多种方式产生，并需在空间上得到恰当协调。一种常见策略是，群体内初始相似的细胞通过暴露于来自外部信号源的不同浓度诱导信号或形态发生素而变得不同。邻近细胞亦可通过侧向抑制产生差异，即某个细胞向其邻近细胞发出信号，阻止它们走向相同的命运。这些细胞间相互作用由少数高度保守的信号通路介导，这些通路在不同生物体及发育过程中的不同时期被反复利用。然而，并非所有细胞多样化都源于细胞间相互作用：子细胞可能因不对称细胞分裂而天生不同。

转录和染色质结构的调控因子结合到调控 DNA 上，决定每个细胞的命运。体型差异在很大程度上似乎源于与每个基因相关的调控 DNA 的差异。这种 DNA 在定义发育的时序程序中起着核心作用，根据前一发育阶段每个细胞中存在的基因表达模式，在特定时间和地点激活基因。

发育过程在少数模式生物中得到了最深入的研究。但由此识别出的大多数基因和机制在所有动物中都被使用，并在不同发育阶段反复出现。因此，从蠕虫、果蝇、鱼类、青蛙和小鼠中获得的认识深刻影响了我们对人类胚胎学和成体组织维持的理解，以及这些过程中的异常如何导致先天缺陷和癌症。

= 模式形成机制 =
一个发育中的多细胞生物必须在几乎无法区分的细胞区域内创建不同的细胞命运，并以空间有序的方式完成这一任务，从而形成功能性组织。一些早期显微镜学家曾设想人体的整个形态和结构已以"小人"的形式存在于精子中——即一个微型人类，受精后这个小人只需生长即可形成完整尺寸的人体。我们现在知道这种观点是错误的，发育实际上是从简单到复杂的渐进过程，通过动物解剖结构的逐步精细化实现。要了解空间模式化和细胞决定的全过程如何启动，我们必须回到卵子和早期胚胎的阶段。

= 不同动物采用不同机制建立其初级极化轴 =
令人惊讶的是，动物发育的最初阶段是变异最大的阶段，即便在同一门类内也是如此。以青蛙、鸡和哺乳动物为例，尽管它们后期发育方式相似，但产生的卵子在大小和结构上截然不同，并且它们以不同的细胞分裂序列开启发育历程。

细胞分裂与特化同样存在巨大差异。同样地，身体主轴形成的时间和方式也存在很大变化。然而，胚胎的这种极化通常在原肠胚形成开始之前就已显现——这是空间模式形成的第一步。

必须建立两个主轴。前后轴（A-P 轴）确定未来头部和尾部的位置，背腹轴（D-V 轴）则确定未来的背部和腹部。对于呈现双侧不对称性的物种，建立额外的左右轴（L-R 轴）也至关重要。最后，许多动物的卵具有动物-植物极轴（A-V 轴），这一轴线在成体中并不明显，但能通过原肠胚运动界定哪些部分将形成内部结构，哪些将保持外部特征。（这个奇特的名称源自一个世纪前，与蔬菜毫无关联。）

在动物多样性的一个极端，卵子呈球面对称，其轴向仅在胚胎发生过程中才得以确立。小鼠便是一例，其卵子中几乎看不出明显的极性。相应地，最初几次细胞分裂产生的卵裂球似乎完全相同，且具有显著的适应能力。若将早期小鼠胚胎一分为二，便能产生一对同卵双胞胎——由单个细胞发育成两个完整、正常的个体。类似地，若用针刺毁双细胞期小鼠胚胎中的一个细胞，并将剩余的“半胚胎”植入代孕母鼠子宫发育，多数情况下仍能诞生出完全正常的小鼠。

在另一个极端，卵子具有不对称结构，这种结构本身就决定了身体未来的轴线。大多数物种都是这种情况，包括我们稍后将看到的果蝇等昆虫。其他生物则处于两者之间的某个状态。例如，非洲爪蟾的卵子在受精前就具有明确界定的 A-V 轴：靠近顶部的原核定义了动物极，而朝向底部的大量卵黄（胚胎的食物供应，最终将被纳入肠道）则定义了植物极。几种类型的 mRNA 分子已经定位在卵子的植物极细胞质中，并在那里产生它们的蛋白质产物。受精后，这些 mRNA 和蛋白质在胚胎中下部和中部的细胞中发挥作用，赋予细胞其特化特征。

非洲爪蟾胚胎的背腹轴形成由受精触发。精子仅能在动物极区域进入，其进入点处，精子中心体形成微管星体。微管细胞骨架的重组导致卵子外部皮层相对于细胞质中央核心发生旋转，使得皮层动物极略微偏向一侧（图21-13）。皮层旋转

图 21-13 蛙卵及其不对称性。（A）受精前的非洲爪蟾卵侧视图。（B）卵内分子沿动物-植物极轴的不对称分布，以及受精如何激活背腹不对称性。未受精卵中植物极定位的 VegT 蛋白定义了信号源的植物极位置，这些信号将诱导内胚层和中胚层形成。精子进入引发微管细胞骨架重组，触发卵皮质（数微米厚的表层）相对于卵核心旋转约 30 度。皮质旋转将包括 Wnt11 mRNA 在内的 Wnt 信号组分重新定位至未来背侧，从而建立胚胎的背腹轴。（A，由 Tony Mills 提供。）

重新定位信号分子并启动一系列事件，这些事件将组织身体的背腹轴。（胚胎的前后轴稍后在原肠胚形成过程中才会变得清晰。）这种通过信号提示在胚胎中建立新轴的一般过程被称为对称性破缺。

尽管不同动物物种采用多种机制来确立其整体结构，但进化结果却相对保守：头部与尾部、背部与腹部、内脏与皮肤均得以区分。似乎无论胚胎运用何种策略，总能成功打破初始对称性，建立起基本的身体蓝图。

= 果蝇研究揭示了发育背后的多种遗传调控机制 =
正是果蝇，而非其他任何生物，为我们理解基因如何调控早期发育提供了关键线索。数十年的研究最终汇聚成一项大规模遗传筛选，聚焦于早期胚胎，寻找破坏其形态模式的突变。这揭示了一组关键发育基因，它们通过相对少量的调控通路发挥作用。这些基因的发现及后续功能分析堪称科学杰作，对整个生物学领域产生了革命性影响，其发现者也因此荣获诺贝尔奖。通过这种方式揭示的调控机制中，部分在果蝇与脊椎动物间具有保守性，部分则不然。但该实验方法的逻辑及其揭示的遗传调控总体策略，彻底改变了我们对多细胞发育的整体认知。

要理解果蝇早期发育机制如何运作，需注意其发育过程中的一个特点。与其他昆虫卵类似但不同于大多数脊椎动物，果蝇卵——形似黄瓜——在发育初期会经历极其快速的核分裂而不伴随细胞分裂，在共同细胞质（即合胞体）中产生多个细胞核。随后这些细胞核迁移至细胞皮层，形成称为合胞体胚层的结构。当产生约6000个细胞核后，质膜在核间向内折叠并将其分隔成独立细胞，从而将合胞体胚层转化为细胞性胚层（图21-14）。

我们将看到，果蝇胚胎的初始模式形成依赖于在合胞体阶段通过细胞质扩散的分子，这些分子在卵子分裂成独立细胞之前，对快速分裂的细胞核中的基因发挥作用。在此阶段，无需通常形式的细胞间信号传递；合胞体囊胚层的相邻区域可以通过在巨大多核细胞的细胞质中移动的转录调节因子进行通信。

= 卵内沉积的基因产物调控早期果蝇胚胎的轴向形成 =
与大多数昆虫一样，果蝇未来身体的主要轴线在受精前就已确定，这是通过发育中的卵子（即卵母细胞）与卵巢中包围它的母体体细胞之间复杂的信号交换完成的。

图21-14 果蝇卵从受精到细胞囊胚阶段的发育过程。

图 21-15 Bicoid 蛋白梯度。(A) Bicoid mRNA 在卵子发生过程中沉积于前极。(B)局部翻译后通过扩散形成 Bicoid 蛋白梯度。(C)来自 Bicoid 纯合突变母体胚胎中缺失的 Bicoid 蛋白梯度。(A 和 B 由 Stephen Small 提供。)

这些信号可归类为母体效应，因为其源自母体基因组而非受精卵基因组。在受精前，未来胚胎的前后轴和背腹轴通过卵极性基因系统得以确立，这些系统在卵母细胞中形成 mRNA 或蛋白质标志物。受精后，每个标志物作为信标，提供引导周围区域发育过程的定位信号。

卵极性基因的本质源于对胚胎模式发生改变的突变体研究。其中一些突变导致胚胎极性紊乱；例如，某突变使身体两端都形成尾端结构，而缺失头端结构。这一特定突变有助于识别组织胚胎前端的标志物——Bicoid 蛋白。在受精前，Bicoid mRNA 分子沉积并定位于卵的前端。受精后，这些 mRNA 被翻译产生 Bicoid 蛋白。该蛋白作为一种细胞内形态发生素和转录调节因子，从其源点扩散开来，在合胞体细胞质内形成浓度梯度，最高浓度位于胚胎头部（图 21-15）。Bicoid 沿前后轴的不同浓度通过直接调控合胞体 blastoderm 细胞核中的基因转录，帮助决定不同的细胞命运（详见第 7 章讨论）。

还有三种卵极性基因系统对合胞体核进行模式构建；其中两个沿前后轴作用，一个沿背腹轴作用。它们与 Bicoid 基因群共同作用，方式大致相似，其基因产物标记出身体区域的三个基本分区——头部与后部，

图 21-16 果蝇中四种卵极性梯度系统的组织方式。Bicoid mRNA 编码一种转录激活因子，决定头部和胸部区域。Nanos 是一种翻译抑制因子，调控腹部的形成。定位的 Nanos mRNA 也会在胚胎后端形成生殖细胞时被纳入其中，Nanos 蛋白对生殖系发育至关重要。Toll 和 Torso 是遍布膜上的受体蛋白，但仅通过局部暴露于细胞外配体 Spaetzle（Toll 的配体）和 Trunk（Torso 的配体），在着色所示位点被激活。Toll 活性决定中胚层，而 Torso 活性则决定头尾末端结构的形成。

背侧与腹侧、内胚层与中胚层和外胚层——以及第四个同样对动物体型结构至关重要的划分：生殖细胞与体细胞的区别（图21-16）。

卵极性基因首先作用于基因系统层级中，逐步定义更详细的身体部位模式。接下来几页，我们将从沿前后轴模式化发育中的果蝇胚胎和幼虫的分子机制开始，再探讨沿背腹轴的模式化过程。

= 三组基因控制果蝇沿前后轴的分节 =
昆虫的身体沿其前后轴被划分为一系列体节。这些体节是同一主题的变奏重复：每一节都形成高度特化的结构，但都遵循相似的基本构建方案（图21-17）。在早期胚胎中，由卵极性基因沿前后轴建立的转录调节因子梯度是体节形成的序曲。这些调节因子启动分节基因的有序转录，通过精确调控基因表达模式来界定各个体节的边界和基本布局。分节基因在胚胎细胞亚群中表达，其产物是胚胎自身基因组对胚胎发育的首批贡献之一；因此被称为合子效应基因，以区别于更早起作用的母体效应基因。分节基因的突变可能改变体节的数量或其基本内部结构。

根据突变表型，分割基因可分为三类（图 21-18）。尽管三类基因的功能在时间上存在重叠，但将其视为按序作用更为便捷。最先表达的是一组至少包含六个间隙基因，其产物标记出胚胎头尾轴的粗略分区。间隙基因突变会导致相邻体节群缺失：例如 Krüppel 突变体幼虫缺失八个体节。随后表达的是八对规则基因，这些基因的突变

图 21-17 果蝇体节的形成过程。(A) 3 小时胚胎（侧视图）处于囊胚期，虽不可见分节结构，但可绘制命运图谱显示未来分节区域（彩色标注）。(B) 10 小时时所有体节清晰可辨（T1：第一胸节；A1：第一腹节）。参见视频 21.3。(C) 果蝇幼虫体节及其与胚胎区域的对应关系。(D) 果蝇成体体节及其与胚胎区域的对应关系。

图 21-18 影响卵极性基因和三类分节基因突变的表型示例。每种情况下，正常幼虫（左侧）绿色阴影区域在突变体（右侧）中被删除或被未受影响区域的镜像复制所替代。（改编自 C. Nüsslein-Volhard 和 E. Wieschaus，《自然》287:795-801, 1980。）

导致一系列影响交替体节的缺失，使胚胎仅保留正常数量一半的体节；尽管所有突变体都呈现这种两节周期性，但它们在具体模式上存在差异。最后，至少有10个节极性基因，其突变会产生正常数量的体节，但每个体节的部分区域被删除，并由其余全部或部分体节的镜像复制所替代。

各类分节突变体的表型表明，分节基因形成了一个协同系统，将胚胎沿前后轴逐步细分为越来越小的区域，每个区域通过不同的基因表达模式加以区分。分子遗传学有助于揭示这一系统的工作机制。

= 基因调控相互作用的层级细分果蝇胚胎 =
与 Bicoid 类似，大多数分节基因编码转录调节因子。通过比较正常与突变胚胎中的基因表达，可以解读这些基因受卵极基因调控的方式及其相互之间以及对其他基因的作用。利用适当探针检测 RNA 转录本或其蛋白质产物，可观察到基因以变化模式开启和关闭。这些模式揭示了形态均一的胚胎内部通过卵极基因网络产生的丰富空间信息。通过比较不同突变体中的这些模式，人们得以开始辨识整个基因控制系统的逻辑规则。

卵极性基因的产物为早期胚胎提供了全局位置信号（见图 21-16）。正如我们所知，Bicoid 蛋白作为形态发生素，在前后轴不同位置激活不同的基因组合：某些间隙基因仅在高浓度 Bicoid 区域被激活，而其他基因则在 Bicoid 浓度较低区域表达。虽然仅有六个间隙基因，但通过表达区域的重叠组合及其在各自域内的浓度差异，为前后轴上的每个细胞提供了丰富多样的位置身份标识。当间隙基因产物通过相互抑制表达完成位置精确定位后，它们形成了第二层级的位置信号系统，这些信号在更局部范围内调控胚胎图式的精细结构。通过如第 7 章讨论的配对规则基因 Even-skipped 所展现的组合效应（参见 423-424 页），间隙基因控制着配对规则基因的表达。配对规则基因进而划分出

图 21-19 果蝇胚胎前后轴模式形成的调控层次。卵极性基因定义了前后轴，并启动了三组基因（间隙基因、配对规则基因和体节极性基因）的表达，从而创建体节。每个体节的身份由 Hox 基因（稍后讨论）指定，其表达受卵极性基因和分节基因的共同输入调控。照片展示了各类基因代表性样本的 mRNA 表达模式。（由 Stephen Small 提供。）

这些重复的细胞群随后将形成体节，并相互协作，同时与间隙基因协同作用，建立起节段极性基因表达的规则周期性模式，这些基因定义了每个独立体节的内部结构模式（图21-19）。

节段极性基因中的大部分子集编码两种信号通路的组成成分——Wnt 通路和 Hedgehog 通路，包括分泌型信号蛋白 Wingless（Wnt 家族首个被命名的成员）和 Hedgehog。（Hedgehog 通路最初通过果蝇体节研究被发现，其名称源于 Hedgehog 突变体胚胎表面棘刺状的外观。）Wingless 和 Hedgehog 在不同细胞带中合成，这些细胞带在每个体节内充当信号中心。这两种蛋白质在调节邻近细胞中 Engrailed 等基因表达的同时，相互维持对方的表达（图 21-20）。通过这种方式，一系列连续诱导在每个体节内形成了精细的基因表达模式。

图 21-20 Hedgehog 与 Wingless 表达的相互维持机制。Engrailed 是一种转录调节因子（蓝色），驱动 Hedgehog 的表达。Hedgehog 编码分泌蛋白（红色），激活邻近细胞的信号通路，从而促使这些细胞表达 Wingless 基因。反过来，Wingless 编码分泌蛋白（绿色），作用于表达 Wingless 细胞的邻近细胞，维持其 Engrailed 的表达。随后 Engrailed 维持 Hedgehog 的表达，形成完整循环。如图所示，该网络沿果蝇前-后轴重复出现。（基于 S. DiNardo 等人，《当代遗传学与发育观点》4:529-534, 1994。）

= 卵极性基因、间隙基因和配对规则基因建立瞬时模式，该模式由体节极性基因和 Hox 基因记忆 =
间隙基因和对规则基因在受精后的最初几小时内被激活。它们的 mRNA 产物最初出现的模式仅大致接近最终图案；随后，在短时间内，这种模糊的初始模式会自行调整成一个规则、清晰定义的条纹系统。但这一模式本身并不稳定且短暂：随着胚胎经历原肠胚形成及后续发育，该模式逐渐瓦解。然而，这些基因的作用通过诱导某些体节极性基因以及另一类称为 Hox 基因（稍后讨论）的表达，传递了其表达模式的持久记忆。经过一段由细胞间相互作用介导的模式精细化过程后，这些新模式基因的表达模式得以稳定，提供位置标签，用以维持幼虫和成虫果蝇的体节组织结构。

片段极性基因 Engrailed 提供了一个很好的例证。其 RNA 转录物在细胞囊胚层中形成 14 条带状结构，每条带宽约一个细胞。这些条纹紧邻另一个片段极性基因 Wingless 的类似表达条纹前方。随着发育胚胎中细胞持续分裂和移动，表达 Wingless 的细胞与表达 Engrailed 的细胞之间的信号传导维持着它们表达的狭窄条纹（见图 21-20）。这种相互作用触发了一个稳定的 Engrailed 表达模式，该模式将在果蝇整个生命周期中持续存在，远早于诱导和细化该模式的信号消失之后。胚胎、幼虫和成虫的体节边界都将形成于每个 Engrailed 条纹的后缘（图 21-21）。

除了调控体节极性基因外，配对规则基因的产物还与间隙基因产物协同作用，诱导另一组基因——Hox 基因（见图 21-19）的精确定位激活。正是 Hox 基因首先定义并永久区分各个体节。在下一节中，我们将详细研究这些重要基因；我们将看到这一作用在包括人类在内的众多动物中都具有关键意义。

= Hox 基因永久塑造前后轴模式 =
随着动物发育的推进，身体结构变得越来越复杂。但无论在哪个物种、哪个组织层面，我们反复发现复杂结构都是通过重复几个基本主题并加以变异而形成的。因此，肌肉细胞或成纤维细胞等基本分化细胞类型的子集会在不同部位重复出现，并组织成肌肉或肌腱等组织。模式形成机制在实施方式和位置上的微妙变异决定了牙齿或指趾等结构的构建方式，从而产生臼齿与门齿、手指与拇指及脚趾的差异。

无论我们在何处观察到这种调制性重复现象，都可以将发育生物学家的问题分解为两类：给定类别中所有对象共有的基本构建机制是什么？以及该机制如何被修饰以产生不同动物中观察到的变异？昆虫体节为此提供了绝佳范例。至此我们已概述了单个体节原基的构建方式，以及每个体节内细胞如何彼此分化。现在我们将探讨一个体节如何被决定或特化为不同于其他体节。

对该问题的初步解答出现在80多年前，随着果蝇中一系列突变体的发现，这些突变导致成虫组织结构出现奇异紊乱。例如在触足突变体中，腿部从头部触角位置生长而出；而在双胸突变体中，本应是小平衡棒的部位却出现了额外一对翅膀的部分结构（图21-22）。这些突变将身体部位转化为其他位置应有的结构，并且

图 21-21 分节极性基因 Engrailed 的表达模式。图示为 10 小时胚胎及成虫（制备时已去除翅膀）中 Engrailed 基因的表达模式。该模式通过构建果蝇品系呈现：将 Engrailed 基因的调控序列与报告基因 LacZ 的编码序列连接，通过针对 LacZ 的免疫组化产生的棕色产物（10 小时胚胎）或 LacZ 催化反应生成的蓝色产物（成虫）进行组织化学检测。值得注意的是，Engrailed 的表达模式标记了体节边界，且一旦确立便在整个生命周期中持续保持。（由 Tom Kornberg 提供。）

图 21-22 同源异型突变。超双胸基因（Ultrabithorax，简称 Ubx）是双胸基因复合体（一种 Hox 基因簇）中的三个基因之一。Ubx 负责第二胸节（具翅胸节）与第三胸节（具平衡棒胸节）之间的所有差异。（A 和 B）Ubx 功能缺失突变将具平衡棒的胸节（A）转化为具翅胸节，导致果蝇出现四翅表型（B）。（C）在第二胸节中 Ubx 功能获得性突变将该具翅胸节转化为具平衡棒胸节，导致果蝇无翅。（A 由加州理工学院档案馆提供；C 由 L.S. Shashidhara 提供。）

这些突变被称为同源异型突变（源自希腊语 homotos，意为“相似”），因为其转化发生在具有明显相似通用类型的结构之间，将一种附肢或体节转变为另一种。最终研究发现，整套同源异型选择基因（即 Hox 基因）能够永久性指定动物所有体节的前后轴特征。这些基因作为多基因家族成员彼此相关。

果蝇体内有八个 Hox 基因，它们分别位于被称为双胸复合体和触角足复合体的两个基因簇中。双胸复合体中的基因控制着身体腹部和胸节之间的差异，而触角足复合体中的基因则调控胸部与头节的分化。与其他物种的比较表明，这些基因基本上存在于所有动物体内，包括人类。这些比较还揭示，触角足复合体和双胸复合体实际上是一个完整实体——即 Hox 复合体——被分割的两部分，该复合体在果蝇进化过程中发生分裂，其成员通过协同作用实现对身体从头到尾发育模式的调控。

Hox 基因的产物——Hox 蛋白——是转录调节因子，均包含一个高度保守的、由 60 个氨基酸组成的 DNA 结合同源结构域（参见第 404 页）。编码同源结构域的 DNA 序列被称为"同源框"，Hox 复合体正是通过缩写这一术语得名。虽然存在许多含同源框的基因，但只有位于 Hox 复合体中的基因才被称为 Hox 基因。

= Hox 蛋白赋予每个体节独特性 =
Hox 蛋白可视为每个体节细胞所携带的分子地址标签：这些标签赋予各区域细胞位置值，即根据细胞位置不同而具有的内在特性。若发育中的果蝇体节地址标签被改变，该体节会表现出仿佛位于其他位置的行为；若胚胎中所有 Hox 基因被删除，幼虫的身体节段将全部趋于相同。

粗略地说，每个 Hox 基因通常在其突变或缺失会导致发育异常的区域表达。每个 Hox 蛋白如何赋予体节永久身份？需知 Hox 蛋白作为转录调节因子，能够结合基因调控 DNA；每种 Hox 蛋白会激活或抑制不同的靶基因组合。数百个基因受此类 Hox 调控影响，包括控制细胞间信号传导、转录调控、细胞极性、细胞粘附、细胞骨架功能、细胞生长与细胞死亡的基因，这些机制共同赋予每个体节独特的 Hox 依赖性特征。

= Hox 基因的表达遵循其在基因簇中的排列顺序 =
那么 Hox 基因自身的表达是如何调控的呢？果蝇八个 Hox 基因的编码序列散布在数量庞大的调控 DNA 中，这些 DNA 包含结合位点用于

图 21-23 Hox 复合体基因表达模式与其染色体位置对比。（A）果蝇胚胎在所谓胚带收缩阶段的示意图，约为受精后 10 小时，此时发育中的体轴自身折叠。（B）通过原位杂交技术，使用不同标记探针对此阶段胚胎进行染色，以不同颜色检测不同 Hox 基因的 mRNA 产物。（C）照片中的空间分布模式与染色体复合体两个分区中的基因序列基本对应，仅存在微小偏差。（B 图由 William McGinnis 提供，改编自 D. Kosman 等人《科学》305:846, 2004。经美国科学促进会许可。）

卵极性基因和分节基因的产物，从而充当所有这些转录调控因子所提供的详细空间信息的解释器。最终结果是特定的一组 Hox 基因沿着前后体轴在特定区域进行转录。

Hox 基因的表达模式展现出显著的规律性，暗示存在额外的调控形式。无论是在触足复合体还是双胸复合体中，基因沿染色体的排列顺序几乎完全对应着它们沿身体前后轴表达的顺序（图 21-23）。这提示某种基因激活过程——可能依赖于染色质结构沿 Hox 复合体的传递，按照染色体上的顺序逐个启动 Hox 基因。细胞中表达的"最末端"Hox 基因通常占据主导地位，抑制"前端"基因的表达与活性，并决定体节特征。这些现象背后的基因调控机制尚未完全阐明，但其影响深远。我们将看到，Hox 复合体中基因表达的序列组织是在动物进化过程中高度保守的基本特征。

= Trithorax 和 Polycomb 组蛋白通过调控 Hox 表达来维持位置信息的永久记录 =
Hox 复合体中基因表达的空间模式由发育早期作用的信号设定，但其影响持久不衰。尽管随着发育进程，表达模式会经历复杂调整，但 Hox 模式为每个细胞及其所有后代烙上了永久印记——记录该细胞在早期胚胎中所处的头尾轴向位置。通过这种方式，每个体节的细胞都保持着沿身体头尾轴位置的记忆，这种记忆不仅决定了幼虫体节的特定身份，也主导着成年果蝇各结构的节段特异性。

两种分子机制确保细胞记住其位置信息。一种来自 Hox 基因本身：许多 Hox 蛋白能自动激活自身基因的转录，从而帮助这些基因无限期保持开启状态。另一个关键输入来自两组大型互补蛋白——Trithorax 组蛋白和 Polycomb 组蛋白，它们通过在 Hox 复合物的染色质上留下胚胎激活或抑制状态的可遗传印记来实现记忆功能。这些是染色质结构的关键通用调节因子，对细胞记忆至关重要：若 Trithorax 或 Polycomb 组蛋白的基因存在缺陷，Hox 基因的表达模式最初能正确建立，但随着细胞分裂和胚胎发育，这种模式无法得到正确维持。

这两组调节因子以相反方式发挥作用。Trithorax 组蛋白对于在细胞中维持 Hox 基因的转录是必需的，当这些

图 21-24 Polycomb 群基因的作用。（A）野生型果蝇胚胎的暗场显微镜照片。（B）来自缺乏 Extra sex combs（Esc）基因母体的该基因缺陷突变型胚胎照片。该基因属于 Polycomb 群。几乎所有体节都转化为类似最末端腹节 A8 的结构。突变体中，最初大致正常的同源异型选择基因表达模式变得不稳定，导致这些基因很快沿整个体轴全面激活。（摘自 G. Struhl，《自然》293:36-41，1981 年由自然出版集团出版。经 SNCSC 许可复制。）

转录功能已经启动。相比之下，多梳群蛋白形成稳定复合体，结合到 Hox 复合体的染色质上，并在那些尚未激活 Hox 基因的细胞中维持抑制状态（图 21-24）。虽然最初因对果蝇 Hox 基因的影响而被发现，但多梳和三胸群蛋白是染色质结构的通用调节因子，控制着植物和动物中许多基因的表达。关于染色质如何存储发育细胞记忆的讨论详见第 4 章和第 7 章。

= 背腹信号基因创建转录调节因子 Dorsal 的梯度 =
现在我们转向果蝇胚胎第二条主要轴的图式形成。与刚才讨论的沿前-后轴的图式形成类似，沿背腹（D-V）轴的图式形成始于卵中界定该轴的母源基因产物（参见图 21-16），随后通过合子基因产物进一步细分胚胎中的背腹轴。

最初，由母体体细胞在胚胎未来腹侧区域下方产生的一种蛋白质，导致卵膜腹侧局部激活一种名为 Toll 的跨膜受体。（有趣的是，果蝇 Toll 与脊椎动物 Toll 样蛋白同样参与先天性免疫反应，详见第 24 章讨论。）Toll 的局部激活调控了 Dorsal 的分布，这是一种转录调节因子，属于第 15 章讨论的 \mathrm{NF}\kappa \mathrm{B} 家族。Dorsal 受 Toll 调控的活性，类似于 \mathrm{NF}\kappa \mathrm{B} ，依赖于 Dorsal 蛋白从细胞质（在此以非活性形式存在）向细胞核（在此调节基因表达）的转运（见图 15-63）。在新产下的卵中，Dorsal mRNA 和蛋白质均均匀分布于细胞质内。当合胞体囊胚层中的细胞核迁移至胚胎表面后，但在细胞化之前（见图 21-14），腹侧 Toll 受体的激活引发了 Dorsal 蛋白的显著重新分布。在背侧，该蛋白质保留在细胞质中，但在腹侧则集中于细胞核内，两者之间存在平滑的核定位梯度（图21-25）。

图 21-25 囊胚层细胞核中 Dorsal 蛋白的浓度梯度。在野生型果蝇胚胎中，该蛋白质存在于背侧细胞质而缺失于背侧细胞核；垂直方向上，其在细胞质中减少并在细胞核中富集。在 Toll 通路被全面激活而非仅限于腹侧的突变体中，Dorsal 蛋白在所有区域均集中于细胞核，导致胚胎腹侧化。相反，在 Toll 信号通路失活的突变体中，Dorsal 蛋白在所有区域均滞留于细胞质而缺失于细胞核，导致胚胎背侧化。（引自 S. Roth 等人，《细胞》59:1189-1202, 1989。经爱思唯尔许可使用。）

类似于 Bicoid 在 A-P 轴上的作用，Dorsal 蛋白沿 D-V 轴充当形态发生素。一旦进入细胞核，Dorsal 蛋白会根据其浓度开启或关闭不同基因组的表达。每个响应基因的表达取决于其调控 DNA——特别是该 DNA 所含的 Dorsal 及其他转录调节因子结合位点的数量和亲和力。通过这种方式，调控 DNA 解读由核内 Dorsal 蛋白梯度提供的位置信号，从而界定出独特的 D-V 系列区域——贯穿胚胎全长的互补细胞带。在最腹侧（核内 Dorsal 蛋白浓度最高处），它会启动例如 Twist 基因的表达，该基因主导中胚层命运；而在最背侧（核内 Dorsal 蛋白浓度最低处），细胞则启动名为 Decapentaplegic 的基因表达。而在一个中间区域，背侧蛋白的核浓度高到足以抑制 Dpp ，但又低到无法激活 Twist 时，细胞会启动另一组基因，包括一个名为短原肠形成蛋白(Sog)的基因（图 21-26A）。

由背侧蛋白直接调控的基因产物继而产生更多局部信号，这些信号沿背腹轴定义了更精细的亚分区。这些信号在细胞化后发挥作用，以传统细胞外可扩散蛋白的形式存在。特别是， Dpp 编码一种分泌型 \mathrm{TGF}\beta 家族蛋白，它在胚胎背部形成局部形态发生素梯度。在 Dpp 腹侧产生的 Sog 编码另一种分泌蛋白，通过结合并阻止 Dpp 激活其受体，作为 Dpp 蛋白的拮抗剂。这两种信号蛋白的对向扩散梯度形成了陡峭的 Dpp 活性梯度：最高的 Dpp 活性水平与其他特定因子共同作用，最终发育出最背部的组织——

图 21-26 形态发生素梯度如何指导果蝇胚胎背腹轴的模式形成过程。（A）最初，Dorsal 蛋白梯度定义了三个广泛的基因表达区域，此处通过三个代表性基因的表达来标示：Dpp , Sog，以及Twist。（B）稍后阶段，表达Dpp和Sog的细胞分别分泌信号蛋白Dpp（一个 TGF）\beta家人）以及Sog（一种拮抗剂Dpp随后，这两种蛋白质扩散并相互作用（并与某些其他因子共同作用），形成了所示的背腹（D-V）区域。

胚外膜。中等水平的 Dpp 活性导致背侧表皮发育；而在表达 Sog 的细胞中缺乏 Dpp 活性则允许神经源性外胚层发育，该结构将形成神经系统（图 21-26B）。

= 诱导相互作用的分级体系细分脊椎动物胚胎 =
果蝇发育的分子遗传学分析揭示了转录调控因子与信号通路级联如何逐级细分胚胎。这种渐进式图式精细化原理适用于所有动物胚胎（包括脊椎动物）的发育过程。值得注意的是，这种保守性不仅限于图式形成的总体策略，还延伸至许多相关分子。

如前所述，脊椎动物发育的最早阶段具有惊人的变异性，即使在近缘物种间也是如此，甚至很难准确说明早期果蝇胚胎的前后轴和背腹轴与早期青蛙或小鼠胚胎的对应关系如何。然而我们将看到，在这种进化可塑性的展示中，早期发育的某些特征实际上高度保守。后期发育阶段同样如此，其保守程度往往令人惊叹。从我们自身的解剖结构来看，人类显然是鸟类和鱼类的近亲。但通过分子机制观察，我们发现与果蝇和蠕虫也存在亲缘关系。

在接下来的篇幅中，我们将讨论信号分子与转录调节因子如何通过相互作用塑造脊椎动物胚胎的发育模式。我们首先以两栖动物为例，以非洲爪蟾为模型探讨胚胎轴的形成与模式建立。本章前文已对此主题有所涉及，此处我们将延续这一脉络，并与果蝇发育进行对比分析。

如前所述，青蛙胚胎轴及三个胚层的起源可追溯至囊胚阶段（见图 21-3A）。通过标记单个囊胚细胞，我们可以追踪细胞经历的所有分裂、转化与迁移过程，观察它们最终形成的结构及其来源。外胚层、中胚层和内胚层的前体细胞沿囊胚的动物-植物极轴有序排列：内胚层源自最靠近植物极的囊胚细胞，外胚层源自最靠近动物极的细胞，而中胚层则来源于中间区域的细胞。在这些区域内，细胞根据其在后期胚胎背腹轴上的位置具有不同的命运走向：外胚层中，表皮前体细胞位于腹侧，未来神经元则分布于背侧；中胚层中，脊索、肌肉、肾脏和血液的前体细胞按背腹方向依次排列。所有这些可通过命运图谱来呈现，该图谱揭示了后期各类细胞分别源自早期胚胎的哪些区域（图 21-27）。命运图谱向我们提出了核心问题：位于不同位置的细胞是如何被引导向各自特定命运发展的？我们已经解释了母源因子如何在发育中的蛙卵中确定其动物-植物轴，以及受精引发的皮层旋转如何确定背腹轴的定向（见图21-13）。但是，轴的建立如何进一步导致胚胎细分为未来的身体部分呢？

答案是母源基因产物导致在胚胎的植物侧和背侧形成信号中心。特别是背侧信号中心在发育生物学史上占有特殊地位。二十世纪初的实验发现，这是一小簇具有非凡特性的细胞：当这些细胞被移植到相对位置时，它们能引发邻近组织的彻底重组，导致形成第二个完整的身体轴（图21-28）。这个被称为"组织者"的信号中心的发现，开创性地揭示了建立脊椎动物身体框架的诱导相互作用链。

图21-27 青蛙胚胎的囊胚命运图谱。内胚层来源于最靠近植物极的卵裂球（黄色），外胚层来源于最靠近动物极的卵裂球（蓝色），而中胚层则来源于中间区域的卵裂球（绿色），这些细胞也会贡献于内胚层和外胚层的形成。不同类型的细胞源于背腹轴上的不同位置。

图 21-28 组织者诱导次级轴的形成。通过将取自另一同期胚胎背部特定区域（称为组织者区）的一小簇细胞移植到两栖动物胚胎中，移植体发出的信号会调控宿主胚胎邻近细胞的行为，导致连体双胞胎的形成。参见视频 21.4。[改编自 J. Holtfreter 与 V. Hamburger，载于《发育分析》（B.H. Willier, P.A. Weiss 与 V. Hamburger 编），第 290-296 页，费城：桑德斯出版社，1955 年。]

与果蝇合胞体胚胎不同，受精的蛙卵经历常规的卵裂分裂，形成由数千个细胞组成的胚胎。因此，胚胎的模式形成必须通过细胞间扩散的胞外信号分子来介导，而非通过合胞体细胞质中移动的转录调节因子。不足为奇的是，如今已知组织者是分泌信号的主要来源。正如我们将要看到的，这不仅包括结合并激活跨膜受体的配体（参见第15章），还包括抑制这些配体活性的分泌蛋白。

= 分泌信号蛋白之间的竞争塑造了脊椎动物胚胎轴的模式 =
沿动物-植物极（A-V）轴模式化青蛙胚胎的信号分子属于 \mathrm{TGF\beta} 家族：它们由植物极的信号中心分泌，并沿 A-V 轴形成浓度梯度。这些 Nodal 蛋白的作用范围相对较短：最靠近植物极的细胞暴露于高水平信号，通过启动促进内胚层发育的基因作出响应；距离较远的细胞则暴露于较低水平，激活促进中胚层形成的基因。产生 Nodal 的植物极细胞同时产生第二种扩散更快的蛋白质 Lefty，该蛋白可拮抗 Nodal。动物极区域 Lefty 与 Nodal 的高比例使 Lefty 能够阻断 Nodal 信号传导，导致该处细胞发育为外胚层（图 21-29A）。因此，Nodal 的中程激活作用与 Lefty 的长程抑制作用相结合，沿 A-V 轴建立了内胚层、中胚层和外胚层这三个胚层的祖细胞分布模式。

青蛙采用一种略有相关的策略，沿着胚胎的背腹轴细分胚层区域。它依赖于对''骨形态发生蛋白'' （''BMPs''；属于另一个 TGF-β家族亚类成员）的模式化抑制，这些蛋白在整个胚胎中分泌。背侧信号系统通过分泌包括乔丁蛋白和诺金蛋白在内的多种蛋白质发挥作用，当这些蛋白质自身浓度较高时，会阻断 BMP 信号传导。通过这种方式，乔丁和诺金形成了 BMP 的背腹梯度，背侧活性低而腹侧活性高（图 21-29B）。经历高水平 BMP 信号传导的外胚层细胞被推向表皮命运，而几乎或完全没有 BMP 信号传导的细胞则保持神经特性。值得注意的是，这种通过 BMP 家族信号与可扩散抑制剂的对抗梯度来模式化背腹轴的策略，与果蝇中所采用的策略相似，且实际使用的特定分子具有同源性。

图 21-29 Nodal 与骨形态发生蛋白（BMP）信号如何调控胚胎轴向模式。Nodal 及其拮抗剂 Lefty 塑造动物-植物轴向模式，而 BMP 及其拮抗剂 Chordin 与 Noggin 则调控背腹轴向模式。（A）在动物极区域，Nodal 水平相对于 Lefty 较低，Lefty 阻遏 Nodal 与其受体结合。在植物极区域，Nodal 过量表达导致其信号通路激活。（B）沿背腹轴方向，BMP 广泛存在但 Chordin 与 Noggin 集中于背侧，通过结合 BMP 阻遏其与受体相互作用。图示底部展示了 Nodal 与 BMP 活性模式的最终空间分布。

了解指定脊椎动物体内三个胚层及各种组织类型的信号后，便可在培养皿中重现这一分化过程。例如，取自胚胎动物极区域的蛙细胞，若通过暴露于中等浓度 Nodal 信号和高浓度 BMP 信号改变其原有发育路径，便会分化为血液（一种腹侧中胚层组织）。同样地，通过将小鼠或人类胚胎干细胞在培养环境中暴露于适当的信号分子组合，也能诱导其生成特定细胞类型。如此，通过对动物发育研究获得的洞见，可用于再生医学所需细胞类型的制备，我们将在下一章讨论这一点。

= Hox 基因控制脊椎动物前后轴发育 =
果蝇与脊椎动物之间发育机制的保守性远不止于背腹侧信号系统。Hox 基因几乎存在于所有被研究的动物物种中，且通常以类似昆虫 Hox 基因复合体的形式成簇存在。例如，小鼠和人类拥有四个这样的复合体——分别称为 HoxA、HoxB、HoxC 和 HoxD 复合体——每个位于不同的染色体上。通过序列比对可以识别每个复合体中单个基因与果蝇 Hox 基因家族特定成员的对应关系。事实上，哺乳动物的 Hox 基因在果蝇体内能部分替代相应果蝇 Hox 基因的功能。大致而言，哺乳动物的四个 Hox 复合体各自都相当于一个完整的昆虫 Hox 复合体（即触足复合体加双胸复合体）（图 21-30）。

每个脊椎动物 Hox 复合体中的基因排列顺序与昆虫 Hox 复合体基本相同，这表明所有四个脊椎动物复合体都起源于脊椎动物和昆虫共同祖先中存在的单一原始复合体的复制，并保留了其基本组织结构。最具说服力的是，每个脊椎动物 Hox 复合体的成员沿着胚胎轴线从头到尾依次表达，正如在果蝇中所见。与果蝇类似，脊椎动物 Hox 基因的表达模式通常与脊椎动物的体节相对应。这种对应关系在后脑区域尤为明显（见图 21-30），该区域的节段被称为菱脑节。

脊椎动物 Hox 基因的产物——Hox 蛋白，负责指定控制后脑、颈部和躯干（以及身体其他某些部位）前后轴向模式的位置值。与果蝇相似，当后部 Hox

图 21-30 昆虫与哺乳动物 Hox 基因复合体对比及其与身体区域的关系。果蝇触角足复合体和双胸复合体基因按染色体顺序展示于首行（参见图 21-23）。四个哺乳动物 Hox 复合体的对应基因同样按染色体顺序排列于下方。通过上方和下方动物示意图中的颜色简化展示了基因在果蝇与哺乳动物体内的表达区域，呈现出显著平行性。但具体表达模式会随发育阶段变化，且不同哺乳动物 Hox 复合体间存在细微差异。此外，许多标注为前部区域表达的基因也会在后部区域表达，与更靠后的 Hox 基因表达域存在重叠。

这些复合体被认为经历了如下演化过程：首先，在蠕虫、果蝇和脊椎动物的某个共同祖先中，一个原始的同源异型选择基因经过多次复制，形成了一连串串联排列的此类基因——即祖代的 Hox 复合体。在果蝇谱系中，这个单一复合体分裂成了独立的 Antennapedia 复合体和 Bithorax 复合体。与此同时，在向哺乳动物演化的谱系中，整个复合体经历了多次复制，形成了四个 Hox 复合体。这种平行演化并非完美无缺，因为显然有些基因被复制而其他基因则丢失了。自复合体分化以来，还有一些基因被征用服务于不同目的（顶行括号内的基因）。（基于威廉·麦金尼斯提供的示意图。）

若将基因人为表达于前部区域，它能将前部组织转化为后部特性。相反，后部 Hox 基因的缺失会使它们通常表达的后部组织呈现前部特征（图 21-31）。由于四个 Hox 基因簇中基因功能存在重叠，小鼠 Hox 突变体中观察到的转化现象并不像果蝇中那样直接明了，且往往是不完全的。尽管如此，显然果蝇和小鼠使用基本相同的分子机制，在至少一部分前-后轴线上赋予连续区域以个体特征。

= 某些转录调节因子能激活定义细胞类型或构建完整器官的程序 =
正如存在指定身体特定区域身份的单个基因，也存在一些基因，其产物可作为特定细胞类型乃至特定器官发育的触发器，启动并协调所需的整个复杂基因表达程序。MyoD 即为一例

图 21-31 Hox 基因对小鼠前后轴模式的控制。（A 和 B）正常小鼠（野生型）具有约 65 块椎骨，其结构根据沿身体轴线的位置而不同：7 块颈椎（颈部）、13 块胸椎（带肋骨）、6 块腰椎（B 图中黄色星号标注区域）、4 块骶椎（B 图中红色星号标注区域）以及约 35 块尾椎（尾部）。A 图展示侧视图，B 图展示背视图；为清晰起见，两图中均移除了四肢。（C）HoxA10 基因通常在腰椎区域表达（与其同源基因 HoxC10 和 HoxD10 共同作用）；本实验中该基因被人为地在发育椎体组织中全轴表达。其结果是，颈椎和胸椎全部转化为无肋骨的腰椎特征。（D）相反，当同时敲除 HoxA10、HoxC10 和 HoxD10 基因时，本应具有腰椎或骶椎特征的椎骨会转而呈现带肋骨的胸椎特征。（A 和 C 图源自 M. Carapuco 等，《基因与发育》19:2116-2121, 2005，经冷泉港实验室出版社许可使用；B 和 D 图源自 D.M. Wellik 和 M.R. Capecchi，《科学》301:363-367, 2003。）经美国科学促进会许可。)

我们在第 7 章中遇到的转录调节因子家族。这些蛋白质驱动细胞分化为肌肉细胞，表达肌肉特异性肌动蛋白和肌球蛋白，以及肌肉细胞所需的所有其他特殊细胞骨架、代谢和膜蛋白。类似地，Achaete/Scute 家族的转录调节因子成员驱动细胞成为神经祖细胞。在这两个例子中，这些蛋白质都属于螺旋-环-螺旋（HLH）类转录调节因子（见第 405 页），其他几种诱导特定细胞类型分化的蛋白质也是如此。这些主转录调节因子通过结合基因组中的多个不同调控位点，从而控制大量下游靶基因的表达，发挥其强大的分化诱导活性。在一个经过充分研究的案例中，即 Achaete/Scute 家族成员 Atonal 同源物 1（Atoh1）的研究表明，其在小鼠基因组中的直接靶基因数量超过 600 个。然而，值得注意的是，即便是如此强大的细胞分化驱动因子，其作用效果也可能因作用细胞的具体环境和历史背景而有天壤之别：例如，Atoh1 在大脑中驱动特定类型神经元的分化，在内耳中促进感觉毛细胞的生成，并在肠道内壁推动分泌细胞的形成。

编码转录调节因子的其他基因能够驱动构成整个器官的多种细胞类型的形成与组装。一个著名的例子是转录调节因子 Eyeless（见图 21-2）。当该基因在果蝇腿部前体细胞群中被人工表达时，腿部会发育出结构完整的类眼器官，其中各种眼细胞类型排列正确；反之，若缺失 Eyeless 基因，则会导致果蝇失去眼睛。此外，脊椎动物中 Eyeless 的同源基因 Pax6 缺失同样会造成眼部结构缺失——携带 Pax6 突变的人类会表现出先天性无虹膜症（图 21-32）。类似的器官选择蛋白也存在于前肠、心脏、胰腺等其他器官中。它们都是主导转录调节因子，直接调控数百个靶基因，这些基因的产物进而特化并构建相应器官的不同组成部分。然而，如同 Atoh1 的例子所示，这些调节因子通常需要与特定搭档蛋白协同作用才能发挥特异性效应，而这些搭档蛋白仅在其早期发育过程中经过适当预处理的细胞中表达。

= Notch 介导的侧向抑制机制优化细胞间距模式 =
在基本体型结构建立和器官前体生成之后，还需要经历许多模式精细化的步骤，才能实现组织和器官中终末分化细胞的成熟模式。侧向

图 21-32 Pax6 蛋白（在果蝇中亦称为无眼蛋白）控制多种动物物种光感受器官的发育。携带 Pax6 基因突变的果蝇或人类会缺失正常动物所具有的某些眼部结构。[果蝇图片由 Katy Ong 提供；人类图片引自 N.L. Washington 等，《公共科学图书馆·生物学》7(11):e1000247, 2009 年。]

抑制（参见图 21-10）通过 Notch 信号传导介导，对于所有动物各类组织中的细胞多样化及精细模式形成都至关重要。

某些组织需要在其范围内均匀分布特定类型的细胞，比如感觉细胞、分泌细胞或干细胞。果蝇感觉刚毛的发育就是一个很好的例子，这些刚毛最容易在果蝇背部观察到，但也存在于其大多数其他暴露表面。每一个感觉刚毛都是一个微型感觉器官，由一个感觉神经元和少量支持细胞组成。有些刚毛对化学刺激作出反应，而另一些则对机械刺激作出反应，但它们的构造方式相似（图21-33）。

先前提到的原神经基因 Achaete 和 Scute 标记了表皮细胞簇，这些细胞簇中将形成刚毛，但具体哪些细胞形成刚毛则取决于它们之间的竞争性相互作用。每个细胞簇内的信号传导会选择单一细胞——称为感觉器官前体细胞——作为刚毛的祖细胞。通过侧向抑制（见图 21-10），祖细胞与周围细胞区分开来，这一过程由 Notch 信号通路介导。当细胞簇中某个细胞表面的跨膜受体 Notch 与邻近细胞上的跨膜配体 Delta 结合时，会产生信号，抑制该细胞分化为感觉器官前体，并同时抑制其自身 Delta 的产生。最初，簇中的所有细胞都表达 Notch 和 Delta，并相互抑制分化。

图 21-33 果蝇机械感觉刚毛。(A) 左侧展示了刚毛四个细胞的谱系——均为单一感觉器官前体细胞的后代。感觉器官前体细胞一旦确定，便通过短暂的分裂周期程序产生这组细胞。在每一代子细胞中，侧向抑制机制再次运作，促使新生细胞走向不同命运：其中一个最终子细胞将分化为神经元；另一个形成刚毛杆；其余则分化为各类支持细胞。(B) 利用无意义基因荧光报告系统（粉红色）观察到的蛹表皮中感觉器官前体细胞的分布。(C) 成年果蝇胸部刚毛的排列模式。（B 和 C 由 François Schweisguth 提供。）

图 21-34 侧向抑制。（A）仅以两个相互作用细胞为例说明 Notch 介导的竞争性侧向抑制基本机制。灰色显示的蛋白质或效应线表示失活状态。（B）相同过程在更大细胞区域中的运作结果。最初，该区域内所有细胞均等效，通过 Delta-Notch 相互作用发出信号，阻止相邻细胞特化为感觉器官前体细胞。当某个细胞产生略强于邻细胞的 Delta 信号时，这种平衡抑制被打破：该细胞通过更强烈地抑制邻近细胞，使自身更坚定地朝向感觉器官前体命运发展。随着邻近细胞分化能力丧失，它们抑制其他细胞分化的能力也随之减弱。因此，侧向抑制使相邻细胞走向不同命运。虽然该相互作用被认为主要依赖于细胞间接触，但感觉器官前体细胞也能向超过一个细胞直径距离的细胞传递抑制信号；例如通过伸出长突起接触远端细胞。

然而，逐渐地，微小的信号差异会形成一个正反馈循环：产生稍强 Delta 信号的细胞既抑制邻近细胞分化，又减少其 Delta 蛋白的生成。这引发了一场竞争，最终单个感觉器官前体细胞胜出，向紧邻细胞发出强烈的抑制信号，自身却不接收此类反馈信号（图 21-34）。

感觉器官前体细胞会经历短暂的进一步分裂程序，生成构成最终刚毛的细胞群（参见图 21-33）。Notch 信号在该程序的连续阶段反复作用，推动感觉器官前体细胞的后代沿不同路径分化，并赋予它们各自特化的命运。但这一过程还需结合其他机制，这些机制能够影响由侧向抑制介导的竞争结果。正如我们将要讨论的，在感觉刚毛发育过程中，不对称定位于分裂细胞内部的 Determinants（细胞命运决定因子）正扮演着这样的角色。

= 细胞命运决定因子可被不对称遗传 =
细胞分化并不总是依赖于细胞外信号：在某些情况下，子细胞天生就存在差异，这是由于内在的不对称细胞分裂造成的，在此过程中，某些重要的分子集合在它们之间被不均等地分配。这种不对称分离的分子（或分子集合）随后通过直接或间接改变接收到它的子细胞内的基因表达模式，成为决定细胞命运的关键因素（见图 21-11）。分子不对称分离的一个典型例子发生在早期青蛙胚胎中：VegT RNA 特异性地定位于受精卵的植物极区域。经过卵裂分裂后，只有植物极细胞会继承 VegT RNA。

不对称分裂通常发生在发育初期，但在某些后期阶段也会出现。以成年果蝇刚毛为例（见图21-33），感觉器官前体细胞会经历一次

不对称细胞分裂产生两个子细胞：一个将生成外毛和套细胞，另一个则生成内神经元和鞘细胞。每种命运由一种名为 Numb 的蛋白质的差异遗传所决定，该蛋白质影响子细胞间基于 Notch 介导的侧向抑制决策。Numb 是一种抑制 Notch 信号传导的胞质蛋白，其在感觉器官前体细胞中的存在指定了“内部”前体细胞的命运。在此细胞分裂前，Numb 均匀分布于细胞皮层。随着有丝分裂纺锤体的形成，Numb 从靠近一个纺锤体极的皮层区域移位，限制其仅定位于另一极相邻的皮层区域（图 21-35）。这种限制依赖于第 16 章所述的 Par 蛋白复合物的极化活性（另见图 16-76）。当胞质分裂完成时，Numb 仅存在于两个子细胞中的一个，并在该细胞内抑制 Notch 信号传导——从而作为一种不对称分离的命运决定因子发挥作用。

Numb 在果蝇神经干细胞谱系的不对称分裂中以类似方式运作，产生大量且比例平衡的神经元和胶质细胞。神经祖细胞的不对称分裂也驱动脊椎动物大脑皮层中的神经发生。在这两种情况下，Notch 信号决定了更偏向祖细胞特性与更偏向分化命运之间的差异。

= 调控 DNA 的进化解释了许多形态差异 =
在前几节中，我们已经看到动物含有相同的基本细胞类型，具有相似的基因集合，并共享许多模式形成的分子机制。但如何将这些观点与我们在蠕虫、果蝇、青蛙和小鼠等形态各异的动物身体结构中观察到的根本差异相协调？我们先前曾概括性地断言，这些差异通常似乎反映了控制保守发育调控蛋白基本组的调控 DNA 差异。现在我们将更仔细地审视相关证据。

当我们比较具有相似基本身体构造的动物物种时——例如不同的脊椎动物，如鱼类、鸟类和哺乳动物——我们发现对应基因可能拥有相似的调控元件组合，这些元件在不同动物中具有保守性且可识别为同源结构。这一规律同样适用于不同种类的线虫或昆虫间的比较。然而，当我们将脊椎动物的调控区域与蠕虫或果蝇的调控区域进行比较时，很难发现任何此类相似性。蛋白质编码序列具有明显的相似性，但对应的调控 DNA 序列却显得截然不同，这表明身体构造的差异主要反映了调控 DNA 的差异。尽管蛋白质本身的变异也起作用，但即使蛋白质相同，调控 DNA 的差异已足以产生截然不同的组织和身体结构。

目前尚无法追溯导致动物惊人多样性的所有遗传步骤。它们的谱系已经分化了数亿年

图 21-35 不对称细胞分裂在果蝇刚毛谱系中产生不同的子细胞命运。（A）果蝇蛹内一个分裂中的感觉器官前体细胞图像。最初，Numb 蛋白（粉红色）均匀分布在细胞皮层周围，但在分裂中期会聚集到细胞一侧。细胞核 DNA 被染成蓝色。分裂导致 Numb 仅被分配到两个子细胞中的一个。（B）在这对子细胞中，不对称遗传的 Numb（未显示）阻止了左侧子细胞中的 Notch 信号传导；Notch 活性仅限于右侧子细胞，如 Notch 靶基因 Enhancer of Split m8 的报告基因（绿色）所示，该基因在细胞核（染成蓝色）中呈现为斑点状。（A 图来自 J.A. Knoblich, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:849-860, 2010；B 图由 François Schweisguth 提供）

经过数年的演变，大多数情况下发生了太多变化，以至于我们无法断言某一特征是由某一突变所致。然而，对于更近期的进化事件，情况则更为清晰。对形态各异的近缘动物种群和植物种群的研究表明，调控 DNA 的特定变化能够引发显著的发育效应。

一个被深入研究的例子是三刺鱼形态的多样性。海洋中的三刺鱼从其骨盆骨骼延伸出尖锐的刺棘，这些刺棘被认为有助于保护它们免受海洋中软口鱼类捕食者的侵害。约一万年前末次冰期结束后，部分海洋三刺鱼迁居到新形成的淡水溪流和湖泊中，这些水域通常缺乏此类捕食者。许多淡水三刺鱼种群在进化过程中逐渐失去了骨盆刺棘。这种不同形态的发展反映了对名为 Pitx1 的转录调节因子表达控制的差异。海洋三刺鱼在后肢芽细胞（这些细胞将发育成骨盆刺棘）中表达 Pitx1 基因，而淡水三刺鱼由于 Pitx1 基因位点的变化失去了这种表达。这些变化并不位于编码序列中，而是各自缺失了一小段调控 DNA 区块，这些区块专门控制骨盆细胞中的 Pitx1 表达（图 21-36）。

Pitx1 蛋白在鱼体其他部位具有重要功能，例如在颌部和垂体，这些功能必须保留。编码 Pitx1 蛋白的 DNA 序列，以及负责在这些其他身体部位实现组织特异性 Pitx1 表达的调控 DNA，在海鱼和淡水鱼中均得以保留。骨盆发育的进化

图 21-36 刺鱼形态多样性由调控元件变化引起。(A-D) 海生种群(A)具有骨盆棘刺，而某些淡水种群(C)则缺失。相应地，Pitx1 在海鱼(B)骨盆区域表达，在淡水鱼(D)中不表达。(E) 淡水种群骨盆区域缺乏表达是由于调控缺失移除了骨盆特异性增强子序列；这些缺失在不同种群中独立发生且长度各异。Pitx1 的编码序列及其他增强子和表达位点在海水与淡水刺鱼中均保守。(A-D，由 Michael D. Shapiro 提供)

图 21-37 移动遗传元件的插入促进了现代玉米的形成。现今的玉米植株最初由一种名为类蜀黍的野生植物（A）选育而来。这种野生祖先结有多个果穗，内含细小坚硬的种子。（B）相比之下，现代玉米结穗较少——但穗中含有大量饱满甜美的籽粒。在种子发育相关基因调控区域插入的移动遗传元件推动了这一演变。图中两种植物按相同比例绘制；为简化示意图，未展示叶片部分。

棘鱼案例揭示了我们在第七章（见图 7-31）讨论的调控 DNA 元件的模块化特性如何实现身体不同部位的独立演化——即使多个身体部位的形成依赖于相同的蛋白质。

在植物近期的进化过程中，其结构变化可通过类似调控 DNA 变化的方式进行追溯。农业领域的一个重要例证是：经过约一万年美洲原住民对自然遗传变异的选择，这类变化构成了野生类蜀黍植物与其现代后代玉米之间显著差异的主要成因（图 21-37）。

= 摘要 =
果蝇一直是研究动物发育遗传学的首要模式生物。其胚胎模式由称为卵极基因的母体效应基因产物启动，这些基因通过建立卵子和早期胚胎中转录调节因子的梯度分布发挥作用。例如沿前后轴（A-P 轴）分布的 Bicoid 蛋白梯度，有助于启动间隙基因、配对规则基因和分节极性基因的有序表达。这三类分节基因通过层级式相互作用，在胚胎特定区域选择性表达，将最初均匀的细胞场沿 A-P 轴逐步细分为一系列规则重复的模块化单元——体节。

叠加在每一体节重复出现的基因表达模式之上，Hox 基因的序列表达模式赋予每个体节不同的身份特征。这些基因成簇排列在复合体中，其序列顺序与它们沿身体前后轴线的表达顺序相一致。

尽管 Hox 基因的表达始于胚胎阶段，但其后续维持依赖于 Polycomb 和 Trithorax 组染色质结合蛋白的作用。这些蛋白分别在 Hox 复合体染色质上留下胚胎期抑制或激活状态的可遗传印记。与果蝇同源的 Hox 复合体几乎存在于所有动物类型中，协助塑造身体的前后轴线模式。

信号梯度同样沿背腹轴建立。最初，Toll 信号通路形成 Dorsal 蛋白的核梯度，进而诱导 TGFβ家族蛋白 Dpp 及其拮抗剂 Sog 的细胞外信号梯度。由此形成的 Dpp 活性梯度有助于精确分配背腹轴不同位置细胞的特性差异。

在非洲爪蟾中，卵子的极性和精子进入位点确立了胚胎轴。由 TGFβ家族蛋白 Nodal 产生的梯度沿动物-植物轴诱导不同命运，而分别与果蝇 Dpp 和 Sog 同源的 BMP 和 Chordin 蛋白则控制背-腹轴的模式形成。

转录调节因子控制特定细胞类型的形成。MyoD 家族成员驱动肌肉细胞决定过程，协调所需的多种组分，而 Achaete/Scute 转录调节因子则控制神经命运。其他编码这类主转录调节因子的基因能够调控整个器官的形成。例如，Eyeless 基因在果蝇中既是生成眼结构所必需的，也足以实现该功能。

为了精化此类器官内的解剖模式，细胞通过可扩散的诱导信号和短程机制进行局部互动。通常，细胞通过侧向抑制相互竞争。这一过程导致一个细胞中 Notch 信号通路的激活及其邻近细胞的抑制，从而产生两种不同的细胞类型。不对称细胞分裂——即子细胞从母细胞继承不同的分子决定因子——为组织精细多样的细胞类型提供了另一种方式。

来自近期进化事件的证据表明，解剖结构变化主要受调控 DNA 序列变化的驱动，这些序列决定了发育基因的表达时空。尽管类似原理可能适用，但关于身体结构显著多样性在更长时间尺度上的演化机制，目前仍 largely 未知。

= 发育时序 =
发育事件在数分钟、数小时、数天、数周、数月甚至数年内逐步展开，每个生物体都遵循其自身严格的时间表。先前描述的诱导作用级联反应和转录调控事件需要时间，因为信号需要传递，转录调节因子需要合成并结合 DNA 以激活或抑制其靶基因。由基因表达变化引起的细胞大小、形状和组织结构的改变同样需要时间。所有这些事件都需要精确的时间参数，包括顺序（事件发生的序列）、间隔（事件之间的时间）以及在某些情况下的节律（事件的重复周期）。因此，每个发育过程必须以适当的速度进行，经过进化调整以适应胚胎内或环境中其他过程的时间安排。时间控制是发育生物学中一个引人入胜但却是最未被充分理解的难题。

= 分子寿命在发育时序中起着关键作用 =
发育过程虽复杂，却由简单步骤累积而成。首要挑战在于理解这些步骤的时间维度：例如，启动或关闭基因表达需要多长时间？这不同于拨动电灯开关——其中存在时间延迟。首先，合成 mRNA 分子需要时间：RNA 聚合酶需沿基因全长行进，初级 RNA 转录本需经历剪接等加工过程，最终形成的 mRNA 必须从细胞核输出并运抵翻译位点。这些步骤共同构成了单个分子的"孕育时间"。其次，单个 mRNA 分子积累至完全有效浓度也需要时间；正如第 15 章所述，这种积累时间取决于分子的平均寿命——分子存续时间越长，其最终浓度越高，达到该浓度所需时间也越长。在接下来的步骤中，也会出现类似的延迟，即 mRNA 被翻译成蛋白质的过程：每个蛋白质分子的合成都涉及一个孕育延迟，而达到有效蛋白质浓度则涉及一个积累延迟，这取决于每个蛋白质折叠成其三维结构所需的时间及其产生后的寿命。整个基因切换过程的时间是 mRNA 和蛋白质分子的孕育延迟与积累延迟（基本上是分子寿命）的总和。有些反直觉的是，决定切换时间的主要是这些延迟的总长度，而不是分子合成速率（每秒合成的分子数量）。

同样的加法原则适用于基因开关的长级联过程，其中基因 A 激活基因 B ，基因 B 激活基因 C ，依此类推。该原则也适用于其他情况，例如信号通路中一个蛋白质直接调控下一个蛋白质的激活。在所有这些情况下，分子寿命以及孕育延迟在决定发育速度方面起着关键作用。mRNA 和蛋白质分子的寿命差异极大，从几分钟或几小时到数天甚至更长，这解释了发育事件节奏的许多方面。

然而，基因开关延迟并非发育时序的全部决定因素。发育过程还涉及多种其他类型的延迟，这些都对时序调控起着重要作用。染色质结构重塑需要时间完成，诱导信号需要时间在细胞场中扩散（参见图21-9），细胞在空间中的迁移与重组同样需要时间。尽管如此，基因开关的时序仍在发育时序中扮演着基础性角色——这一点通过控制脊椎动物体轴分节的基因表达振荡器得到了尤为清晰而显著的诠释。

= 基因表达振荡器作为时钟调控脊椎动物分节过程 =
所有脊椎动物的主体轴都具有重复的周期性结构，这体现在颈部、躯干和尾部的椎骨序列、肋骨以及节段性肌肉中。这些节段性结构源自胚胎中线两侧呈长板状分布的中胚层。该中胚层板会规律性地分裂成一系列独立的块状结构，即体节——这些由裂隙分隔的细胞群（图 21-38A）。与我们先前讨论过的果蝇胚胎同时形成的体节不同，脊椎动物的体节是按顺序形成的。体节以双边对称的形式，按照从头部向尾部的固定节律依次形成。根据不同物种，最终形成的体节数量从不足 40 个（如青蛙或斑马鱼）到超过 300 个（如蛇类）不等。

形成体节的细胞产生于中胚层板最后端、最不成熟的区域，称为前体节中胚层。这是一个增殖区，随着新细胞的不断生成，该区域会向尾部方向推移，不断延伸

图 21-38 鸡胚胎中的体节形成过程。（A）孵化 40 小时的鸡胚胎明场图像。（B）前体节中胚层基因表达的时间振荡如何转化为已形成体节中基因表达的空间交替模式。在前体节中胚层的后部区域，每个细胞以 90 分钟为周期进行振荡。随着细胞成熟并脱离前体节区域，其振荡逐渐减缓直至停止，最终停留在临界时刻所处的周期相位所决定的状态。通过这种方式，基因表达的时间振荡形成了空间上的交替模式。（视频 21.5）（A 图源自 Y.J. Jiang 等人，《当代生物学》8:R868-R871, 1998。经爱思唯尔许可使用。）

胚胎（图 21-38B）。随着前体节中胚层向尾部移动，它留下了一串由细胞组成的体节轨迹，这些细胞在从前体节区域前端出现时聚集成块。前体节中胚层的特殊特性由成纤维细胞生长因子（FGF）和 Wnt 信号的组合维持，这些信号由胚胎尾端的信号中心产生，而这些信号的范围似乎定义了可以形成体节的区域。体节以时钟般的节奏出现，但究竟是什么决定了这一过程的节律呢？

在预定被分节的前体节中胚层后部，某些基因的表达随时间呈现振荡现象。这种振荡可在含有单个基因荧光报告胚胎的延时摄影中观察到。每个振荡周期会形成一对新的体节，而在振荡无法发生的突变体中，体节分割遭到破坏：细胞虽仍可能延迟分裂成独立的簇群，但分裂方式杂乱无章且不规则。这种控制规律性分割的基因表达振荡器被称为分节时钟。一个完整振荡周期的时长因物种而异：斑马鱼为30分钟，鸡为90分钟，小鼠为120分钟，人类则为300分钟。

当细胞从前体中胚层分化出来形成体节时——换言之，当它们摆脱了 FGF 和 Wnt 信号的影响时——它们的振荡基因表达便停止了。根据离开前体区域时振荡周期的相位，一些细胞停滞在一种状态，另一些则停滞在另一种状态。通过这种方式，前体中胚层中基因表达的时间振荡在成熟中胚层中留下了空间周期性的基因表达模式。这进而通过影响细胞间粘附模式，决定了组织如何分裂成物理上独立的块状结构。

分割时钟是如何工作的？首个被发现的体节振荡器基因是 Hes 基因，它们编码抑制性转录调节因子。除了调控其他基因外，Hes 基因的产物还能直接调控自身表达，形成一个简单的负反馈循环。Hes 基因的自我调节被认为是体节时钟振荡的基本发生器。尽管不同物种中这一机制经过各种方式的修饰，但其基本原理似乎是保守的。当关键 Hes 基因被转录时，Hes 蛋白数量逐渐积累，直至足以阻断 Hes 基因的转录。随后蛋白质合成停止，随着蛋白质降解，转录得以重新开始；如此周而复始（图 21-39）。决定每个体节大小的振荡周期取决于反馈环中的延迟时间。根据先前讨论的原理，这一延迟等于 Hes mRNA 和蛋白质分子的合成延迟与积累延迟（即分子寿命）之和。数学模型（参见第8章）使我们能够将这些基本分子参数与分割时钟的周期时间联系起来：初步近似下，周期时长等于负反馈回路总延迟的两倍，因此也就是所有发生延迟之和的两倍

图 21-39 延迟负反馈导致基因表达振荡。(A) 单个基因编码能抑制自身表达的转录调节因子，可表现为振荡器。要实现振荡，反馈回路中必须存在一个（或多个）延迟，且 mRNA 和蛋白质的寿命（构成延迟因素）必须短于总延迟时间。总延迟时间决定了振荡周期。据认为，基于斑马鱼中一对冗余作用基因 Her1 和 Her7（或小鼠中的对应基因 Her7）的此类反馈回路，是控制体节形成的分节时钟的起搏器。(B) 使用适用于斑马鱼该基因的反馈回路参数粗略估算得出的 Her1 和 Her7 mRNA 及蛋白质预测振荡曲线。浓度以每个细胞中的分子数计量。预测周期与观测周期接近，在斑马鱼中每个体节的形成周期为 30 分钟。

在循环的每一步中。此外，通过实验操作改变这些参数之一（例如，改变 Hes 内含子的大小以干扰 mRNA 处理时间）会导致对体节形成周期的预期影响。

上述反馈回路是细胞内的，前体节中胚层中的每个细胞即使培养在培养皿中也能自行产生振荡。然而，单细胞水平的这些振荡有些混乱且不精确，反映了基因表达控制本质上具有噪声和随机性，正如第七章所讨论的。需要一种机制来使前体节中胚层中所有将形成特定体节的细胞保持同步振荡。这在一定程度上是通过 Notch 信号通路进行的细胞间通讯实现的。在此背景下，Notch 信号并不像侧向抑制那样驱动相邻细胞产生差异，而是恰恰相反：它使它们保持一致。在 Notch 信号失效的突变体中，包括 Delta 或 Notch 本身有缺陷的突变体，细胞会失去同步性，体节分割再次被破坏。这导致脊柱的严重畸形——单细胞水平基因表达的噪声时间控制后果的惊人展示，在脊椎动物整体结构中得到了放大体现。

= 细胞内在的定时机制可导致不同的细胞命运 =
尽管细胞间的信号传递在推动发育进程中起着至关重要的作用，但这并不意味着细胞总是需要来自其他细胞的信号来促使它们在发育过程中改变特性。其中一些变化是细胞固有的（如第15章讨论的生物钟的滴答声），并依赖于细胞内发育程序，这些程序即使在细胞脱离正常环境时也能运作。

最典型的例子是神经母细胞的发育，这些是果蝇中枢神经系统的干细胞。这些细胞经历一系列不对称分裂，以产生不同类型的神经元和胶质细胞，其分裂顺序和时间始终一致。每个神经母细胞通过一个时间依赖性的发育程序，产生出多种命运不同的子细胞。随着神经母细胞按照既定的分裂计划进行，它通过依次表达一系列不同的转录调节因子来改变其内部状态。例如，大多数胚胎神经母细胞按固定顺序依次表达转录调节因子 Hunchback、Kruppel、Pdm 和 Castor（图 21-40）。当神经母细胞分裂时，此时表达的转录调节因子会被其子细胞继承并维持；因此，分化出的神经细胞根据其出生时间被赋予不同的特性。

当神经母细胞从胚胎中取出并在培养中维持，与其正常环境隔离时，它们会经历与留在胚胎中时几乎相同的固定发育程序。此外，即使细胞分裂被阻断，许多神经母细胞的转变仍会发生。这些神经母细胞似乎拥有一个内置计时器，决定每种转录调节因子何时表达，且该计时器能在细胞周期进程缺失的情况下持续运行。这种时间调控的分子基础尚不完全清楚。由于涉及交叉调控的转录级联反应，它可能依赖于基因切换所需的时间，如前所述，但也可能与染色质结构和基因组组织的缓慢渐进变化有关，这些变化同样能够衡量胚胎内时间的流逝。

时序机制能够协调细胞命运与组织的空间结构。例如，在哺乳动物大脑皮层的发育过程中，祖细胞中有序表达的不同转录因子通过分裂产生神经元和胶质细胞，进而依次生成特定类型的神经细胞。新生神经元随后迁移至其适当位置。

图 21-40 果蝇胚胎中神经命运的时间模式。每个神经母细胞通过不对称分裂实现自我更新，并产生一个称为神经节母细胞的子细胞。该神经节母细胞随后会分裂产生一对终末分化的神经元或胶质细胞。神经元和胶质细胞的类型由母体神经母细胞中表达的转录调节因子决定，这些因子随后被其神经节母细胞子代继承。每个神经母细胞在其谱系进展过程中会依次表达 Hunchback、Kruppel、Pdm 和 Castor 等转录调节因子。在表达其中一种调节因子并进行数次分裂后，神经母细胞会转换其基因表达模式，表达更新的基因组合，这些基因将传递给其子细胞，使它们相应地分化为特定细胞类型。（改编自 B.J. Pearson 与 C.Q. Doe，《自然》425:624-628, 2003。）

图 21-41 神经基因的时序表达驱动大脑的分层结构组织。（A）哺乳动物大脑皮层中的许多神经元和胶质细胞源自共同祖细胞，这些祖细胞在皮层神经上皮内表面增殖，产生连续世代的神经元（此处以蓝色、绿色、橙色和黑色表示）。发育中的神经元沿放射状胶质细胞延伸的突起向外迁移，这些胶质细胞同样源自相同祖细胞。最早生成的神经元停留在其诞生位置，而较晚生成的神经元则越过它们定居于更外围区域。因此，连续世代的神经元占据皮层不同层次，并根据其出生时间具有不同的内在特性。（B）荧光显微图像显示哺乳动物大脑皮层中通过不同转录因子抗体标记（蓝、绿、白、红）的兴奋性神经元分层结构。神经细胞类型由其祖细胞中转录因子表达的时序序列决定，因此出生顺序既规定了分化神经元的命运也决定了其定位。（源自 I. Holguera 与 C.） Desplan，《科学》362 卷：176-180 页，2018 年。)

在发育中的皮层，最终占据成年大脑的不同层次。因此，占据同一层次的所有神经元都在同一时间窗口形成，并具有共同的命运（图21-41）。

= 细胞很少通过计数细胞分裂来计时其发育过程 =
许多特化细胞来源于增殖性祖细胞，这些祖细胞在有限次数的分裂后停止增殖并最终分化。在这种情况下，人们很容易推测细胞分裂周期充当了细胞内计时器，以控制细胞分化的时机。细胞周期如同滴答作响的时钟，设定其他发育进程的节奏，基因表达的成熟变化依赖于细胞周期的推进。然而，多数证据表明这一诱人观点并不正确。尽管存在细胞随每次分裂改变成熟状态且这种变化依赖于细胞分裂的实例，但这并非普遍规律。正如我们在果蝇胚胎神经母细胞中看到的，发育中的动物细胞即使在被人工阻断分裂时，也常能按照正常的成熟与分化时间表进行；当然会出现某些异常，毕竟单个未分裂细胞无法同时向两种方向分化。但大多数发育中的细胞似乎无需细胞分裂即可改变其发育状态。发育调控基因能够开启或关闭细胞分裂周期机制，正是这些基因的动态变化而非细胞周期本身决定了发育的节奏。

= 微小 RNA 可调控发育进程转变 =
由于遗传筛选能有效追踪参与几乎所有生物学过程的基因，研究人员利用该方法寻找改变发育时序的突变。此类筛选在线虫中得以实施

图 21-42 秀丽隐杆线虫的细胞谱系。（A）成虫部分主要组织（参见图 1-42）。（B）通过精密分析每次细胞分裂后各子细胞的命运，绘制出从单细胞受精卵到成虫 959 个细胞的完整细胞谱系。每条垂直线代表一个细胞，分支点反映细胞分裂。标注显示谱系中构成 A 图所示组织的细胞。（A 和 B，由 D.H. Hall 惠赠，线虫图谱源自 <nowiki>https://www.wormatlas.org/celllineages.html。）</nowiki>

秀丽隐杆线虫（图21-42）。这种微小生物遵循着惊人精确且可预测的发育程序，其细节已被极其详尽地描述，以至于可以绘制出体内每个细胞的确切谱系。每个细胞分裂的时间与地点，以及其各子细胞的命运，在个体间具有高度一致性。

描述秀丽隐杆线虫正常发育的谱系图的一大优势在于，可以精确观察到突变体中发育程序如何被改变。通过线虫的遗传筛选，发现了以特别显著方式扰乱发育时序的突变：在这些所谓的异时性突变体中，幼虫特定发育阶段的细胞会表现出其他发育阶段幼虫细胞的特征，或成虫细胞持续分裂如同幼虫细胞（图21-43）。

遗传分析显示，异时基因的产物以级联形式依次作用，构成调控级联。出乎意料的是，位于各自级联顶端的两个基因——Lin4 和 Let7——被发现编码的并非蛋白质，而是微 RNA（miRNA），即一种短小的、非编码的调控性 RNA 分子，长度为 21 或 22 个核苷酸。这些 miRNA 通过与来自其他异时基因的 mRNA 分子非编码区中的互补序列结合，从而抑制其翻译并促进其降解，如第七章所述。Lin4 miRNA 结合到异时基因 Lin14 产生的 mRNA 的 3'非翻译区，而 Lin14 本身促进早期幼虫细胞行为。因此，发育调控下 Lin4 水平的增加通过逐渐降低 Lin14 蛋白水平，控制着从早期到晚期幼虫细胞行为的转变。类似地，Let7 miRNA 水平的增加通过调控另一个名为 Lin41 的靶基因，以相似方式控制从幼虫晚期到成虫的转变过程。事实上，Lin4 和 Let7 是在任何动物中首次被描述的 miRNA：正是通过对秀丽隐杆线虫的发育遗传学研究才揭示了这一点。正是在秀丽隐杆线虫中，发现了这类分子对动物基因调控的重要性。

图 21-43 秀丽隐杆线虫 Lin14 基因的异时性突变。图中仅显示了众多受影响细胞系中某一谱系的变化。Lin14 基因的功能缺失（隐性）突变会导致幼虫晚期特有的细胞分裂与分化模式提前出现，使得个体过早进入终末状态且细胞数量异常减少。功能获得（显性）突变则产生相反效应，促使细胞重复执行第一幼虫期特有的分裂模式，持续经历多达五至六次蜕皮周期。Lin14 功能获得性突变可能源于 Lin4 miRNA 结合位点的改变，使 Lin14 蛋白免受下调调控。黑色 X 表示程序性细胞死亡。绿色线条代表含有 DNA 结合蛋白 Lin14 的细胞，红色线条代表不含有该蛋白的细胞。（改编自 V. Ambros 与 H.R. Horvitz，《科学》226:409-416, 1984；以及 P. Arasu 等，《基因与发展》5:1825-1833, 1991。）

= 细胞与细胞核大小关系调控合子基因表达的开始 =
正如我们之前讨论的，许多基因产物由母体沉积在卵子中，使得发育的第一步能在受精后立即启动。然而，母源供给最终会耗尽，合子便开始产生自身的基因产物。这种母源-合子转换（MZT）在大多数生物中会延迟相当长时间后发生，标志着胚胎自身基因组从母源大分子手中基本接管发育控制权的时间窗口（图 21-44）。

母源合子转换（MZT）发生在大多数物种原肠胚形成前不久，此时快速且同步的卵裂分裂被较慢且更常规的细胞周期所取代。在这一转变过程中，成千上万的基因从先前沉默的合子基因组启动转录，许多母源基因产物从胚胎中被清除。在包括青蛙、鱼类和果蝇在内的多个物种中，最早被转录的一些合子基因包含特定的 miRNA，这些 miRNA 靶向母源 mRNA 进行翻译抑制和降解。在此，miRNA 再次通过阻断和移除定义早期发育阶段的 mRNA 来锐化发育转变。

MZT 的时机是如何被控制的？其中一个触发因素似乎是核质比。许多动物胚胎在发育的最初阶段并不生长或改变体积。相反，快速的 DNA 复制和有丝分裂将受精卵转化为数千个更小的细胞。在这些卵裂分裂过程中，胚胎中的细胞质总量保持不变，但胚胎中的细胞核数量呈指数增长，从而增加了 DNA 与细胞质的比例。引人注目的是，含有单倍体的胚胎

图 21-44 斑马鱼胚胎中的母源-合子转换。母源 mRNA 由母体沉积到卵子中并驱动早期发育。这些 mRNA 在胚胎发生的不同阶段（包括囊胚和原肠胚阶段）被降解，但在母源-合子转换（MZT）时发生相对突然的变化。在此之前，胚胎（合子）基因组处于转录失活状态；之后，合子基因开始转录。在斑马鱼胚胎中，合子基因组在 512 细胞阶段开始被激活。

每个细胞中 DNA 含量减半的胚胎，其母源-合子转换（MZT）的发生时间比正常二倍体胚胎晚一个细胞周期。根据一种模型，核质比可能是通过母源提供的转录抑制因子与不断增加的核 DNA 量之间的滴定作用来测量的。在卵裂分裂过程中，抑制因子的总量保持不变，但每个基因组所对应的抑制因子量会随着每一轮 DNA 合成而减半，直至达到阈值，从而使合子基因组开始转录激活。组蛋白作为母源蛋白，是这种抑制因子的候选者之一，其浓度在多种生物中调控 MZT 的时机。另有证据表明，某些母源提供的转录调节因子在积累到足以激活其靶基因的阈值后，会触发 MZT。不同物种可能依赖其中一种或两种机制来适时激活合子基因组。

= 激素信号协调发育转变的时机 =
迄今为止，我们重点讨论了在胚胎不同部位或分子控制机制的特定子系统中局部独立运作的计时机制。进化已将这些基本独立的过程调整至适宜速率，以满足生物体整体需求。然而在某些情况下，这还不够：需要全局协调信号。当身体需要根据环境相关信号进行全面改变时尤其如此。例如昆虫或两栖动物经历变态——从幼虫到成虫的转变——几乎每个身体部位都会发生转化。变态时机取决于外部因素（如食物供应），这决定了动物何时达到合适体型。所有身体变化都必须在正确时间同步触发，尽管它们发生在相距甚远的部位。此类协调由激素——遍布全身的信号分子——实现。

两栖动物的变态过程提供了一个引人注目的例证。在这一发育转变期间，它们从水生生活过渡到陆生生活。幼虫特有的器官如鳃和尾巴逐渐消失，而成体特有的器官如四肢则开始形成。这一剧烈变化由甲状腺产生的甲状腺激素触发。若摘除甲状腺或阻断甲状腺激素的作用，尽管生长仍在继续，变态过程却不会发生，最终形成巨型蝌蚪。相反，实验者若给蝌蚪注射一剂甲状腺激素，则可提前引发其变态过程。

甲状腺激素通过血管系统分布至全身，通过与细胞内核激素受体结合来诱导接收细胞发生变化，这些受体调控着数百种基因。然而，这并不意味着所有靶组织对激素的反应方式相同：器官不仅在甲状腺激素受体水平及局部调节活性激素量的细胞外蛋白水平上存在差异，而且在响应的基因集合上也各不相同。甲状腺激素促使肢体肌肉生长，同时导致尾部肌肉消亡。反应时机亦有所不同；例如，腿部在循环激素浓度极低时便早期形成，但诱导尾部吸收则需要高水平的激素。

甲状腺激素的激增引发变态过程，但其激增时机如何被调控？一种机制依赖于激素合成与甲状腺大小的关联，而甲状腺大小反映了蝌蚪的体型。只有当腺体达到特定大小时，才能产生足够的甲状腺激素来启动变态。然而，除营养外，环境信号也发挥作用：温度和光照等条件由神经系统感知，该系统调控另一层激素（神经激素）的分泌，这些激素进而刺激甲状腺激素的分泌。因此，蝌蚪的内在因素（如体型）与环境因素共同决定了变态开始的时间。

= 环境信号决定开花时间 =
环境控制发育时机的另一个显著例子是植物的开花过程。开花涉及植物茎尖生长点——顶端分生组织细胞行为的转变。在常规营养生长阶段，这些细胞表现为干细胞特性，持续不断地分化出新叶和茎秆节段。而在开花过程中，分生组织细胞转而构建花的各个组成部分：包括承载花粉的萼片与花瓣、产生雄配子的雄蕊，以及容纳雌配子的子房。

为了准确掌握转换时机，植物必须综合考虑过去与现在的环境条件。对许多植物而言，日照长度是重要线索。为感知这一点，植物运用其生物钟——一种内源性的 24 小时基因表达节律——仅在一天中适宜时段有光照时生成开花信号。生物钟本身受光照影响，植物实际上是通过生物钟来对比历史与当前的光照条件。这些现象背后的遗传电路关键组成部分已被识别，包括作为光受体的光敏色素和隐花色素（详见第 15 章）。通过维管系统从叶片传递至茎尖分生组织的开花信号，依赖于名为开花位点 T（FT）基因的产物。

但只有当植物处于先前长期寒冷暴露后的感受态时，该信号才会触发开花。许多植物需要经历冬季才能开花——这一过程称为春化作用。数周或数月的低温会逐渐降低一个名为开花位点 C（Flc）的关键基因的表达水平。Flc 编码一种转录抑制因子，可抑制开花启动因子 Ft 的表达。

春化作用如何关闭 Flc 以解除开花阻滞？该效应涉及至少三种长链非编码 RNA，包括一种与 Flc 基因重叠的反义转录本 Coolair，其在低温条件下产生（图 21-45）。通过与包括 Polycomb 家族蛋白在内的冷诱导染色质修饰因子协同作用，Coolair 协调 Flc 染色质转换为沉默状态（第四和第七章将详细讨论）。沉默程度取决于寒冷暴露的持续时间，使植物能够区分偶然的寒夜与整个冬季。

对染色质的影响是持久的，即使天气转暖，这种影响也会持续多轮细胞分裂。因此，春化作用形成了

图 21-45 拟南芥开花的时间调控。当植物未经冬季低温生长时，Flc 基因处于活跃状态并阻止开花。长期低温暴露导致产生与 Flc 基因重叠的非编码 RNA Coolair。Coolair 诱导长期染色质变化，从而关闭 Flc。这些变化在低温期结束后持续存在，使得植物在较长日照促进开花时能够开花。

对 Flc 产生的持续阻断，使得当日照足够长时能够产生 Ft 信号。

影响 Flc 表达调控的突变会改变开花时间，从而影响植物在特定气候条件下繁茂生长的能力。因此，控制开花转换的整个调控系统对农业至关重要，尤其是在气候快速变化的时代。

春化作用的例子揭示了染色质修饰在发育时序调控中的一个普遍原理。植物通过染色质的变化来记录其经历的持续低温环境。或许在其他生物体——无论是动物还是植物——中，染色质结构的缓慢渐进变化，为那些需要数日、数周、数月甚至数年时间缓慢展开的神秘发育过程提供了长期计时机制。这类染色质计时器可能是胚胎中最重要的生物钟之一，但迄今为止我们对它们的了解仍非常有限。

= 摘要 =
发育时序在多个层面受到调控。基因的开启或关闭需要时间，这一时间延迟取决于所涉及分子的寿命，而分子寿命差异巨大。基因调控级联反应伴随着一系列延迟。反馈回路可导致基因表达的时间性振荡，这些振荡可能用于生成空间周期性结构。例如，在脊椎动物体节形成过程中，Hes 基因的表达呈现振荡，每个振荡周期会形成一对新的体节。Hes 基因编码的转录抑制蛋白能反馈作用于自身基因的表达。这种负反馈产生的振荡周期反映了自调节基因开关回路中的延迟。这种"分节时钟"的振荡周期控制着体节的大小。相邻细胞间的 Notch 信号传导使它们的振荡同步：当 Notch 信号传导失效时，由于各细胞内部时钟的遗传噪声，细胞间逐渐失去同步性，导致脊柱的节段性结构遭到破坏。

时机并不总是依赖于细胞间的相互作用；许多发育中的动物细胞拥有内在的发育程序，即便在培养的孤立细胞中也能展开。例如，果蝇胚胎中的成神经细胞会经历一系列不对称分裂的程序，每次分裂都以可预测的顺序和时间，通过基因开关事件的级联反应，产生不同的神经细胞类型。对脊椎动物和无脊椎动物的研究表明，这类程序很少受细胞分裂时间的支配，即使细胞分裂被阻断，程序仍可展开。在关键时刻产生的微 RNA 通过阻断翻译并促进特定 mRNA 集的降解，来锐化发育转变。其中一个例子是母源-合子转换，此时胚胎基因组的转录开始。这一事件的启动既涉及合子核倍增对母源抑制因子的稀释作用，也涉及母源转录激活因子随时间累积的过程。发育时间的全局协调是通过激素实现的，这些激素在生物体内传播并作用于细胞：例如，当蝌蚪成长时，甲状腺激素水平激增，触发其变态为青蛙。发育时间的环境控制在植物中尤为显著，揭示了长期作用的分子计时器的存在。以春化作用为例，持续的低温诱导染色质发生变化，记录冬季的进程，从而确保仅在春季开花。染色质结构的缓慢渐进变化很可能在动物发育的长期编程中也扮演着重要计时器的角色。

= 形态发生 =
细胞在特定时间分化为不同类型固然重要，但这仅是动物发育的一个方面。同样关键的是细胞经历的运动和变形过程，这些过程使细胞组装成组织与器官。

具有特定形状和尺寸。这些物理形态作为细胞命运程序的核心输出，对每个器官的生理功能至关重要。与发育时序类似，形态发生（"形态生成"）过程相较于导致细胞类型特化的差异基因表达和诱导信号传导过程，其理解程度仍显不足。细胞运动可被明确描述，而协调这些运动的分子机制正在逐步破译。

在第十九章中，我们了解了细胞如何通过粘附形成上皮片层，或通过细胞外基质包裹自身以构成结缔组织。我们还探讨了组织的基本特征（如上皮细胞的极性）如何源自单个细胞的特性。本节将重点讨论动物发育过程中细胞的动态重排如何塑造胚胎及身体所有独立器官与附属结构的形态。

少数细胞行为是形态发生的基础。细胞能够改变形状，而协调的形状变化可以将上皮片弯曲成管状或空心球体。细胞能够相对于邻近细胞重新排列，导致组织伸长、收缩或增厚。通过伸展并保持与同伴的连接，特化的细胞群可以形成不断生长的管状网络，如血液或淋巴管系统。单个细胞也能从邻近细胞中脱离出来，形成物理上独立的群体，然后沿着特定路径在胚胎中迁移。群体迁移，如原肠胚形成过程中发生的迁移，能够改变胚胎的整体拓扑结构。所有这些过程的基础是物理力的变化，这些力改变了细胞形状和细胞接触——无论是与其他细胞还是与细胞外基质的接触。我们首先考虑这些力是如何产生的。

= 作用于细胞的物理力不平衡驱动形态发生 =
尽管细胞具有生命，但它遵循着与非生命物体相同的物理法则。细胞和组织拥有特定的力学特性，其形态反映了作用于它们的力量。在静止状态下，细胞处于力学平衡中，所有力量相互抵消。形态发生则意味着这种平衡的转变，因为新的力量以定向方式产生。这些有序的力变随后在更广范围内展开作用。例如，肌球蛋白运动蛋白对肌动蛋白细胞骨架的活动可能改变细胞形态，进而影响其与邻近细胞的相互作用，从而塑造组织的形状。这类协调变化最终雕琢出完整的器官和动物躯体。

虽然像肌动蛋白和肌球蛋白这样的蛋白质在细胞内产生力量，但另一些则负责感知所施加的力。这类被称为机械传导器的蛋白质，会响应机械刺激启动细胞内信号传导，正如第 15 章所述分子响应化学信号触发信号通路一样。 \alpha - Catenin 和 Talin 是机械传导器，它们与细胞黏附分子的胞质尾部结合（参见第 19 章）；这些分子在邻近细胞施加的张力作用下展开，这种构象变化发送生化信号，既能引发细胞力学的快速响应，也能对基因表达产生长期影响。Piezo（见第 660 页）是一种跨细胞膜的机械敏感离子通道；它响应剪切应力或质膜拉伸而打开，通过离子传递进而启动信号级联反应。通过这些机械敏感分子，细胞和组织能够解读其所处的物理环境并作出相应反应。

= 张力和黏附决定上皮细胞层内的细胞排列方式 =
在许多组织中发现的二维上皮片层是阐释形态发生原理的一个简单系统。跨动物物种观察，稳定的上皮片层展现出高度一致的细胞形态分布模式，其中大多数细胞

图 21-46 上皮组织中细胞形态的规则分布。(A) 非洲爪蟾早期胚胎细胞膜的荧光显微图像显示，大多数上皮细胞呈现六边形轮廓，具有六个相邻细胞，在细胞相接处形成三向连接点。(B) 水面上的二维肥皂泡"筏"展现出类似的组织结构。(C) 细胞间接触的长度和几何形状由相抗衡的作用机制决定。每个细胞内皮层肌动球蛋白细胞骨架的收缩网络倾向于使细胞分离，而由钙黏蛋白等分子介导的粘附作用则倾向于使细胞表面保持连接。(A 图由 Saranyarajan Varadarajan 和 Ann Miller 提供；B 图来自 Shebeko/Shutterstock。)

细胞在其顶端表面呈现六边形轮廓（图 21-46A）。这种排列方式由细胞的力学特性及其与邻近细胞的连接决定，这些连接主要通过粘附连接实现（参见第 19 章）。质膜邻近连接处下方的肌动球蛋白环收缩性会在每个细胞内产生皮层张力，倾向于将细胞从邻近细胞中拉开。然而，这种力被细胞间粘附所抵消，该粘附由连接处内的钙粘蛋白等分子介导。这些内向和外向力之间的平衡形成了可预测的细胞构型，可通过数学模型进行模拟，类似于肥皂泡等无机实体的堆积排列（图 21-46B 和 C）。尽管气泡中平衡表面张力最小化与接触界面的物理机制与塑造细胞的机制大相径庭，但代表排列能量最小化的数学解却具有相似性。

= 细胞粘附分子模式的变化迫使细胞形成新排列 =
组织的形态最终由基因表达模式决定，这些模式产生的分子会改变表达它们的细胞的物理特性。影响这些特性的重要基因类别编码了细胞表面展示的黏附分子。通过改变其表面分子，细胞可以打破旧的附着并建立新的连接。例如，组织中某一区域的细胞可能发展出使其相互凝聚的表面特性，并与拥有不同表面分子的邻近细胞群分离。钙黏蛋白及其他在发育动物不同组织中差异表达的细胞间黏附蛋白发挥着重要作用。在第19章中，我们了解到选择性细胞间黏附足以驱动从胚胎分离的细胞按同类聚集（见图19-7）；使用结合钙黏蛋白的抗体处理会干扰这一过程。各种钙黏蛋白基因表达的变化与胚胎发生过程中细胞间不同结合模式密切相关，例如在原肠胚形成、神经管形成和体节发生过程中所观察到的那样。钙黏蛋白还控制上皮片层和细胞簇的形成与解离（参见视频19.1）。最后，由于黏附分子不仅将细胞相互粘合，还为细胞内肌动蛋白丝提供锚定点，细胞-细胞黏附位点会影响发育组织中张力和细胞运动。

= 排斥性相互作用有助于维持组织边界 =
不同类型的钙黏蛋白使不同细胞能够选择性黏附：表达特定钙黏蛋白的细胞会最大化与表达相同钙黏蛋白细胞的接触，从而与其他细胞分离，形成特定的组织边界。细胞混合也可通过另一种方式被抑制并形成维持边界：不同类型细胞

图 21-47 通过排斥作用进行整理。鸡胚后脑分割中的 Ephrin-Eph 信号传导。每对菱脑节（后脑中的节段）与一个鳃弓（一种改良的鳃原基）相关联，该对节段向鳃弓发送神经支配。菱脑节通过表达不同的 Vox 基因（见图 21-30）而彼此区分。在表达 EphrinB2 的菱脑节 R4 细胞与表达 EphA4 的菱脑节 R5 细胞之间的界面处，表面张力的差异导致相互排斥（红色条），形成清晰的边界。

有时，它们会主动相互排斥。第 15 章讨论的 Eph 受体和 ephrins 的双向激活常常介导这种排斥作用，在不同细胞群之间的界面上发挥作用，防止群体混合，并排斥不适宜的入侵者。Ephrin-Eph 信号传导在之前讨论的脊椎动物胚胎体节边界处运作（见图 21-38）。通过调节皮层肌动球蛋白细胞骨架，ephrin-Eph 信号传导被认为能诱导细胞间皮层张力的差异，从而减少细胞间接触的力量。另一个例子是在菱形脑中，这是发育中脊椎动物大脑的分段区域。相邻的菱形脑表达互补的 ephrins 和 Eph 受体组合，这使得相邻菱形脑中的细胞严格隔离，它们之间的边界清晰明确（图 21-47）。

图 21-48 间充质细胞迁移导致的会聚延伸。(A) 细胞群体形成片状伪足，试图相互爬行。片状伪足运动沿共同轴线排列，由平面极性信号控制（稍后讨论），导致会聚延伸。(B-G) 斑马鱼原肠胚形成过程中背侧中胚层的会聚延伸模式，分别为受精后 8.8 小时(B,E)、9.3 小时(C,F)和 11.3 小时(D,G)。将发育成脊索的细胞标记为绿色，将发育成体节和肌肉的细胞标记为蓝色。脊索和体节区域从记录开始时就空间分离(B,E)，但其边界最初几乎不可见，稍后才变得明显。会聚作用使脊索区域在最后时间点(D,G)缩小至约两个细胞宽度。(A, 改编自 J. Shih 和 R. Keller, 《发育》116:901-914, 1992. 经生物学家公司许可；B-G, 改编自 N.S. Glickman 等, 《发育》130:873-887, 2003. 经生物学家公司许可。)

= 相似细胞群能实现显著的集体重组 =
由钙粘蛋白介导的细胞分选和由 ephrin-Eph 介导的排斥作用，展示了细胞表面特性的差异如何驱动组织排列，导致表达不同基因组的细胞相互分离。然而，完全相似的细胞群也能经历显著的重排。许多动物胚胎通过这种称为汇聚延伸的过程延伸其主要体轴。当一群细胞协调地向特定边界移动，并在此过程中相互穿插时，就会发生汇聚延伸。这导致组织沿一个轴变窄（汇聚）并沿另一个轴伸长（延伸）。组织形状的整体变化源于细胞位移，而非单个细胞形状的改变，且很大程度上是相关细胞群自主完成的。一个显著的例证是，当从青蛙胚胎适当区域分离出的小型方形组织碎片在培养中独立存在时，它们会自发地变窄和伸长，就像在发育中的动物体内一样。

汇聚延伸是一种常见的运动方式，能够延长多种器官，尽管其背后的细胞行为可能有所不同。例如，在青蛙原肠胚形成过程中，表面上皮某一区域的细胞在迁移至胚胎内部时会失去上皮特性。这些松散连接的细胞，称为间充质细胞，会形成基于肌动蛋白的片状伪足，这些伪足定向排列，使细胞在向胚胎中线汇聚时相互爬行并交错嵌合（图21-48）。相反，当果蝇胚胎延伸其前后轴时，相关细胞仍保持上皮特性。这些细胞维持紧密的粘附连接，但通过沿一个轴收缩细胞连接同时在另一轴延伸连接，实现细胞间插排列（图21-49；另见图19-15）。连接的重塑涉及由局部肌球蛋白活性产生的差异收缩张力。在这两种情况下，无论是间充质迁移还是上皮连接重塑，细胞行为的协调都依赖于能够产生平面细胞极性的信号通路，我们将在接下来讨论。

= 平面细胞极性引导胚胎内细胞行为的方向 =
正如指南针能帮助我们在景观中定位方向，进行形态发生运动的细胞也必须具备一套系统，以相对于动物体的不同轴线来定向自身。我们在第19章中讨论了所有

图 21-49 通过上皮连接重排实现的会聚延伸。(A)展示了果蝇胚胎表皮在 9 分钟内的荧光图像，(B)中的示意图标注了特定细胞及细胞连接（参见视频 21.6）。与其他上皮组织类似，大多数细胞初始呈六边形，其连接由三个相邻细胞共享。为沿前后轴延伸组织，部分背腹向连接（绿色）收缩，形成短暂的五边形或四边形细胞排列，此时一个连接由四个相邻细胞共享。随后沿前后轴形成新连接（蓝色），该连接现由两个先前未接触的细胞共享，并分离了两个原先相接触的细胞。这种平面极性化的连接收缩与延伸过程在整个表皮同步发生，在维持上皮完整性的同时使组织变窄并延伸。（图像由 Huapeng Yu 和 Jennifer Zallen 提供。）

图 21-50 平面细胞极性。（A）果蝇翅膀上的翼毛。翅膀上皮中的每个细胞在其顶端形成一个小而尖的突起或“毛发”，所有毛发都朝向同一方向，即翅膀的尖端。这反映了每个细胞结构中的平面极性。（B）小鼠内耳中的感觉毛细胞同样具有明确的平面极性，表现为其表面上定向排列的静纤毛（充满肌动蛋白的突起）模式。声音的检测依赖于毛细胞正确且协调的定向。（C）果蝇中编码非经典钙黏蛋白的 Flamingo 基因突变，破坏了翅膀中的平面细胞极性模式。（D）小鼠中同源 Flamingo 基因的突变使耳朵中毛细胞的平面极性向量方向随机化。突变小鼠因此失聪。（E）显微照片显示 Flamingo（绿色）在果蝇蛹翅膀中的定位，与每个细胞生长的毛发（红色）的关系。 (F) 图示平面极化定位：Flamingo 蛋白定位于每个上皮细胞的一侧，而另一种平面极性调节蛋白 Frizzled 则定位于相对一侧，毛发将由此形成。（A 和 C，摘自 J. Chae 等人，《发育》126:5421-5429, 1999，经生物学家公司许可；B 和 D，摘自 J.A. Curtin 等人，《当代生物学》13:1129-1133, 2003，经爱思唯尔许可；E，由 Paul Adler 提供。）

上皮细胞具有顶-基极性，但许多上皮组织的细胞还表现出垂直于该轴的额外极性：这些细胞排列方式犹如表面标注了方向箭头，全部指向上皮平面内的同一方向。这种极性被称为平面细胞极性。以果蝇翅膀为例，每个上皮细胞表面都有称为翼毛的微小不对称突起，所有翼毛均指向翅膀尖端。类似地，在脊椎动物内耳中，每个机械感受性毛细胞顶端质膜上都有精确定向的不对称纤毛束——这些充满肌动蛋白的杆状突起称为静纤毛，作为声音及重力等力的探测器。向特定方向倾斜纤毛束会使膜离子通道打开，从而激活细胞电信号；反向倾斜则产生相反效果。要使耳朵正常运作，毛细胞必须

必须正确定向。平面细胞极性在呼吸道中也至关重要，每个纤毛细胞必须调整其纤毛的摆动方向，以便将黏液向上清扫，远离肺部。

必须正确定向。平面细胞极性在呼吸道中也至关重要，每个纤毛细胞必须调整其纤毛的摆动方向，以便将黏液向上清扫，远离肺部。通过对果蝇中毛发方向异常的突变体进行筛选，已识别出一组控制多种组织中平面细胞极性的基因。其中一些基因编码 Wnt 信号通路的组成部分，另一些则编码跨膜蛋白，如钙粘蛋白超家族的特殊成员，这些蛋白通过相邻细胞间的连接相互作用。与影响跨膜蛋白定位的细胞内蛋白共同作用，沿细胞顶面定义了两个互补且互斥的区域，以此施加一种极化影响，这种影响在细胞间传播，导致整个上皮组织的极化。基本上相同的蛋白质系统控制着脊椎动物的平面细胞极性；缺乏果蝇平面极性基因同源物的小鼠表现出多种缺陷，包括内耳中毛细胞方向错误，从而导致耳聋（图 21-50）。

= 上皮组织在发育过程中可弯曲形成管状结构 =
会聚延伸是二维形态发生的一个例子。当细胞需要脱离组织平面并形成三维结构时，它们会采取额外的细胞行为。普遍的囊胚形成过程涉及未来的内胚层和/或中胚层细胞迁移至胚胎内部，这通常由囊胚上皮的局部弯曲启动。类似的弯曲能使扁平上皮片层形成生物管状结构，包括脊索动物特有的神经管，尽管如图21-51所示，还存在其他形成管状结构的途径。

组织可以通过一种广泛应用的细胞行为——顶端收缩而发生弯曲，这种现象发生在细胞利用肌球蛋白运动蛋白收缩锚定在其顶端表面附近粘附连接处的肌动蛋白纤维束时。这些纤维束的缩短导致上皮细胞在顶端变窄，使细胞从柱状转变为独特的楔形或瓶状。由于细胞通过粘附连接相互连接，一组细胞的协调收缩可导致整个片层弯曲甚至卷曲成管状（图 21-52）。发生顶端收缩的细胞群由模式基因的局部表达所选定，这些基因触发收缩性肌动球蛋白网络的活动。在果蝇胚胎中，腹侧限制性转录调节因子 Twist（图 21-26）控制预定中胚层细胞中的肌球蛋白行为，随后通过形成临时管状内陷完成原肠胚形成。在脊椎动物胚胎中，Sonic hedgehog（Shh）和 BMP 的模式

图21-51 参与管状结构形成的细胞行为。折叠形成神经管，出芽是肺和气管形成的基础，索状中空化发生于哺乳动物唾液腺形成过程中，细胞中空化参与气管末端细胞管的形成，而细胞组装则生成心脏发育最早期阶段出现的心管。

图 21-52 上皮片弯曲形成管道的过程。通过粘附连接在细胞间相连的顶端肌动蛋白束收缩，导致上皮细胞在其顶端变窄。根据发生收缩的细胞数量和排列方式，内陷的上皮可以保持与原片的连接，或者卷曲成独立的管道或空心球体。（A）示意图显示沿上皮片某一轴向的顶端收缩如何促使片层形成管道。（B）通过扫描电子显微镜观察的 2 天鸡胚胎躯干横截面，展示了通过（A）图所示过程形成神经管的情况。脊椎动物的神经管最终发育为大脑和脊髓。（B，由 Jean-Paul Revel 提供。）

信号传导诱导三个铰链点处的顶端收缩，从而将神经板转变为闭合的神经管。

= 上皮与间充质之间的相互作用生成分支管状结构 =
胚胎在需要大面积表面以执行排泄、营养吸收及气体交换等功能时，常会发育出分支状管状结构。肺脏便是其中一例。它们起源于从前肠底部生长出的上皮芽，这些芽体穿透邻近的间充质形成支气管树——随着不断延伸而反复分支的管道系统，最终在人体内形成约 1700 万条分支。构成血管内壁的内皮细胞侵入同一间充质，由此形成紧密贴邻的气道与血管系统，这正是肺内气体交换所需的结构（图 21-53）。这一完整的分支形态发生过程依赖于生长中的上皮芽与间充质之间双向传递的信号。小鼠遗传学研究表明，成纤维细胞生长因子（FGF）蛋白及其受体酪氨酸激酶在这些信号传导过程中起核心作用。FGF 信号在发育过程中具有多种功能，尤其在发育上皮与间充质之间发生的众多相互作用中尤为重要。

在肺发育过程中，FGF10 在靠近生长中的上皮管尖端的间充质细胞簇中表达，其受体则在侵入的上皮细胞内表达。在 FGF10 缺陷型突变小鼠中，肺上皮的原基虽能形成，却无法从间充质中生长出来形成分支状的支气管树。相反，将浸泡过 FGF10 的微小珠子置于培养的胚胎肺上皮附近，会诱导上皮形成芽体并向珠子方向生长。显然，上皮细胞只有在 FGF10 的诱导下才会进入间充质。

图21-53 通过成人支气管树铸型显示的肺部气道。不同颜色的树脂被注入支气管树的不同大分支中。（詹姆斯·卡瓦利尼/科学源。）

图 21-54 肺的分支形态发生。FGF10 与音猬因子如何诱导支气管树芽体的生长与分支机制示意图。该系统中还表达许多其他信号分子（如 BMP4），所示分支机制仅为多种可能性之一。如图所示，FGF10 蛋白在生长中的上皮管尖端附近的间充质细胞簇中表达，其受体则表达于上皮细胞本身。音猬因子信号沿相反方向传递——从芽体顶端的上皮细胞返回至间充质。基因表达模式及其时序特征表明，音猬因子信号可能用于抑制最靠近芽体生长尖端的间充质细胞中 FGF10 的表达，从而将分泌 FGF10 的细胞簇分割为两个独立集群，进而促使芽体分叉形成两个分支。

但是，是什么让肺部不断生长的上皮管在侵入间充质时反复分支呢？这依赖于一种 Sonic hedgehog 信号，该信号以相反方向传递，从芽尖的上皮细胞返回至间充质，在那里它抑制 FGF10 的产生以促进分支，如图 21-54 所示。在缺乏 Sonic hedgehog 的小鼠中，肺上皮虽能生长和分化，但形成的却是囊状结构而非管状分支树。

FGF 同样是昆虫气体交换系统形成中的主要信号，该系统由一系列称为气管和微气管的细小充气通道构成。这些通道起源于覆盖体表的表皮，向内延伸侵入下层组织，过程中不断分支并变细（图 21-55）。FGF 作用于前进中气管尖端的细胞，促使它们伸出丝状伪足并向 FGF 信号源迁移。由于尖端细胞始终与气管上皮的其余部分相连，它们产生的拉力使气管得以伸长。

最初，果蝇胚胎中 FGF 的产生模式由先前讨论过的 D-V（背腹）和 A-P（前后）模式系统所定义。然而，在发育的后期阶段，FGF 的表达由称为缺氧诱导因子（HIFs）的转录调节因子诱导，这些因子在缺氧（低氧水平）条件下被激活。通过这种方式，缺氧刺激形成越来越细、分支更广泛的气管，直到氧气供应充足到足以停止这一过程。

= 细胞外基质也影响组织形态 =
到目前为止，我们仅关注了形态发生过程中由细胞产生的力。然而，我们绝不能忽视器官的另一个重要组成部分：细胞外基质。正如第19章详述，这种不溶性分子网络存在于大多数动物组织中，而一种称为基底层的特殊基质位于所有上皮片层之下。细胞外基质为形态发生的细胞迁移事件提供了基质，这一点我们稍后将讨论。此外，基质的机械刚度可以通过改变细胞产生力时所面对的阻力，为器官形态的塑造提供指导性信号。在哺乳动物唾液腺的分支形态发生过程中，

图 21-55 果蝇气道分支形态发生。(A) 果蝇胚胎气管系统。(B) 周围细胞产生的 FGF（果蝇中由 Branchless 基因编码）向气管上皮发出信号并激活其 FGF 受体，导致丝状伪足形成和管腔延伸。[A 图源自 G. Manning 与 M.A. Krasnow，收录于《黑腹果蝇的发育》（A. Martinez-Arias 与 M. Bates 编）第 1 卷第 609-685 页。纽约：冷泉港实验室出版社，1993 年。经冷泉港实验室出版社许可使用。]

例如，生长芽周围的基底层会被基质降解酶穿孔。这种基质的局部软化促使上皮优先向更柔韧的区域生长。因此，细胞外阻力的变化以及动态的细胞内力量可产生驱动形态发生事件的力不平衡。

= 细胞迁移受环境信号引导 =
细胞的诞生地往往远离其在体内的最终位置。例如，我们的骨骼肌源自体节中的肌细胞前体（即成肌细胞），这些细胞从体节迁移至四肢及其他区域。迁移细胞遵循的路径及其定植位置的选择，决定了体内肌肉的最终分布模式。胚胎结缔组织构成了成肌细胞迁移的框架，这些组织提供了引导成肌细胞分布的关键信号。无论来自哪个体节，迁移至前肢芽的成肌细胞将形成适合前肢的肌肉模式，而迁移至后肢芽的成肌细胞则会形成适合后肢的模式。正是结缔组织提供了这种模式形成的信息。

当一个迁移细胞穿越胚胎组织时，它会不断伸出表面突起探测周围环境，通过其特定的细胞表面受体蛋白组合来检测对其特别敏感的线索。这些受体在细胞内与皮层肌动蛋白和肌球蛋白细胞骨架相连，推动细胞前进（参见第16章）。某些细胞外基质分子，如纤连蛋白，提供粘附位点协助细胞推进；而其他分子，如硫酸软骨素蛋白聚糖，则会抑制运动并阻止迁移。迁移路径上的非迁移细胞表面同样可能存在吸引性或排斥性大分子；有些细胞甚至可能伸出丝状伪毛以宣告自身的存在。

除了通用的黏附分子外，迁移细胞还能通过特定化学或机械信号引导，这些信号由专门的受体感知。在众多影响因素中，有几个尤为关键。特别是，多种迁移细胞受到趋化作用的引导，该过程依赖于一种称为 CXCR4 的 G 蛋白偶联受体，该受体被细胞外配体 CXCL12 激活。表达这种受体的细胞能够沿着 CXCL12 标记的路径移动（图 21-56）。向 CXCL12 源头的趋化作用在引导淋巴细胞和各种其他白细胞的迁移、发育中大脑神经元的迁移以及进入肢体的成肌细胞的迁移中起着重要作用。

图 21-56 CXCL12 引导生殖细胞迁移。斑马鱼生殖细胞会迁移至表达 CXCL12 的区域。随着 CXCL12 表达位点的变化，细胞循着 CXCL12 轨迹被引导至发育后期形成性腺的区域。（A）在 4 体节期，生殖细胞从靠近中线位置向表达 CXCL12 的侧部区域移动。（B）当 CXCL12 表达范围收缩时，生殖细胞被引导至更靠后的位置，即性腺发育处。

图 21-57 通过局部泡状突起的定向迁移。（A）生殖细胞通过细胞前缘称为"泡状突起"的凸起结构迁移，该处质膜局部脱离下方的肌动蛋白皮层并向外凸出（参见图 16-18）。（B）凸起的持续存在位置倾向于 CXCL12 浓度更高的区域。因此，生殖细胞沿着 CXCL12 浓度梯度迁移。注意这种细胞迁移形式不同于基于肌动蛋白富集的片状伪足的迁移方式（参见图 21-18 和图 21-59）。

芽体；原始生殖细胞在向发育中的性腺移动过程中；以及癌细胞转移时的迁移方式。

对原始生殖细胞迁移的详细研究表明，CXCL12 信号传导并非直接诱导细胞迁移，而是用于控制其方向。在缺乏 CXCL12 信号传导的情况下，生殖细胞仍表现出与细胞迁移相关的膜泡形成，但形成泡状突起的细胞前端位置是随机选择的（图 21-57），迁移更类似于随机游走；若 CXCL12 信号传导完整，则面向 CXCL12 源头的细胞侧面更频繁形成泡状突起，从而实现定向迁移。

= 迁移细胞的分布取决于生存因子 =
迁移细胞的最终分布不仅取决于它们选择的路径，还取决于它们是否能在迁徙过程中存活并在目的地环境中繁衍生息。特定位点会提供特定类型迁移细胞存活所需的生存因子。

在脊椎动物胚胎中，最重要的迁移细胞群之一是神经嵴细胞。它们起源于外胚层中将要形成表皮的区域与将要形成中枢神经系统的区域之间的边界地带。当神经外胚层卷曲形成神经管时，神经嵴细胞从这一边界区域的表皮层脱离，开始其漫长的迁移之旅（参见图19-8和影片21.7）。这些细胞最终定居于多个部位，并分化出令人惊异的多种细胞类型。部分细胞将分化为周围神经系统的神经元和胶质细胞——不仅存在于靠近脊髓的感觉神经节中，还会经过更长距离的迁移后定居于肠壁。另一些细胞将构成面部的骨骼组织；还有一些则会驻留在皮肤中，特化为色素细胞。

通过研究色素沉着缺陷的动物，科学家们识别出一种对神经嵴细胞存活至关重要的信号通路。许多自然发生的突变小鼠，在其通常为黑色的毛发上出现白斑，这些突变是由于编码一种名为干细胞因子的分泌肽的基因存在缺陷所致。干细胞因子由迁移路径上的组织产生，作为迁移中神经嵴细胞的生存因子。在干细胞因子或其受体——一种名为 Kit 的跨膜酪氨酸激酶——存在缺陷的动物中，许多迁移中的神经嵴细胞会通过凋亡死亡。结果，突变个体出现无色素（白化）的皮肤斑块（图 21-58）。干细胞因子同样是其他类型迁移细胞的重要生存信号，包括

图 21-58 Kit 基因突变的影响。婴儿与小鼠均携带功能缺失型突变杂合子，导致其体内 Kit 基因产物（即干细胞因子 SCF 的受体）仅存正常量的一半。两者均出现色素沉着缺陷，因为色素细胞的生存依赖于 SCF。（由 R.A. Fleischman 提供，摘自 R.A. Fleischman 等人，《美国国家科学院院刊》88:10885-10889, 1991。）

原始生殖细胞和血细胞前体。完全缺乏干细胞因子或 Kit 的小鼠会不育，并最终因贫血而死亡。

= 细胞以群体迁移方式实现大规模形态发生运动 =
除了单独移动外，细胞还能以群体形式迁移，彼此保持联系并展现出与独立迁移细胞不同的协调行为。这些运动被称为集体细胞迁移，它们根据细胞组织方式的不同分为多种形式。例如，神经嵴细胞进行链式迁移，细胞像溪流般排成队列依次跟随（图 21-59A）。尽管它们之间的关联较为松散，但细胞间的接触对于沿着由 CXCL12 等趋化因子确定的路径定向迁移至关重要。虽然单个神经嵴细胞对此信号反应较弱，但首尾相接的细胞接触会在群体内诱导极性，从而驱动迁移链中每个细胞前缘的突起形成。

斑马鱼的发育过程为第二种集体细胞运动形式——集群迁移（图 21-59B）提供了良好范例。这类迁移发生于具有凝聚性的细胞群中，这些细胞通常源自间充质，群体中的先导细胞展现出最显著的伪足伸展行为。在斑马鱼胚胎中，一个称为侧线原基的细胞簇从耳后位置开始迁移，穿越躯干肌肉组织向尾部移动。迁移中的原基细胞持续分裂，部分细胞在移动过程中被滞留并形成感觉结构。特定迁移路径由预先形成的 CXCL12 蛋白条纹布局，但有趣的是这种配体并未以梯度形式表达。相反，细胞簇自身会生成局部梯度——先导细胞与跟随细胞均表达 CXCR4 受体，但跟随细胞还额外表达一种称为 CXCL7 的非功能性 CXCL12 受体，该受体如同"吸收池"般削弱集群后部的 CXCL12 信号效应，最终在细胞簇内部形成引导迁移方向的差异化信号传导。

整个上皮组织可以以第三种集体迁移形式移动，称为片层迁移（见图 21-59C）。在此过程中，细胞群保持强粘附性和顶基极性；位于片层前缘的细胞伸出强健的伪足探索环境，而跟随细胞则形成短小的基底伪足，这些伪足同样朝向迁移方向。集体片层迁移能够融合相邻上皮组织，填补发育过程中形成的间隙，这在果蝇和秀丽隐杆线虫胚胎发育末期或伤口愈合过程中可见。它还能通过双侧原基融合形成单一器官，例如哺乳动物腭部的形成过程。有趣的是，上皮迁移可在没有自由前缘的情况下发生，如发育中果蝇卵室球形上皮所示。这种情况下，由定向基底伪足驱动的集体上皮迁移促使整个组织进行多轮旋转，这是塑造成熟卵形的必要过程。细胞向哺乳动物肠绒毛顶端的迁移，

图 21-59 集体细胞迁移。细胞突起以红色显示。（A）进行链式迁移的细胞仅松散连接，但与前方细胞的瞬时接触会使后方细胞的突起（红色）极化，促进共享运动轨迹。（B）簇状迁移涉及成群的黏附细胞，其中少数"先导"细胞向移动方向延伸突起。（C）在片层迁移中，大群紧密黏附的上皮细胞协调一致地共同移动，通常具有自由边缘，该处细胞呈现部分间充质形态，并产生引导迁移的强健突起。在领先边缘后方的细胞中也可见较小的定向突起。

维持肠道稳态（参见图22-4）似乎也涉及连续上皮片层的类似运动。

= 摘要 =
动物组织通过细胞形态、排列或位置的显著变化塑造而成。这些变化源于细胞受力平衡的改变，通常由调控肌动球蛋白收缩性或细胞粘附性的基因表达所触发。表面具有相似粘附分子的细胞会相互粘附，并倾向于与具有不同表面特性的其他细胞群分离。选择性细胞间粘附通常由钙粘蛋白介导；排斥作用则常由 Ephrin-Eph 信号传导驱动。在组织内部，细胞能够重新排列自身以驱动会聚延伸运动，从而导致组织沿体轴方向伸长。许多运动通过平面极性信号通路进行协调，该通路还负责在各种类型上皮组织中正确定向细胞。上皮管道的形成方式多样，最简单的是由于顶端表面收缩导致上皮片段卷曲并夹断而形成。精细分支的管状结构，如肺的气道，是通过上皮芽与它侵入的间充质之间的双向信号传导产生的，这一过程称为分支形态发生。分支及其他形态发生事件受细胞外基质和细胞内部变化的调控。长距离迁移的细胞，如神经嵴细胞，会脱离原有的邻近细胞，穿越胚胎定居新位置。许多迁移细胞，包括原始生殖细胞，依赖受体 CXCR4 及其配体 CXCL12 的趋化性引导。相互连接的细胞群也能迁移，其中领路细胞和跟随细胞表现出不同的行为。这种集体细胞迁移实现了大规模的组织塑造。

= 生长 =
发育中最基本的一个方面，我们对其了解却出奇地少——那就是动物或器官的大小是如何决定的。例如，为什么我们人类会长得比老鼠大得多？所有哺乳动物都是从大小相似的卵细胞发育而来，但成年后，最小（如鼩鼱）与最大（如蓝鲸）之间的体重差异可达一亿倍。即便在同一物种内，体型也可能差异巨大；例如，大丹犬的体重可能超过吉娃娃的40倍（图21-60）。除了遗传因素，环境也起着作用——一条被放归野外的金鱼可能比养在家用水族箱里的同类大上10倍。

器官或生物体的大小由三个变量决定：细胞数量、细胞大小以及每个细胞的细胞外物质数量。尺寸差异可能源于这些因素中任意一项的变化（图21-61）。例如，比较小鼠与人类时，我们发现差异主要在于细胞数量——人类细胞数量约为小鼠的3000倍，对应体重也约为3000倍。另一方面，野生与栽培食用植物物种的体型差异则主要源于细胞大小的不同。

图21-61 器官大小的决定因素。组织可通过调节细胞生长、增殖、死亡或这些过程的组合来控制尺寸。细胞外基质沉积同样发挥作用，尤其在骨与软骨等动物组织以及植物中尤为显著。

图 21-60 同一物种的个体可能存在显著体型差异。吉娃娃体重为 2-5 公斤，而大丹犬体重可达 45-90 公斤。（由 Deanne Fitzmaurice 提供。）

因此，挑战在于理解细胞数量、细胞大小以及细胞外基质产生的调控机制。首先，我们需要识别驱动或抑制生长的信号。接着，我们必须揭示这些信号本身是如何被调控的。在某些情况下，器官的生长由发育程序决定，这些程序并不监测结构已达到的尺寸。而在其他情况下，器官或整个身体的生长是通过稳态机制控制的，即使在面临剧烈干扰时也能达到“目标尺寸”。这表明发育中的结构通过局部或全身信号以某种方式感知自身大小，并利用这一信息来调节其生长或萎缩。

一些经典的移植实验很好地展示了控制策略的多样性。若将多个胎儿胸腺移植至发育中的小鼠体内，每个胸腺都会生长至其特有的成体大小。相反，若移植多个胎儿脾脏，则每个脾脏最终都会小于正常尺寸，但它们的总合会达到一个成体脾脏的大小。由此可见，胸腺的生长受个体器官内在的局部机制调控，而脾脏的生长则由感知全身脾脏组织总量的系统性反馈机制控制；这两种机制的具体原理目前均属未知。身体部位的大小和比例往往取决于尺寸测量反馈控制与细胞内程序的组合作用，同时也受到营养和栖息地等环境因素的影响。

= 细胞增殖、死亡与大小决定器官及生物体尺寸 =
秀丽隐杆线虫展示了体型差异如何产生。正如我们之前讨论的，同一性别的每个个体都通过几乎完全相同的细胞分裂和细胞死亡序列生成，因此拥有完全相同数量的体细胞——成年雌雄同体个体中为959个（见图21-42）。在雌雄同体发育过程中，超过1000次细胞分裂产生了1090个体细胞，但其中131个细胞经历了程序性细胞死亡。因此，对细胞分裂和细胞死亡的精确调控决定了线虫体内最终的体细胞数量。

秀丽隐杆线虫仅需 3 天便能生成所有成体体细胞，此后细胞分裂仅发生在生殖系中。然而这种蠕虫仍持续生长，在性成熟后的 2-3 周生命期内体积翻倍。这种增长源于体细胞生长：虽然细胞不再分裂，但仍持续进行多轮 DNA 合成；基因组的这种内复制使细胞变为多倍体。与所有生物体相同，细胞大小与其倍性（即所含基因组拷贝数）成正比：倍性翻倍会使细胞体积大致加倍。因此，蠕虫的最终体型由程序性细胞分裂和死亡共同决定，同时通过对倍性变化的调控来实现单个细胞尺寸的调节。

基因组的内复制作为增大细胞体积的一种方式，并非秀丽隐杆线虫所独有，而是在许多动物的特定组织中以一种发育调控的方式发生。在一个极端例子中，支配软体动物海兔大面积区域的神经元可能包含比二倍体细胞多出数十万倍的基因组拷贝，并且直径可增长至 1\mathrm{mm} （图21-62）。

图 21-62 海蛞蝓的巨型神经元具有高度多倍体特性。(A) 软体动物加州海兔（学名 Aplysia californica），因其化学感应触角竖立如耳常被称作海兔，体重可超过 2\mathrm{kg} 。加州海兔中枢神经系统包含称为神经节的神经细胞体集群。(B) 解剖后的腹神经节内含 R2 等巨型神经元，这些细胞通过内复制机制产生 \sim 300,000 份二倍体基因组副本，被认为是自然界中发现的最大体细胞。加州海兔及其巨型神经元为单细胞层面的生理学、生物化学和基因组学研究提供了可能，成为研究神经回路如何控制行为的理想模型。(A 和 B 图由 Lynne Fieber 与 Michael Schmale 提供。)

倍性变化也可能在新物种进化过程中出现，从而推动整个动物体型的变化。非洲爪蟾拥有四倍体基因组，其体重约为二倍体近亲热带爪蟾的两倍（图21-63）。这两个物种在生物体、细胞和亚细胞层面均表现出显著的大小比例关系：体型较小的青蛙拥有更小的细胞，而较小的细胞又含有更小的细胞核。与动物界相似，植物界也存在细胞大小随倍性增加而增大的现象（图21-64）。这一效应已被应用于农业育种中以培育大型作物：我们日常消费的主要果蔬大多属于多倍体。

= 细胞大小的变化通常源于细胞周期的改变 =
尽管理解器官和生物体大小如何确定是基础性的，但细胞大小本身如何设定和维持仍是一个未解之谜。如第 17 章所述，细胞大小的增加（生长）通常与细胞周期进程（分裂）相协调，以维持细胞大小的稳态。然而，细胞可以解耦这两个过程，例如在卵细胞生长期间，其体积显著增大却不复制基因组或分裂。受精后，这一现象发生逆转，当多轮 DNA 复制和细胞分裂在没有生长的情况下进行，形成许多小细胞。

内复制通过基因组再复制来扩大体细胞，是细胞周期的另一种变异形式。尽管 S 期照常进行，

图 21-64 倍性对细胞大小与器官尺寸的影响。从细菌到人类的所有生物体中，细胞大小与倍性（每个细胞中基因组的拷贝数）成正比。这通过（A-D）拟南芥花和（E）蝾螈示例说明。每种情况下，上图显示特定组织中的细胞[拟南芥的花瓣，蝾螈的前肾小管]；下图展示宏观解剖结构——拟南芥的花，蝾螈的全身。对于拟南芥花而言，细胞增大导致器官尺寸增加。相反，蝾螈及其单个器官无论倍性如何都能达到正常标准尺寸，因为较大的细胞尺寸通过细胞数量减少得到补偿。这表明该物种中生物体或器官的尺寸并非简单地通过计算细胞分裂次数或细胞数量来控制；尺寸必须在总细胞质量的层面上以某种方式被调控。[A-D 图源自 C. Breuer 等，《植物细胞》19:3655-3668, 2007，经美国植物生物学家协会许可使用；E 图改编自 G. Fankhauser，收录于《发育分析》（B.H. Willer 等编）第 126-150 页] 费城：桑德斯出版社，1955年。

有丝分裂周期蛋白水平过低，无法诱导 M 期，多倍体细胞通常完全停止分裂，进入后分裂状态。在缺乏细胞分裂的情况下，额外的 DNA 复制轮次导致细胞体积增大。在某些组织中，如肝脏和心肌，DNA 复制后伴随核分裂，但无胞质分裂，通过称为核内有丝分裂的过程形成具有多个细胞核的多倍体细胞。无论是否发生核分裂，倍性增加均伴随细胞生长，并有助于组织功能。例如，哺乳动物胎盘的滋养层细胞经历八轮核内复制，产生对形成母胎间组织屏障至关重要的巨细胞。

多倍体如何增大细胞体积？一种观点认为，基因拷贝数的增加通过产生更多基因产物来提升生物合成能力。然而，在所有物种中均观察到基因组大小与细胞尺寸呈显著正相关，且与编码蛋白质的基因组比例无关。例如，尽管所有脊椎动物具有相似数量的编码基因，但蝾螈蝾螈的二倍体基因组大小是人类基因组的 10 倍（包含 10 倍以上的非编码 DNA）。值得注意的是，蝾螈细胞也比人类细胞大 10 倍。基因组大小与细胞尺寸之间比例关系的分子基础，仍是生物学中众多未解之谜之一。

= 动物与器官具备评估和调节总细胞质量的能力 =
动物或器官的大小取决于细胞大小和细胞数量，即总细胞质量。值得注意的是，许多动物和器官能够以某种方式评估其总细胞质量并对其进行调节，这为我们先前在生长控制一般原则介绍中强调的反馈控制机制提供了证据。与秀丽隐杆线虫不同，在这些情况下，若人为增大或减小细胞体积，细胞数量会相应调整以维持相同的总细胞质量。这一点早已通过蝾螈实验得到完美印证——通过改变动物倍性可操纵细胞大小。如图 21-64E 所示，不同倍性的蝾螈最终体型相同，但细胞数量差异巨大。例如五倍体蝾螈的单个细胞体积约为单倍体蝾螈的五倍，但细胞数量仅为其五分之一。这种缩放效应不仅作用于整体躯体，同样体现在各个器官中。五倍体蝾螈拥有与二倍体同类相同大小的大脑，但神经元数量显著减少且结构简化。

果蝇的成虫盘为稳态尺寸调控提供了另一个引人注目的例证。这些盘状上皮囊在幼虫期通过细胞增殖生长，并在蛹期形成成年蝇的器官与肢体（图21-65）。实验主要针对翅成虫盘开展。通过突变细胞周期调控机制中的组件，可以加速或减缓盘中细胞的分裂速率。值得注意的是，这类突变分别会导致异常小细胞数量过多或异常大细胞数量减少，但成年翅膀的尺寸（面积）和图案却几乎保持不变。由此可见，

图 21-65 果蝇翅成虫盘的生长过程。A-C 组图示展示了经过变态后形成成虫翅膀和背侧胸部的细胞位置。(A) 最初， \sim 30 细胞在胚胎的第二胸节被指定为翅膀和背侧胸部的先驱细胞。这些细胞在幼虫期的 4 天内快速分裂。(B) 变态前的幼虫体内，这些细胞组织成一个简单的袋状上皮器官——翅成虫盘，其中包含 \sim 30,000 个细胞，直径为 \sim 400 \mu \mathrm{m} 。其他成虫盘（未显示）则发育成果蝇大部分其他外部结构。(C) 最终形成的成虫翅膀长度为 \sim 2.25 毫米。(D, E) 形态发生素 Dpp 在翅成虫盘中央呈条带状表达（绿色），向边缘扩散并影响盘的生长及细胞命运。若在幼虫发育后期移除成虫盘中的 Dpp 表达，翅成虫盘及最终形成的翅膀会按比例缩小。（D 和 E 图源自 S. Matsuda 与 M. Affolter，eLife 6:e22319, 2017，doi 10.7554/eLife.22319。）

该盘状结构并非通过计算细胞分裂次数以产生固定数量的细胞来确定。相反，必然存在一种调控机制，在盘状结构总细胞量达到适当值时停止生长，从而确保后续发育形成的成虫翅膀形态正常。更值得注意的是，若将幼龄盘状结构甚至其碎片从正常环境中取出，移植到成虫雌性腹腔这种允许生长的环境中，它们仍会生长至正常大小后停止。显然，调控器官尺寸的机制内在于盘状结构本身。

关于生物体或器官如何评估总细胞量或监测自身生长，我们知之甚少。然而，我们正逐步理解某些信号分子——它们响应传递已达成尺寸信息的神秘信号，从而驱动或抑制生长过程。

= 多种细胞外信号刺激或抑制生长 =
要形成具有正确形态和比例的器官，组织内的细胞增殖与细胞生长必须协调一致。虽然部分调控通过生长调节激素系统性进行（稍后讨论），但也存在组织自我调控生长的有趣案例。果蝇翅成虫盘的研究揭示了这一机制的可能实现方式（见图 21-65），其中 \mathrm{TGFB} 家族成员 Dpp 发挥着关键作用。我们此前曾提及 Dpp 作为形态发生素参与果蝇胚胎背腹轴模式构建；在成虫盘中，它通过类似机制从盘体中央的狭窄条带扩散，根据距离差异指定不同细胞命运。实验表明，这种中心源发出的 Dpp 梯度同时影响组织尺寸——可能是因为盘体生长导致远离信号源的细胞接受较低水平的 Dpp 信号（见图 21-65D 和 E）。将组织生长与模式形成相耦合，可确保器官尺寸变化时细胞分化和分布也发生相应调整。

并非所有调节生长的细胞外信号都促进生长；有些通过促进细胞死亡或抑制细胞生长、细胞分裂或两者兼而有之来抑制生长。肌肉生长抑制素是另一个 \mathrm{TGFB} 家族成员，专门抑制成肌细胞的生长和增殖——这些前体细胞融合形成骨骼肌中巨大、多核的细胞。在这种情况下，组织自身产生信号，因此随着肌肉形成增多，肌肉生长抑制素水平上升，最终关闭肌肉生长。当肌肉生长抑制素基因被删除时，可以观察到这种简单的器官大小反馈机制的重要性：突变小鼠的肌肉会长到正常大小的数倍。值得注意的是，两种很久以前为获得大肌肉而培育的牛品种，其肌肉生长抑制素基因均发生突变，某犬种也是如此（图21-66）。

= Hippo 通路传递调节生长的机械信号 =
在许多组织中，器官生长由一种称为 Hippo 通路的内细胞信号系统调控。该通路最初在果蝇中发现，但也存在于脊椎动物中。其名称源于当

(A) 野生型

(B) 肌肉生长抑制素突变体

图 21-66 肌肉生长抑制素限制肌肉生长。(A) 标准型惠比特犬与(B) 缺乏肌肉生长抑制素的壮硕型惠比特犬。(A 图由 Bianca Grueneberg/Getty Images 提供；B 图©2020 Stuart Isett，版权所有。)

该通路处于非激活状态时，野生型动物中的 Hippo 信号通过促进细胞死亡（通过阻断凋亡抑制剂）和抑制细胞周期进程（通过抑制细胞周期基因 Cyclin E 的表达）来抑制生长。果蝇中该通路的部分组分如图 21-67 所示。对 Hippo 抑制异常抵抗的动物器官可生长至巨大尺寸（图 21-68）。

与许多涉及信号分子与专用受体结合的信号通路不同，Hippo 通路似乎主要受机械力和细胞结构调控。细胞-细胞接触、细胞-基质接触、细胞骨架张力以及细胞的顶基极性均可影响 Hippo 激活。通过这种机制，组织能感知环境中的物理和化学信号，并相应调节自身生长。

= 激素协调全身生长 =
我们已经了解到一些信号如何作为激素在全身范围内调节动物的整体发育。其中一些激素负责调控生长。例如，在哺乳动物中，生长激素（GH）由垂体分泌进入血液，并刺激全身生长：GH 分泌过多会导致垂体性巨人症，而过少则会导致侏儒症（图 21-69）。GH 水平较低的垂体性侏儒症患者，其身体和器官均按比例缩小，与软骨发育不全性侏儒症形成对比，后者的四肢通常因编码 PGF 受体的基因发生突变而异常短小，这种突变会干扰正常的软骨和骨骼发育（图 21-60）。

生长激素主要通过刺激肝脏及其他器官产生胰岛素样生长因子 1（IGF1）来促进生长，该因子在多数组织中主要作为局部信号发挥作用。IGF1 及其相关因子是强效的生长促进剂，能根据细胞类型不同，增强细胞存活、细胞生长、细胞增殖或这些效应的某种组合。大型犬种如大丹犬因其体内高水平的 IGF1 而体型巨大，而迷你犬种如吉娃娃则 IGF1 水平较低（参见图 21-60）。

值得注意的是，所有物种中营养状况对生长速度与程度的调控都起着根本性作用。在动物体内，这一调控通过高度保守的激素信号网络实现，

图 21-68 克服 Hippo 抑制可增大器官尺寸。（A）当小鼠肝脏中过表达 Yap 时，Hippo 信号通路无法抑制其活性，导致过度生长。（B）当果蝇眼睛表达无法被 Hippo 信号磷酸化抑制的 Yorkie/Yap 蛋白时，同样会出现过度生长现象。（A 图改编自 J. Dong 等，《细胞》130:1120-1133, 2007，经爱思唯尔许可使用；B 图由 Jung Kim 提供。）

脊椎动物与无脊椎动物。遗传实验，尤其是在''果蝇''中的研究，已开始揭示这些调控机制的运作逻辑，并指出它们如何与诸如 Hippo 信号通路等其他机制协同作用，共同决定最终体型。

= 生长持续时间影响生物体大小 =
除生长速率外，生物体的最终大小还取决于生长持续的时间。某些动物在生命周期中存在明确的允许生长阶段，这类物种被称为具有''确定性生长''特性。人类的生长期在青春期结束时终止，而许多昆虫的生长则随着变态发育的开始而停止。这两种情况都是由激素释放触发的，这些激素促使生物体向性成熟过渡。此后，细胞增殖仅限于通过成体干细胞的作用维持组织稳态（参见第 22 章），尽管脂肪细胞等特定细胞仍可继续显著生长。激素释放的时机受多种因素影响，其中营养状况和幼体体型为设定最终体型提供了重要参数。

其他物种表现出''无限生长''特性，只要环境条件适宜，它们一生都能持续增大体型。龙虾和许多鱼类是常见例子，但无限生长现象广泛存在于生命树的多个分支中。植物通过名为分生组织（参见第 19 章）的特殊区域进行细胞增殖，同样展现出有限与无限两种生长模式。巨杉及其他红杉树属于后者例证，而前者包括为追求最大化和同步果实产量而选育的农作物。包括番茄在内的某些物种，同时存在有限生长和无限生长品种。决定一个生物体终止生长点，却让近缘物种终生持续生长的机制至今仍未可知。

= 摘要 =
动物物种及其器官的大小差异巨大，主要取决于细胞的大小和数量，这两者分别通过细胞生长和细胞分裂得以增加。细胞数量则通过细胞死亡——主要是凋亡——而减少。谜团在于，单个细胞内关于生长、分裂和死亡的决策是如何被调控和协调，以形成成年动物特有的最终体型。

某些信号如生长因子、有丝分裂原和存活因子在器官中发挥作用以刺激生长，而其他信号分子则起相反作用。这些信号在发育模式程序的控制下被部署，并影响细胞周期或凋亡机制，从而产生组织特异性的生长结果。许多动物和器官能够评估自身的总细胞质量并进行调节，即使在人为改变细胞生长或数量的情况下，也能达到一致的目标大小。补偿机制尚不明确，但已发现确保器官不会超过特定大小的信号通路。

尽管这些信号大多在局部作用以塑造器官和附肢的大小，但另一些则作为激素调节动物整体的生长。营养物质可通过刺激全身激素信号的释放来调控生长。生命中可以生长的时期也受激素控制。最终生物体的大小反映了上述所有机制的综合输出。

1米

图 21-70 软骨发育不全。这种侏儒症见于委拉斯开兹的画作中，每 10,000 至 100,000 名新生儿中有一例发生；超过 59% 的病例源于基因组中同一位置的突变，对应 FGF 受体 FGFR3 中的第 380 位氨基酸（跨膜结构域中的一个甘氨酸）。该突变为显性遗传，几乎所有病例均由新的、独立发生的突变引起，表明该特定基因组位点的突变率异常高。FGF 信号传导缺陷通过干扰发育中长骨的软骨生长而导致侏儒症。（图片艺术收藏/Alamy Stock Photo。）

= 问题 =

= 哪些说法是正确的？解释原因。 =
21-1 在早期卵裂阶段，当胚胎尚不能自行摄食时，发育进程完全由母体沉积在卵子中的物质驱动和控制。

21-2 由于后期许多发育转变会形成结构精细的器官，原肠胚形成阶段建立的体型结构与成体的体型结构几乎不存在相似性。

21-3 随着发育的推进，谱系中的单个细胞能够分化产生的细胞类型范围变得越来越受限。

21-4 在胚胎发育的不同阶段，相同的信号被不同细胞反复利用，却产生不同的生物学结果。

21-5 发育相关基因编码区的变化是造成物种间差异的主要原因。

21-6 细胞周期如同设定发育进程节奏的时钟，基因表达的成熟变化依赖于细胞周期的推进。

= 讨论下列问题。 =
21-7 说出动物发育过程中三个基本过程，并用一句话描述每个过程。

21-8 说出原肠胚形成过程中早期胚胎的三个胚层，并列出每个胚层在成体中形成的主要结构。

21-9 在果蝇早期胚胎中，似乎不需要通常形式的细胞间信号传导；相反，转录调节因子和 mRNA 分子在细胞核之间自由移动。这怎么可能呢？

21-10 形态发生素在发育过程中起着关键作用，形成浓度梯度以告知细胞它们的位置和行为方式。检查图 Q21-1 中旗帜所代表的简单图案。你认为哪些可以由单一形态发生素的梯度形成？哪些需要两种形态发生素的梯度？假设这些图案存在于细胞层中，解释形态发生素如何创建这些图案。

图 Q21-1 三个国家的国旗（问题 21-10）。（左图，railway fx/Shutterstock；中图，Creative Photo Corner/Shutterstock；右图，Derek Brumby/Shutterstock）

21-11 在线虫中，两个相邻细胞通常会分化为锚定细胞（AC）和腹侧子宫前体细胞（VU），但具体哪个细胞成为 AC、哪个成为 VU 完全是随机的。这两个细胞有同等机会选择任一种命运，但总是选择相反的命运。Lin12 基因的突变会改变这些命运。在过度活跃的 Lin12 突变体中，两个细胞都变成 VU 细胞；而在失活的 Lin12 突变体中，两个细胞都变成 AC。因此，Lin12 在决策过程中起着核心作用。在遗传嵌合体中，若一个前体细胞具有过度活跃的 Lin12，另一个前体细胞具有失活的 Lin12，那么携带过度活跃 Lin12 基因的细胞总是成为 VU 细胞，而携带失活 Lin12 基因的细胞总是成为 AC。假设一个细胞发出信号，另一个细胞接收信号，请解释这些结果如何表明 Lin12 基因编码的蛋白质是接收信号所必需的。并对野生型线虫中这两个前体细胞的命运通常如何决定提出建议。

21-12 早在研究发育的初期就已明确，卵中含有某些“形态发生”物质，这些物质被不对称地分配到发育中胚胎的细胞内。一项针对海鞘胚胎的研究考察了内胚层碱性磷酸酶，该酶可通过组织化学染色法显现。用细胞松弛素 B 处理胚胎会停止细胞分裂，但不会阻止碱性磷酸酶在适当时机的表达。用放线菌素 D 处理（该药物能阻断转录）并未干扰碱性磷酸酶的表达。而用嘌呤霉素处理（该药物能阻断翻译）则消除了碱性磷酸酶的表达。导致碱性磷酸酶产生的形态发生物质可能具有何种性质？

21-13 小鼠的 HoxA3 和 HoxD3 基因是旁系同源基因，它们位于各自 Hox 基因簇中的等效位置，并且在蛋白质编码序列上具有约 50% 的相似性。HoxA3 基因缺陷的小鼠在咽部组织方面存在缺陷，而 HoxD3 基因缺陷的小鼠则在轴骨架上表现出不足，这表明这两个旁系同源基因的功能截然不同。因此，当发现用正常的 HoxA3 基因替换有缺陷的 HoxD3 基因能够纠正缺陷，以及用正常的 HoxD3 基因替换突变的 HoxA3 基因的互逆实验也取得相同效果时，这一结果令人惊讶。然而，被置换的任一基因都无法履行其正常功能；也就是说，位于 HoxD3 位点上的正常 HoxA3 基因无法纠正由 HoxA3 位点上突变 HoxA3 基因引起的缺陷。HoxD3 基因的情况也是如此。如果 HoxA3 和 HoxD3 基因是等效的，你认为它们如何在发育过程中扮演如此不同的角色？你认为它们为何无法在新位置执行正常功能？

21-14 脊椎动物胚胎中体节的分割被认为依赖于 Hes7 基因表达的振荡。数学模型解释了这一现象。

这些振荡现象与不稳定 Hes7 蛋白的生产延迟有关，该蛋白作为转录调节因子关闭自身表达。一旦 Hes7 蛋白衰变（半衰期约 20 分钟），其转录便会恢复。为验证此模型，您决定通过移除小鼠 Hes7 基因中的一个、两个或全部三个内含子来缩短总延迟时间。为何预期内含子移除会减少延迟？若模型正确，您预测振荡时间及体节形成将发生何种变化？

21-15 驱动脊椎动物体节形成的振荡时钟包含三个关键组分：Her7（一种自身合成的不稳定抑制因子）、Delta（一种跨膜信号分子）和 Notch（Delta 的跨膜受体）。Notch 被相邻细胞上的 Delta 结合后，会激活 Notch 信号通路，进而启动 Her7 的转录。正常情况下，这一系统能精确运作，形成边界清晰的体节（图 Q21-2A）。然而在缺失 Delta 的情况下，只有前五个体节正常形成，其余体节边界模糊（图 Q21-2B）。若后期补充 Delta 脉冲，在 Delta 存在的区域体节形成会恢复正常（图 Q21-2C）。图 Q21-2D 展示了时钟各组分之间的连接及其在相邻细胞中的相互作用机制。在缺乏 Delta 的情况下，细胞为何会失去同步性？

图 Q21-2 斑马鱼胚胎中的体节形成（问题 21-15）。(A) 具有正常体节的野生型胚胎。(B) 缺乏 Delta 蛋白的胚胎中的体节形成。方括号标示最初形成时外观正常的体节区域。(C) 缺乏 Delta 蛋白但在其右侧方括号所示时间点接受 Delta 表达脉冲的胚胎中的体节形成。(D) 相邻细胞中振荡时钟组件间的相互作用。（改编自 C. Soza-Ried 等人，《发育》141:1780-1786, 2014。经生物学家公司许可转载。）

是什么让 Delta 的存在使得邻近细胞保持同步振荡？

21-16 细胞外蛋白因子 Decapentaplegic（Dpp）对果蝇翅膀的正常发育至关重要（图 Q21-3A）。它通常沿着前后边界在翅膀中部狭窄条纹区表达。Dpp 缺陷的果蝇会形成发育不全的“翅膀”（图 Q21-3B）。若将基因额外拷贝置于翅膀前部或后部活性启动子控制下，会在 Dpp 表达部位产生由外观正常细胞组成的大块翅膀组织（图 Q21-3C 和 D）。Dpp 是刺激细胞分裂、细胞生长还是两者兼有？你是如何判断的？

图 Q21-3 Dpp 表达对果蝇翅膀发育的影响（问题 21-16）。（A）正常 Dpp 表达。（B）无 Dpp 表达。（C）额外前部 Dpp 表达。（D）额外后部 Dpp 表达。（摘自 M. Zecca 等人，《发育》121:2265-2278, 1995。经生物学家公司许可使用。）

= 参考文献 =

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= 组织稳态与再生中的干细胞 =
细胞最初作为自由生活的个体演化而来，这样的细胞至今仍主导着地球及其海洋。然而对人类而言，最重要的细胞是多细胞共同体中专化的成员。这些细胞丧失了独立生存所需的特性，却获得了服务于整个机体需求的特殊功能。尽管共享同一基因组，它们在结构、化学特性和行为方式上展现出惊人的多样性。人体内已有命名的细胞类型超过200种，它们相互协作形成多种组织，进而组成执行广泛功能的器官。要理解这些细胞，仅靠培养皿中的分析远远不够：我们更需要了解它们在其自然栖息地——完整人体内如何生存、工作与消亡。

在第七章和第二十一章中，我们探讨了胚胎中各类细胞如何分化形成差异，以及细胞记忆和邻近细胞信号如何使它们在此后保持这种差异。第十九章讨论了细胞通过分子装置相互连接、利用细胞外基质支撑组织器官，从而实现多细胞组织自组装的机制。但成年机体并非静止不变：它处于动态平衡结构中，新细胞不断诞生、分化并死亡。稳态机制维持着恰当平衡，使得尽管新旧细胞持续更替，组织结构仍得以保持。

在本章中，我们重点探讨贯穿生命始终的这些稳态过程。通过这一探讨，我们将展示分化细胞类型的多样性，特别关注干细胞在许多成人组织中所起的作用——这些未分化细胞专门负责在需要持续更新或组织修复再生时大量需求的情况下，提供新的分化细胞供应。我们将看到许多成人组织具有持续自我更新与修复的能力，而其他组织则不具备这种特性，这种情况下，失去的细胞将永久缺失，导致耳聋、失明、痴呆等疾病。我们将讨论干细胞如何在自我更新的组织中维持存在，以及其子细胞命运如何被决定。随后我们将描述某些动物物种再生完整肢体或器官的非凡能力，其中一个极端案例甚至能从单个干细胞再生生物体的全部组织。在本章的最后一节，我们讨论了如何人工生成和操控干细胞，这引发了一个当前干细胞技术热潮背后的实际问题：我们如何利用对细胞分化和组织更新过程的理解来改进自然，修复那些迄今为止似乎无法治愈的与疾病和人体衰老相关的损伤和退化？

= 干细胞与组织稳态 =
干细胞与组织稳态在自我更新的成体组织中，细胞不断诞生、分化并死亡。这种细胞的“流动”可类比于河流中水的流动：河流日复一日看似相同，但随着水流向下游，水

= 第22章 =

= 本章内容 =
干细胞与组织稳态

干细胞命运与自我更新的调控

再生与修复

细胞重编程与多能干细胞

图22-1 组织稳态与河流的类比。在自我更新的成体组织中，由细胞分裂"上游"持续产生的新细胞流与"下游"不断丢失的分化细胞，共同维持着组织的动态平衡。

正如河流中的水永不重复（图22-1），自我更新组织的特征性结构虽细胞群体持续更替却得以保持——分化细胞在"下游"流失，干细胞在"上游"生成新细胞。因此，这类组织中的干细胞必须兼具自我复制和分化产生特定细胞的能力，以支撑生物体的整个生命周期。若无干细胞，这些组织器官将因无法跟上细胞自然更替的节奏而快速衰竭。事实上，干细胞功能缺陷正因如此会成为疾病与衰老的诱因。

在本节第一部分，我们将以两种上皮组织——肠道内壁和皮肤外表面为例，定义干细胞的基本特性。接着探讨如何通过细胞谱系追踪识别组织中的干细胞，或在血细胞的情况下，通过细胞移植研究进行识别。最后讨论那些在没有干细胞的情况下仍能自我维持的组织。

= 干细胞的定义在于其自我更新和产生分化细胞的能力。 =
许多成体组织，特别是那些细胞更新率高的组织，含有组织特异性干细胞（也称为成体干细胞）。这些组织各自拥有独特的干细胞群体，能够产生该组织特有的分化细胞，而非其他组织的细胞。每种组织的干细胞都有其独特的发育历程，不一定与其他组织的干细胞共享分子特征。

然而，所有干细胞都具有两个基本特性：(1) 它们能够在整个生物体生命周期内自我补充为干细胞——这一过程称为自我更新；(2) 它们还能产生分化细胞。因此，当干细胞分裂时，每个子细胞都面临选择：既可保持干细胞状态，也可启动分化进程（图22-2）。

干细胞通常不直接产生分化细胞；相反，它们会生成一种中间细胞类型，这种细胞虽已确定分化方向但仍持续增殖，从而产生更多数量的分化细胞。这些细胞被称为祖细胞；它们也被称为过渡扩增细胞，因为其分裂作用在于扩增分化细胞的数量。

图22-2 干细胞的定义特征。当干细胞分裂时，每个子细胞要么通过自我更新过程保持干细胞状态，要么在经历数次分裂后进入分化程序。自我更新过程维持着组织中干细胞池的稳定。

图22-3 干细胞、祖细胞与分化细胞的层级关系。除自我更新外，组织特异性干细胞通常会产生祖细胞（过渡扩增细胞），这些细胞在有限次数的分裂后终末分化。干细胞和祖细胞可以是单能或多能的，这取决于它们仅产生一种还是多种类型的分化细胞。

这些中间细胞最终源自每次干细胞分裂（图22-3）。与干细胞不同，这些中间细胞仅经历有限次数的分裂便会分化。当细胞抵达分化路径终点且不再分裂时，即达到终末分化状态。当成年干细胞或祖细胞产生多种分化细胞类型时，称为多能性；若仅产生一种分化细胞类型，则称为单能性（参见图22-3）。

我们现在考虑两种上皮组织，以说明这些不同类别的细胞如何在自我更新的成体组织中组织——肠道内壁和皮肤外层。在这两种情况下，干细胞在组织的一个表面持续产生过渡扩增的祖细胞，而终末分化细胞则从相对表面丢失——在我们的河流类比中，分别对应上游和下游。

= 小肠上皮内衬通过隐窝中的细胞增殖不断更新 =
小肠内衬（及肠道大多数其他区域）是单层上皮，仅一个细胞厚。肠上皮覆盖着伸入肠腔的绒毛表面，并衬里着下陷至下层结缔组织的隐窝（图22-4）。分裂细胞，包括干细胞和祖细胞，仅限于隐窝，而终末分化细胞则如稳定溪流般从隐窝涌出至绒毛。主要有四种类型的分化细胞——一种吸收型和三种分泌型（图22-5）。

# 吸收细胞（又称刷状缘细胞或肠上皮细胞）是上皮组织中的主要细胞类型，其暴露表面密布微绒毛。它们的功能是从肠腔吸收营养物质。为此，这些细胞还产生水解酶，执行食物细胞外消化的最终步骤。
# 杯状细胞向肠腔分泌黏液；这种黏液形成保护层覆盖在上皮表面。
# 潘氏细胞构成先天性免疫防御系统的一部分（详见第 24 章），能分泌杀菌蛋白质；同时分泌维持干细胞群所需的 Wnt 信号蛋白（详见第 15 章）。
# 肠内分泌细胞具有超过15种亚型，可分泌血清素和肽类激素。这些激素作用于肠壁神经元及其他细胞类型，调控肠道及其他组织细胞的生长、增殖与消化活动。

肠道内腔

如同在传送带上，吸收细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞从它们在隐窝中的诞生地出发，通过在上皮细胞层平面上的滑动运动向上移动，覆盖绒毛表面。从隐窝出现后的3-4天内（小鼠体内），这些分化细胞抵达绒毛顶端，随后被排入肠道内腔（参见影片20.7）。隐窝中的潘氏细胞数量较少且迁移模式不同，它们驻留在隐窝底部，虽然更新速度较慢，但仍持续更替，可存活数周后才经历细胞凋亡并被邻近细胞吞噬。

产生肠道上皮的干细胞位于隐窝基部上方，散布在潘氏细胞之间。这些干细胞之所以能被识别，是因为只有它们表达一种名为 Lgr5 的特殊 G 蛋白偶联受体，该受体可作为干细胞群体的特异性标记。当干细胞分裂时（在小鼠肠道中约每 24 小时分裂一次），部分后代细胞会定向分化，成为向上迁移的过渡扩增祖细胞，而其他细胞则通过自我更新过程保持干细胞状态。这些干细胞具有多能性，能够产生上皮中所有分化的细胞类型。

= 表皮干细胞在体表维持着自我更新、防水的上皮屏障 =
表皮干细胞在体表维持自我更新、防水、上皮屏障的功能。干细胞系统根据组织不同以多种方式组织。例如，身体的外上皮覆盖层——表皮，持续进行更新，但与肠上皮不同，它是多层或分层的。干细胞位于基底层，分裂中的过渡扩增祖细胞也位于此。一旦祖细胞停止分裂，它们便离开基底层向外移动至暴露表面，经历

图 22-4 肠道上皮内衬的更新过程。(A) 小肠内衬上皮细胞更替与增殖模式。干细胞（红色）位于隐窝基部，散布于不分裂的分化细胞（潘氏细胞）之间。干细胞后代主要从隐窝向上迁移至绒毛；经过数次快速分裂后停止分裂并分化——部分细胞在隐窝内即完成分化，多数细胞在离开隐窝时分化。与其他不分裂的分化细胞相同，潘氏细胞通过干细胞后代持续更新，但它们会向下迁移至隐窝基部并在该处存活数周。(B) 小肠部分内衬切片的显微图像，显示隐窝和绒毛结构。注意所有由干细胞产生的分化细胞类型混合存在，主要包括吸收细胞，其间散布着黏液分泌型杯状细胞（红色染色）。

图22-5展示了小肠上皮内衬中发现的四种主要分化细胞类型。所有细胞均以肠腔朝上的方向排列。粗橙色箭头指示每种细胞类型物质分泌或吸收的方向。这些细胞均由位于隐窝底部附近未分化的多能干细胞生成（参见图22-4）。吸收性（刷状缘）细胞在数量上以约10:1或更高的比例超过其他上皮细胞类型。其顶面微绒毛使表面积增加30倍，不仅用于营养物质的输入，还为执行细胞外消化最后阶段的酶提供锚定位点——将小肽和二糖分解成可跨细胞膜运输的单体。杯状细胞分泌黏液，是分泌性细胞类型中最常见的一种。潘氏细胞分泌（伴随某些生长因子）隐窝素——属于防御素家族的杀菌蛋白质。肠内分泌细胞的不同亚型向肠壁（继而进入血液）分泌血清素和肽类激素。胆囊收缩素是一种由肠内分泌细胞在肠道内营养物质存在时释放的激素。它与附近感觉神经末梢上的受体结合，促使胰腺释放消化酶和胆囊排出胆汁；同时向大脑发出信号，在进食足够后停止饥饿感。（吸收细胞和杯状细胞，Don W. Fawcett/Science Source；潘氏细胞和肠内分泌细胞，摘自 R.V. Krstic《人体组织学图解百科全书》。柏林：Springer-Verlag，1964 年。经 Springer Nature 许可使用。）

它们在此过程中逐渐完成终末分化，最终形成无生命的鳞屑，这些鳞屑最终会从皮肤表面脱落（图22-6）。

尽管表皮的结构与肠上皮大相径庭，但许多基本法则却相通。干细胞通过组织特定区域的信号得以维持，在表皮中这一区域是基底层及其下方的结缔组织。那些注定要分化的干细胞后代，在经历数次分裂后成为过渡扩增细胞。

图22-6 表皮的多层结构。表皮构成皮肤的外层覆盖，形成一道自我修复且持续更新的防水屏障。其下方是相对较厚的结缔组织层，包含富含胶原蛋白的坚韧真皮（皮革即由此制成）。表皮细胞被称为角质形成细胞，因为它们特有的分化活动是合成角蛋白中间丝蛋白，赋予表皮韧性。这些细胞在不同层次间改变外观与特性，经历规律的程序性终末分化。最内层附着于下方基膜的细胞称为基底细胞，通常只有这些细胞进行分裂：基底细胞群包含相对少量的干细胞及由其衍生的较多过渡扩增祖细胞。基底细胞上方是数层较大的棘细胞。棘细胞层之外是薄而染色深的颗粒细胞层，这里的细胞紧密连接形成防水屏障；这标志着内部代谢活跃层与表皮最外层之间的界限，最外层由细胞内细胞器已消失的死细胞构成。这些最外层细胞退化为扁平鳞片状，即角质鳞屑，内部充满紧密堆积的角蛋白，最终从皮肤表面脱落。从细胞离开基底层到从表面脱落的时间为一到两周，具体取决于身体部位和物种。

细胞在基底层中分化前。此外，尽管各自作用不同，但调控肠道干细胞系统的大多数信号通路也参与调节表皮干细胞系统。

= 细胞谱系追踪揭示干细胞及其后代的位置 =
在成人组织中，干细胞通常稀少且难以通过常规组织切片识别，除非存在如 Lgr5 这样的干细胞特异性标记。重组 DNA 技术提供了一种通用而强大的方法，通过细胞谱系追踪技术，在任何更新组织中识别干细胞及其后代。该方法利用转基因动物在少数细胞中创建可见的遗传标记，随着时间的推移，这些标记会产生分布广泛且易于区分的后代细胞克隆，如图 22-7 和图 22-8 所示。此方法无需预先知晓组织是否含有干细胞。若存在干细胞，它们将被随机标记并形成包含干细胞及分化细胞的持久克隆谱系（见图 22-7B）；分裂的前体细胞同样会被随机标记并产生标记克隆，但这些克隆最终都会消失（见图 22-7C）。对克隆的分析不仅能揭示是否存在干细胞，还能

图 22-7 使用遗传标记的克隆分析。(A) 含有两个转基因的转基因动物可用于驱动少量细胞中易于检测且可遗传的标记表达。第一个转基因编码标记基因，例如编码绿色荧光蛋白（GFP）的基因。然而，该 GFP 转基因的表达（此处以绿色显示）被两侧带有 LoxP 位点（粉红色；参见图 5-66）的阻断序列（红色）所阻止。第二个转基因 CreERT2（棕色）编码一种称为 CreERT 的嵌合型 Cre 重组酶，该酶由与雌激素受体蛋白连接的 Cre 重组酶组成；只有当其结合人工雌激素类似物他莫昔芬（红色球体）时，该酶才具有重组酶活性。添加他莫昔芬会导致重组事件，从而移除阻断 DNA 序列。结果，GFP 标记得以表达。由于阻断 DNA 已从基因组中永久移除，该标记在发生重组事件的细胞的所有后代中持续表达。使用低剂量的诱导分子他莫昔芬，可以在少数分布稀疏的细胞中随机激活标记，从而产生可区分的克隆。（B）若重组事件发生在干细胞中，将标记一个克隆谱系，随着标记干细胞的自我更新和分化细胞的生产，该标记会随时间持续存在。（C）若重组事件发生在非干细胞中，随着标记细胞分化并最终丢失，标记将随时间逐渐消失。

图 22-8 小肠中表达 Lgr5 的干细胞及其后代。此处对图 22-7 所示的基本方法进行了修改，以标记单个肠道干细胞并追踪其后代的命运。Lgr5 基因编码 G 蛋白偶联跨膜受体家族成员，并特异性表达于隐窝基底附近的干细胞中。本实验中，利用 Lgr5 启动子驱动 CreERT2 表达，低剂量他莫昔芬处理使得个别干细胞表达标记蛋白 LacZ（而非 GFP）。这些细胞及其所有后代随后可通过蓝色组织化学染色检测。图中所有蓝色细胞均源自单个表达 Lgr5 的干细胞。60 天后，可见该细胞的蓝色后代几乎遍布整个绒毛顶端。这些后代可被证实包含所有类型的分化细胞，以及在隐窝基底持续存在的 Lgr5 表达细胞。这证明表达 Lgr5 的细胞是多能干细胞。（改编自 N. Barker 等人，《自然》449:1003-1007，2007 年由自然出版集团出版。经 SNCSC 许可复制。）

不仅在于干细胞的存在，还在于它们的位置以及它们是单能还是多能。

如果已知某个基因在特定组织的干细胞中特异性表达，比如小鼠肠道中的 Lgr5 基因，就可以采用更有针对性的方法进行细胞谱系追踪。这种情况下，可以利用该基因的启动子使遗传标记仅在干细胞中表达。正是这类实验最初证实了小鼠肠上皮中表达 Lgr5 的细胞是干细胞，并且是多能性的（见图 22-8）。

= 静止干细胞难以通过谱系追踪识别 =
上述谱系追踪方法假设组织中的干细胞在活跃分裂，产生自我更新或分化的子细胞。然而，一些成体干细胞处于静止状态，作为需要时的“储备库”：它们很少分裂甚至不分裂，除非受到如组织损伤等刺激诱导。在这些情况下，可能需要额外的时间或刺激才能通过谱系追踪揭示干细胞的存在。

以人类骨骼肌为例，它由多核肌细胞（肌纤维）构成，这些细胞在发育过程中通过终末分化的成肌细胞融合形成。人类在成年期通常不会生成新的骨骼肌，但在需要肌肉生长或修复时仍具备这种能力。能够作为成肌细胞的细胞以小型、扁平且不分裂的状态保留下来，紧贴成熟肌纤维并包裹在基底层鞘内（图22-9）。当肌肉受损或受到生长刺激时，这些卫星细胞会被激活增殖，其后代可与现有肌纤维融合实现修复。

图 22-9 卫星细胞对骨骼肌纤维的修复过程。（A）标本采用针对肌肉钙黏蛋白（M-cadherin）的抗体（红色）染色，该蛋白同时存在于卫星细胞和肌纤维上，并在两者膜接触部位富集。肌纤维细胞核呈绿色，卫星细胞核呈蓝色。（B）示意图展示卫星细胞通过增殖与融合修复受损肌纤维的过程。（A 图由 Terence Partridge 提供。）

受损肌肉的修复或促进肌肉生长。因此卫星细胞或其特定亚群是成年骨骼肌的干细胞，通常保持静止状态备用，在需要时可作为自我更新的终末分化成肌细胞来源。

通过卫星细胞进行的肌肉修复过程在所能达到的效果上是有限的。例如，在某种形式的肌营养不良症中，细胞骨架蛋白肌营养不良蛋白的遗传缺陷会缓慢但持续地损害已分化的骨骼肌细胞。结果，卫星细胞增殖以修复受损的肌纤维。但这种再生反应无法跟上损伤的速度，最终结缔组织取代了肌纤维，阻断了任何进一步修复的可能性。类似的修复能力下降也导致了老年人中逐渐出现的肌肉衰弱现象。

= 造血干细胞可通过移植来识别 =
识别成体组织中干细胞的另一种方法是通过细胞移植。该技术最初用于鉴定造血（血液生成）系统的干细胞，这是成年哺乳动物体内最复杂的干细胞系统。造血干细胞既能生成红细胞（erythrocytes）也能产生白细胞（leukocytes），它们位于成年个体的骨髓中，并在此处生成血小板。白细胞包含多种类型，包括可离开血流发育为巨噬细胞的单核细胞——这类细胞存在于大多数器官中。当动物暴露于大剂量 X 射线时，骨髓中的造血细胞大多会被摧毁，导致动物因无法生成新血细胞而在数日内死亡。但若移植来自同品系健康供体小鼠骨髓的细胞，则该动物可获救。
{| class="wikitable"
| colspan="3" |表22-1 血细胞类型
|-
|细胞类型
|主要功能
|人类血液中的典型浓度（细胞/升）
|-
|红细胞（红血球）
|向组织输送氧气并带走二氧化碳
|5 × 10¹²
|-
| colspan="3" |白细胞（白血球）
|-
| colspan="3" |粒细胞
|-
|中性粒细胞（多形核白细胞）
|吞噬并杀灭入侵的细菌
|5 × 10^9
|-
|嗜酸性粒细胞
|消灭较大寄生虫并调节过敏性炎症反应
|2 × 10^8
|-
|嗜碱性粒细胞
|在某些免疫反应中释放组胺（某些物种中还包括血清素）
|4 × 10^7
|-
|单核细胞
|成为组织巨噬细胞，负责吞噬并消化入侵的微生物、异物以及受损衰老细胞；部分还会分化为树突状细胞
|4 × 10^8
|-
| colspan="3" |淋巴细胞
|-
|B 细胞
|制造并分泌抗体
|约0.3×10^9
|-
|T 细胞
|杀死病毒感染的细胞并调节其他白细胞的活动
|约2 × 10^9
|-
|自然杀伤（NK）细胞
|杀死病毒感染的细胞及某些肿瘤细胞
|1 × 10^8
|-
|血小板（源自骨髓中巨核细胞的细胞碎片）
|启动血液凝固过程
|3 × 10¹¹
|-
| colspan="3" |人体含有约5升血液，占体重的7%。红细胞约占该体积的45%，白细胞约占1%，其余为液态血浆。
|}
在这些细胞中，有些能够定植于受辐射宿主体内，并永久性地为其重新装备造血组织（图22-10）。此类实验证明，骨髓包含完整的造血干细胞系统，并使科学家得以分离出相关干细胞，发现区分它们的分子特征。

为此，从小鼠骨髓中提取的细胞会根据其细胞表面抗原进行分选（使用荧光激活细胞分选仪），并将不同组分输注到经辐射处理的小鼠体内。若某一组分能挽救这些受辐射小鼠，则其中必定含有造血干细胞。通过这种方式，研究揭示了造血干细胞具有特定的细胞表面蛋白组合，且通过适当的细胞分选，可以获得几乎纯净的干细胞制剂。这些干细胞仅占小鼠骨髓细胞群体的极小部分——大约每5万至10万个细胞中仅有1个；但这已足够。值得注意的是，将单个此类细胞注入造血功能缺陷的宿主小鼠体内，便足以重建其整个造血系统，生成全套血细胞类型及新的干细胞。这一点及谱系追踪实验证实，单个造血干细胞具有多能性，能够自我更新并产生所有类型的血细胞。

血液中含有大量多种类型的已分化细胞（见表 22-1），其中许多可在标准染色的人血涂片中观察到（图 22-11）。红细胞具有同质性，它们停留在血管内，负责运输氧气 2 O 2 与 C O 2 一氧化碳 2 与血红蛋白结合。相比之下，白细胞在形态和功能上具有异质性，必须穿过小血管壁进入组织才能发挥作用。终末分化的

X 射线照射会中止血细胞生成，若不进行进一步治疗，小鼠将会死亡

图22-10 通过骨髓细胞输注拯救受辐射小鼠。人类白血病治疗中采用基本相似的流程，即在放疗或化疗后通过骨髓移植进行治疗。小鼠得以存活；注入的干细胞定植于其造血组织，持续生成新的血细胞

由于血细胞寿命相对较短且需在动物整个生命周期中持续生成，造血干细胞必须每日产生大量分化细胞。但它们并非直接生成终末细胞，而是通过持续产生大量过渡扩增祖细胞——这些定向前体细胞在骨髓中经历多次分裂后才最终完成终末分化。

然而，干细胞并非直接从多能干细胞状态跃迁至定向分化的特定路径，而是经历多次细胞分裂，通过一系列步骤逐步限制其发育选择（图 22-12）。第一步通常是通过两种多能性过渡扩增祖细胞，决定向髓系或淋巴系命运分化。其中一种能产生大量各类髓系细胞，包括血液粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）、单核细胞（巨噬细胞和树突状细胞的前体）、红细胞以及巨核细胞（驻留骨髓并通过出芽方式产生血小板的细胞）（视频 22.1）。另一种多能祖细胞则产生大量不同类型的淋巴系细胞，包括适应性免疫系统的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞，以及先天性免疫系统中类淋巴细胞特性的自然杀伤（NK）细胞（详见第 24 章）。进一步的承诺步骤最终导致祖细胞仅专一于产生一种细胞类型，尽管这一最终承诺步骤远在细胞停止增殖并终末分化之前就已发生。骨髓内外产生的多种信号分子控制着造血细胞及其已定向后代在骨髓中的存活、增殖和路径承诺，从而调控每种分化血细胞最终产生的数量。

图 22-12 小鼠与人类造血过程的简化示意图。多能造血干细胞通常分裂频率较低，既可生成更多具有自我更新能力的多能干细胞，也可形成多能祖细胞，后者能够分化产生血液和免疫系统中的所有细胞。祖细胞分裂次数有限，需经历多个逐步过渡的中间阶段才能发育为完全分化的细胞。随着不断分裂，祖细胞能产生的细胞类型范围逐渐专一化，正如该细胞谱系图的分支结构所示。在成年哺乳动物中，图示所有细胞主要于骨髓中发育——除 T 淋巴细胞（如图所示在胸腺中发育）以及巨噬细胞和部分树突状细胞（由循环血液中的单核细胞发育而来）之外。需注意，并非所有干细胞都通过完全相同的序列产生完全一致的后代细胞模式。

在这一层级造血系统中，唯有干细胞能在个体生命周期内自我更新，单次干细胞分裂可产生成千上万至数百万的分化后代。这解释了为何干细胞数量仅占骨髓造血细胞总数的极小部分。维持干细胞低分裂频率具有重要优势——若仅靠其自身分裂来满足终末分化血细胞的高需求，将导致快速的复制性细胞衰老与干细胞库枯竭，引发严重后果。此外，干细胞分裂次数越少，细胞积累危险突变的风险越低，这些突变会持续存在于变异克隆中；如第20章所述，此类克隆在造血系统中尤为危险，因为相对较少的突变就是以诱发血细胞癌。

= 某些组织的维持无需依赖干细胞 =
某些类型的细胞即使完全分化后仍能分裂，无需借助干细胞即可实现更新与再生。分泌胰岛素的胰腺 \beta 细胞便是一例。其更新模式具有特殊重要性，因为自身免疫攻击导致这类细胞缺失正是 1 型（青少年发病型）糖尿病的成因，而随年龄增长和肥胖出现的功能衰退也是 2 型（成人发病型）糖尿病的重要诱因。这类 \beta 细胞通常聚集在称为朗格汉斯岛的细胞群中。这些胰岛似乎并不含有干细胞，但新的 \beta 细胞却在胰岛内持续生成。与此前所述的谱系追踪研究相似，实验表明该细胞群的更新通常通过已分化的胰岛素分泌性 \beta 细胞的简单分裂实现。

另一种能够通过完全分化细胞的简单分裂进行更新的组织是肝脏。肝脏中的主要细胞类型是肝细胞，这是一种执行肝脏多种代谢功能的大型细胞。肝细胞通常存活一年或更长时间，并以极慢的速度分裂。强大的稳态机制通过调节细胞增殖速率和细胞死亡速率，维持肝脏正常体积并在受损时恢复其大小。若通过手术大量移除肝细胞或通过四氯化碳中毒致其死亡，会观察到显著效应：在任一种损伤发生后的第一天左右，存活肝细胞中会出现细胞分裂浪潮，迅速替代丢失的组织。例如，若移除大鼠三分之二的肝脏，通过肝细胞增殖可在约两周内再生出接近正常体积的肝脏。

胰腺和肝脏同样含有少量干细胞群，这些细胞可作为备用机制在更极端情况下被激活以产生分化细胞类型。

= 应对损伤时，某些分化细胞可逆转为祖细胞，部分祖细胞可逆转为干细胞 =
尽管从干细胞到祖细胞再到分化细胞的路径通常是单向的，但在某些情况下，损伤可以逆转这一方向。一个显著的例子发生在哺乳动物有髓神经被切断时：切断处远端的轴突会退化，而已经分化的髓鞘形成施万细胞（参见图11-35）会去分化形成增殖中的施万祖细胞。这些祖细胞有助于引导再生的轴突回到其原始目标，并重新髓鞘化轴突以完成再生过程。

类似地，在某些组织中，当干细胞丢失时，已承诺分化的祖细胞可以重编程以恢复为干细胞。例如，在小鼠和果蝇的睾丸中，精原细胞通常遵循从干细胞到增殖祖细胞的单向发育路径，这些祖细胞经历减数分裂最终分化为精子。如果干细胞因自然或实验原因丢失，有丝分裂增殖的祖细胞

细胞能够重新编程并逆转为干细胞。更普遍地说，这一过程可能有助于干细胞群体的长期维持，使得单个干细胞的寿命可以短于生物体的寿命。不幸的是，癌细胞也常常获得类似干细胞的特性，使它们能够无限自我更新（第20章将讨论）。

= 某些组织缺乏干细胞且不可再生 =
某些缺乏干细胞的成人组织无法再生。通过比较鼻腔中的嗅觉上皮、内耳的听觉上皮以及视网膜的感光上皮，可以明显看出不同组织再生能力的显著差异，这些组织在更新能力上表现出惊人的区别。嗅觉上皮含有一群干细胞，这些干细胞分化出的细胞寿命有限且持续更新。但与之前讨论的表皮不同，这些分化的嗅觉细胞是神经元；它们的细胞体位于嗅觉上皮中，并将轴突延伸回大脑的嗅球。因此，这种上皮的更新涉及持续产生新的轴突，这些轴突必须导航回大脑中的特定位置，并在那里形成新的突触。

相比之下，至少在哺乳动物中，听觉上皮和视网膜感光上皮缺乏干细胞，其感觉受体细胞——耳朵中的感觉毛细胞和视网膜中的光感受器——是不可替代的。如果这些细胞遭到破坏——无论是由于过度暴露于巨大噪音、直视激光束，还是疾病或衰老过程中的退行性变化——这种损失将是永久性的。

我们将在本章后续部分再次讨论组织再生。

= 摘要 =
许多成体组织，特别是那些细胞更新率高的组织，如肠黏膜、皮肤表皮和血液，通过干细胞持续更新以维持生物体整个生命过程中的组织稳态。干细胞的定义特征在于其既能自我更新，又能通过快速分裂的过渡放大祖细胞产生终末分化细胞。这些特性可通过谱系追踪或移植实验得到验证。组织特异性干细胞（或称成体干细胞）的分化潜能有限，仅能产生特定组织中的一种或多种细胞类型。

在小肠的单层衬里中，多能干细胞位于每个隐窝的基部附近，它们在此自我更新并产生分裂中的定向祖细胞。这些祖细胞大多向上流动，在到达绒毛时最终分化为三种主要肠道细胞类型之一；其他祖细胞则向相反方向移动，成为潘氏细胞，这些细胞留在隐窝基部，帮助维持干细胞。其他具有自我更新能力的上皮组织，如表皮，具有多层（复层）结构，干细胞及其分化后代以不同方式排列，但遵循相似的基本原理。

造血系统是最复杂的哺乳动物干细胞系统；所有红细胞和多种白细胞均源自成体骨髓中的一种共同的多能造血干细胞，该细胞缓慢分裂并产生多能及单能祖细胞（过渡扩增细胞）。这些祖细胞快速分裂，每天分化形成大量不同类型的终末分化细胞。在其他组织如骨骼肌中，干细胞处于静息状态，仅在需要组织生长或修复时才进行分裂与分化。成体组织的更新与修复并非总是依赖干细胞；例如在胰腺和肝脏中，已分化细胞可终生分裂以替代缺失细胞，维持组织稳态。某些情况下，分化细胞可逆转为祖细胞，而祖细胞也能

逆转为干细胞。相反地，成年哺乳动物耳部和眼部的某些感觉上皮不可再生；其感觉细胞不会更新——一旦缺失，将永久丧失。

= 干细胞命运与自我更新的调控 =
成体干细胞在更新组织中维持组织稳态，这归功于它们既能自我更新，又能在生物体整个生命周期内产生分化细胞的能力。这些细胞如何长期保持其干细胞特性？它们的子细胞又是如何在自我更新和分化承诺之间做出选择的？尽管维持干细胞群体对于自我更新组织至关重要，但必须控制干细胞的增殖，因为未分化细胞的失控产生是癌症的一个标志（第20章将讨论）。在本节中，我们将探讨使干细胞在产生分化细胞的同时保持自身特性并控制其增殖的机制。

= 干细胞微环境维持干细胞的自我更新能力 =
干细胞的身份与自我更新依赖于其环境中的细胞外信号，这些信号既促进其增殖，又抑制其向分化方向发展的倾向。在许多组织中，干细胞栖息于一个被称为干细胞巢的特殊微环境，此处信号分子浓度较高（图22-13）。干细胞与支持巢的细胞保持紧密的物理接触，这些细胞不仅产生信号，还提供了一个局部的特殊环境。在此环境之外，信号分子的浓度不足以维持干细胞的自我更新，因此它们的子代细胞便会走向分化。

干细胞微环境的存在最初是通过一项实验推断出来的，该实验将骨髓细胞移植到接受过高剂量 X 射线照射的小鼠体内（见图 22-10）。未经预先辐照处理时，移植细胞无法重建造血功能，这表明必须先清除宿主体内的造血干细胞，移植的干细胞才能成功定植于宿主骨髓。这个假想的、由宿主或供体造血干细胞占据的特殊"位置"被称为干细胞微环境。由于骨髓的复杂性及干细胞在其中极为稀少，该微环境的具体位置直到多年后才得以明确——免疫荧光显微镜技术和细胞标记物的运用证实，骨髓血窦表面很可能是干细胞微环境的所在位置。

干细胞微环境中提供的自我更新信号的分子性质因物种和组织而异，但这些信号通常属于 Wingless（Wnt）、Hedgehog（Hh）或转化生长因子（TGF）家族的分泌性信号蛋白（详见第 15 章）。其他微环境信号则是依赖于干细胞与支持细胞直接接触的细胞表面蛋白。哺乳动物肠隐窝提供了一个经过充分研究的范例（参见

图22-13 干细胞微环境。干细胞仅在特定的微环境中进行自我更新，该环境为其提供必要的信号分子。这些信号分子可由微环境支持细胞提供，或通过能够富集信号分子的特殊细胞外基质传递。微环境空间可能极为微小——在某些情况下，紧邻微环境的干细胞具有自我更新能力，而仅一个细胞直径之隔的细胞则丧失此能力。

图 22-14 单个表达 Lgr5 的细胞在无细胞基质中培养形成微型肠道的发生过程。（A）示意图及（B）发育中类器官的相差显微照片。起始细胞首先分裂形成小囊或囊泡。该囊泡中随机有一个或多个细胞分化为潘氏细胞（蓝色）。潘氏细胞分泌 Wnt 蛋白，刺激邻近细胞的干细胞自我更新并维持 Lgr5 表达（黄色）；除了产生更多干细胞外，干细胞还产生能分化为全部肠道上皮细胞类型的祖细胞。（C）示意图显示潘氏细胞来源的 Wnt 信号如何帮助组织发育中的隐窝：除了使隐窝中邻近细胞保持干细胞状态的增殖外，这些信号还激活由接触细胞膜结合的 ephrin 和 Eph 蛋白介导的排斥性相互作用（第 15 章讨论）。这些相互作用导致分裂的隐窝细胞类型（表达 Wnt 诱导的 EphB）与非分裂的终末分化绒毛细胞类型（表达 ephrinB）发生分离。在许多组织中，通过 ephrin-Eph 结合相互作用的细胞在接触时会彼此排斥（见图 15-52 或图 21-47）。（改编自 T. Sato 和 H. Clevers，《科学》340:1190-1194, 2013。经 AAAS 许可。）

图 22-4 展示了小肠隐窝中干细胞微环境的构成。我们之前了解到，产生肠道上皮所有终末分化细胞的干细胞表达细胞表面受体蛋白 Lgr5，并位于隐窝基部上方，与潘氏细胞交错分布。潘氏细胞通过两种方式协助形成干细胞微环境：它们分泌 Wnt 蛋白，在短距离内作用于干细胞以促进其自我更新；同时在其表面表达 Delta（一种信号受体 Notch 的配体），直接激活接触的干细胞上的 Notch，从而抑制细胞分化——这是侧向抑制的一个实例（见图 15-59）。

值得注意的是，单个表达 Lgr5 的干细胞嵌入无细胞的细胞外基质中，能够在培养皿中增殖并形成微小的肠道样结构——类器官，其中包含肠道组织中通常存在的所有细胞类型，包括干细胞。图 22-14 展示了这一过程，并概述了建立隐窝干细胞微环境的关键信号事件，在此微环境中产生的不同细胞类型会自组织成微型绒毛，从而形成三维类器官结构。

= 微环境大小可决定干细胞数量 =
每个肠道隐窝中，干细胞微环境由15个潘氏细胞构成，仅能容纳有限数量的干细胞。当干细胞分裂时，哪个子细胞被挤出巢穴是随机事件；这些细胞因无法获得维持干细胞特性所需的信号，注定会走向分化。在大多数研究过自我更新与分化承诺平衡问题的其他干细胞系统中，似乎也存在类似的运作机制。

秀丽隐杆线虫的生殖细胞谱系提供了一个视觉上引人注目的例子（图22-15）。在该系统中，干细胞被维持在一个

图 22-15 秀丽隐杆线虫性腺的干细胞微环境。（A）荧光显微图像显示秀丽隐杆线虫性腺部分细胞核（蓝色）。远端尖端细胞的细胞核呈红色。（B）同一组织染色显示远端尖端细胞的细胞质和突起为红色，分化后的生殖细胞为绿色。远端尖端细胞的突起跨越多个干细胞直径，通过 Notch 信号传导维持干细胞特性。那些脱离远端尖端细胞突起范围的细胞启动减数分裂，并开始分化程序，最终形成卵子或精子。（由 Judith Kimble 和 Sarah Crittenden 提供。）

由一种称为远端尖端细胞的大型体细胞形成的微环境，该细胞形成细长的细胞突起。位于远端尖端细胞表面的 Notch 配体向干细胞上的 Notch 发出信号，以维持其干细胞特性。如同在肠道隐窝中，干细胞在微环境中进行自我更新增殖，直到部分后代被推离远端尖端细胞突起的范围，结果它们开始分化。这样，处于不同分化阶段的细胞源源不断地从远端尖端细胞和干细胞处移开，仿佛在传送带上，逐步成为终末分化的生殖细胞——卵子或精子。

然而，生态位大小并非控制干细胞数量的唯一方式——不对称干细胞分裂是另一种方式，正如我们现在要讨论的。

= 不对称干细胞分裂可维持干细胞数量 =
正如先前所述，当干细胞分裂时，两个子细胞必须在保持干细胞状态与走向分化之间做出选择。这两种命运之间的平衡对组织稳态至关重要，因为过度的自我更新会导致干细胞过多，而过度分化则会耗尽干细胞库。我们刚刚讨论了干细胞生态位的大小如何帮助控制干细胞数量。不对称干细胞分裂是此类调控的另一种机制。

在不对称干细胞分裂中，分裂干细胞内部的过程导致一种或多种重要分子的偏向性遗传，从而影响两个子细胞的命运。例如，两个子细胞中可能只有一个继承了维持干细胞特性所需的细胞命运决定因子，致使另一个子细胞走向分化（图 22-16A）。每次这样的不对称干细胞分裂都会产生一个干细胞和一个定向分化的细胞；因此，无论干细胞经历多少次分裂，其数量都保持不变。而在对称干细胞分裂中，两个子细胞都继承了这类细胞命运决定因子并保持干细胞状态，从而扩大了干细胞库（图 22-16B）。

如图22-16所示，在不对称干细胞分裂前，细胞发生极化，细胞命运决定因子集中于细胞一侧。随后细胞通过调整有丝分裂纺锤体的位置来定向分裂平面，确保仅有一个子细胞继承该命运决定因子。

干细胞分裂面方向的另一种影响子代细胞命运的方式是决定它们相对于干细胞的位置。

图 22-16 不对称与对称的干细胞分裂。（A）在此示意图的不对称干细胞分裂中，维持干细胞特性的细胞命运决定因子（红色）定位于细胞一侧的皮层。细胞分裂时，仅一个子细胞继承该决定因子并保持干细胞特性，而另一个子细胞则走向分化，经过若干祖细胞分裂后（未显示）完成分化。（B）在所示的对称干细胞分裂中，两个子细胞均继承此类决定因子并保持干细胞特性。

图 22-17 果蝇睾丸中分裂的生殖系干细胞的分裂平面如何决定哪个子细胞保持与微环境的接触。（A）微环境由一群体细胞组成，生殖系干细胞围绕该微环境呈环状排列。当干细胞分裂时，其有丝分裂纺锤体垂直于微环境定向，因此只有一个子细胞保持与微环境的接触并维持干细胞特性；另一个子细胞失去与微环境细胞的接触，从而无法获得自我更新信号，进而走向分化。（B）光学显微照片显示围绕微环境的生殖系干细胞及一个正在分裂的干细胞，其有丝分裂纺锤体垂直于微环境定向。这些干细胞经过基因工程改造，可表达荧光标记的微管蛋白。（B，引自 Y.M. Yamashita 等人，《科学》301 卷，1547-1550 页，2003 年；经美国科学促进会许可使用。）

生态位，使得生态位被不对称地继承。例如，在果蝇睾丸中，生殖系干细胞将其纺锤体定向垂直于支持生态位的细胞：结果，当干细胞分裂时，一个子细胞保持附着在生态位上并采取干细胞命运，而另一个子细胞则被移离生态位，在那里它被剥夺了自我更新信号，因此承诺分化（图22-17）。

= 在许多对称的干细胞分裂中，子细胞独立且随机地选择它们的命运 =
正如我们所知，不对称干细胞分裂提供了一种直接的方式，在自我更新的成体组织中维持干细胞数量同时生成分化细胞。然而，这种方式使组织适应变化条件（如营养供应的波动或应对组织损伤）的空间极为有限。在许多自我更新的成体组织中，干细胞分裂模式会发生变化以适应这些改变的条件。类似的适应性变化也发生在组织发育过程中：例如，发育早期小鼠的神经和表皮干细胞主要通过对称分裂来扩大干细胞池，以支持快速生长的器官；然而在发育后期，这些干细胞会转向更多的不对称细胞分裂，以产生更多分化细胞（参见图22-16）。

在许多更新组织中，包括肠道上皮，干细胞采取了一种更为灵活的策略。在这些情况下，干细胞进行分裂时采取对称方式，每个子细胞独立于其姐妹细胞，自主选择是保持干细胞状态（自我更新）还是走向分化。在这种独立选择机制中，有时两个子细胞会做出相同选择，有时则做出相反选择。每个细胞的选择可能是随机的（概率性的），如同抛硬币一般，或者受到子细胞所处环境的影响（图22-18）。与不对称分裂策略相比，独立选择机制具有灵活性，允许局部和更广泛的环境因素根据需要调节概率平衡——在需要更多干细胞时（如生长或损伤修复过程中常见的情况）倾向于干细胞选项，或在分化细胞缺失时倾向于分化方向。

小鼠小肠中的谱系追踪实验显示，一些干细胞谱系会消失，而另一些则会扩张并持续存在，这与干细胞分裂产生的子细胞随机做出选择的情况相符（见图22-18）。

= 干细胞功能衰退导致组织老化 =
尽管成体干细胞具有维持组织稳态的卓越能力，但这种能力往往会随时间减弱，从而导致组织老化。以造血干细胞为例，通过连续移植实验可以证明这种衰退现象。在这些实验中，干细胞从供体小鼠移植到同一近交系经辐照处理的宿主小鼠体内。

图 22-18 干细胞分裂的两个子代如何选择命运的独立选择机制。该机制的结果比对称性干细胞分裂更具变异性。选择可能由子代所处的局部环境决定（图示左侧），也可能完全随机（图示右侧）。当每个子代随机做出选择，且各自保持干细胞状态或定向分化的概率为 50% 时，例如在第一次分裂时存在 25% 的概率两个子代都将定向分化，导致克隆最终消失。或者，在此次或后续分裂中，多数子代可能选择保持干细胞状态，形成持续存在并扩增的克隆。借助数学工具，可以基于这种随机性假设预测单个干细胞在任何给定时间产生的克隆大小概率分布。肠道及其他组织的观察结果符合这种随机独立选择策略。

供体细胞在宿主小鼠的造血系统中重新定植后（见图22-10），将宿主的造血干细胞移植到新的受辐照宿主中，这一过程反复进行。经过多轮移植后，干细胞逐渐失去在新宿主体内重建造血系统的能力，这表明干细胞随年龄发生变化，显然在多次分裂后经历了复制性细胞衰老。

为了研究造血干细胞微环境的支持功能是否也随年龄下降，将来自年轻或年老供体小鼠的造血干细胞移植到受辐照的年轻或年老宿主小鼠体内。通过比较这四类实验（年轻至年轻、年轻至年老、年老至年轻、年老至年老——图 22-19A）的结果表明，年轻干细胞

图 22-19 区分细胞自主因素与环境因素对造血干细胞功能随衰老衰退的影响的方法。（A）将年轻或年老的供体造血干细胞移植至年轻或年老的宿主体内，从而评估干细胞功能。通过四组对比可揭示干细胞自身衰老与环境或微环境衰老对干细胞功能衰退的贡献。（B）在联体共生实验中，动物通过共享循环系统相连。其中一个动物的细胞将暴露于另一个动物的全身环境中。通过比较异龄配对（年轻与年老）与同龄配对（年轻与年轻、年老与年老）中年轻或年老伴侣的细胞功能，可揭示自主干细胞衰老与循环因子或干细胞微环境在干细胞功能衰退中的作用。[基于 M.A. Goodell 与 T.A. Rando 的研究，《科学》350(6265):1199-1204, 2015, doi 10.1126/science.aab3388.]

特定微环境无法挽救老化的造血干细胞，而老化的干细胞微环境却能够支持年轻的造血干细胞，这表明微环境的变化并非导致造血功能随年龄衰退的原因，至少在老鼠中如此。

研究干细胞在衰老中功能的一种更普遍方法是异种共生，即连接两只不同年龄小鼠的循环系统——年轻与年轻、年轻与年老或年老与年老（图 22-19B）。这种三向比较提供了一种确定不同因素对干细胞功能随衰老衰退的贡献方式：干细胞本身、干细胞微环境以及血液中的循环因子。例如，有来自此类研究的证据表明，老年小鼠的循环因子可减少年轻小鼠大脑海马区的神经发生，损害其学习和记忆能力，模拟了正常小鼠大脑在衰老过程中发生的衰退。相反，其他研究发现，年轻小鼠的循环因子可以恢复老年小鼠的骨骼肌干细胞功能，并能对抗包括肝脏、胰腺、骨骼和心脏在内的组织中的年龄相关功能障碍。导致组织衰老或再生的血液成分可能包括对干细胞有直接作用的分子，而这些循环因子的鉴定是一个活跃的研究领域。

= 摘要 =
每个干细胞微环境中都存在多种细胞外信号，使得组织特异性干细胞能够在生物体整个生命周期中维持成体组织稳态。这些信号调控着干细胞自我更新的时机与位置，以及其子细胞向分化方向发展的进程。单个干细胞选择自我更新或定向分化的决策受到精密调控，以确保组织维持足够数量的干细胞并产生适量终末分化细胞。在某些情况下，通过不对称干细胞分裂——每次分裂产生一个干细胞和一个分化细胞——来实现这种平衡。而在另一些情况下，干细胞进行对称分裂，两个子细胞独立选择自我更新或定向分化，这种选择既可能是随机的，也可能是响应局部环境信号的结果。成体干细胞自我更新及产生终末分化细胞的能力随时间推移逐渐衰退，这正是导致组织衰老的重要因素。

= 再生与修复 =
正如我们所知，人体许多组织不仅能够自我更新，还具备自我修复能力，这主要归功于干细胞及其行为调控的反馈机制，以维持组织稳态。然而，这些天然修复机制存在局限性。例如，在阿尔茨海默病中，人类大脑多数区域的神经细胞死亡后无法再生。同样，心脏病发作时因缺氧死亡的心肌细胞，会被瘢痕组织替代而非新的心肌细胞。

某些动物的再生能力远超人类，能够再生整个器官，比如截肢后完整复原的肢体。在无脊椎动物中，有些物种甚至能从单个体细胞再生出身体的所有组织。这些现象燃起了希望：或许能通过人工手段诱导人类细胞实现类似的修复与再生奇迹，以替代阿尔茨海默病或帕金森病患者体内死亡的神经细胞、1 型糖尿病中缺失的分泌胰岛素的 \beta β细胞、心脏病发作时死亡的心肌细胞等等。随着我们对再生基础细胞生物学的深入了解，这些曾经只是梦想的目标正逐渐变得触手可及。

本节首先列举某些动物物种非凡的再生能力实例，以此说明理论上的可能性。接着我们将探讨如何通过利用成人组织中各类干细胞的特性，来优化人体的自然修复机制并治疗疾病。

图 22-20 地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）。(A) 外部视图。(B) 使用三种不同抗体进行的免疫染色，揭示了内部解剖结构。(A，由 A. Sánchez Alvarado 提供；B，引自 A. Sánchez Alvarado，BMC 生物学杂志 10:88，2012 年。经作者许可。)

= 涡虫体内含有能够再生完整新躯体的干细胞 =
施密特地中海涡虫是一种小型淡水扁虫，或称真涡虫，完全成长时体长约一厘米（图22-20）。它具有表皮、肠道、大脑、一对原始眼、外周神经系统、肌肉组织以及排泄和生殖器官——这些是其他动物常见的大多数基本身体部位，尽管按照脊椎动物的标准都相对简单，并由大约20至25种不同的分化细胞类型构成。一个多世纪以来，像施密特地中海涡虫这样的真涡虫因其非凡的再生能力而令生物学家着迷：从身体几乎任何部位取下的微小组织碎片都能生长并再生出一个完整的新个体。这一特性伴随着另一种特性：当动物饥饿时，它会通过减少细胞数量而变得越来越小，同时保持基本正常的身体比例。这种行为被称为逆生长，可持续至动物体积缩小至完全体型的二十分之一。一旦获得食物，它又能重新长回完整大小。逆生长与生长的循环可以无限重复，而不会影响生存或繁殖能力。

这种行为的基础是细胞持续更新的过程。除了不分裂的分化细胞外，还存在一群被称为新生细胞的小型未分化分裂细胞。新生细胞约占体内细胞的 20% ，并广泛分布其中；通过细胞分裂，它们作为干细胞产生新的分化细胞。与此同时，分化细胞通过凋亡不断死亡，使其残骸被邻近细胞吞噬和消化（详见第 18 章）。通过这种细胞自噬，死亡细胞的成分可以被高效回收利用。无论动物处于饱食还是饥饿状态，细胞分裂与细胞死亡及自噬始终保持着动态平衡。在饥饿条件下，平衡倾向于细胞死亡和自噬；而在营养充足时，则倾向于细胞生长和分裂。

高剂量的 X 射线会中止所有细胞分裂，阻止细胞更新并破坏再生能力，导致几周后死亡。然而，通过注射一个从未受辐射供体分离出的单一新胚细胞（图 22-21），可以挽救该动物。在部分案例中，注入的细胞分裂形成克隆后代，最终重新填充整个身体，产生一个健康的再生个体，其拥有看似完整的终末分化细胞类型以及分裂中的新胚细胞。关于头尾身份的位置信息梯度由沿虫体肌肉细胞持续表达，并指导神经母细胞的适当发育。遗传标记证明，分化细胞均源自注入的单一新胚细胞，这表明至少部分新胚细胞是具有全能性的干细胞，因为它们能够分化成各种细胞类型。

图 22-21 单个体细胞再生为涡虫的过程。（A）成体中分裂细胞（新生细胞；蓝色）的分布情况。辐射会阻断所有细胞分裂并阻止再生。（B）将单个未受辐射的新生细胞注入受辐射动物体内后，该细胞能够增殖并重建所有组织。最终形成完全由该单细胞后代构成的完整个体，且具备正常再生能力。沿虫体分布的肌肉细胞持续表达关于头尾身份识别的梯度信息，并指导神经母细胞分化。（改编自 E.M. Tanaka 与 P.W. Reddien，《发育细胞》21 卷 172-185 页，2011 年。）

这些细胞能够分化形成构成扁形虫身体的所有细胞类型，包括像它们自身一样的新生细胞。

= 某些脊椎动物能再生完整的肢体与器官 =
人们或许认为，这种再生能力仅为小型、简单、原始动物所独有。然而，某些脊椎动物，尤其是鱼类和两栖类，也展现出非凡的再生能力。例如蝾螈（包括水螈和墨西哥钝口螈），不仅能再生被截肢体的全部或部分，还能再生许多其他身体部位，包括脑组织和脊髓（图22-22）。在肢体再生过程中，截肢处会形成芽基——一种类似于胚胎肢芽的小芽状结构。相邻表皮细胞的快速侧向迁移有助于封闭伤口部位。深层芽基细胞主要来源于残肢中高度增殖的活化干细胞和祖细胞。尽管这些细胞看起来相似，但它们保留着源组织的记忆及足够的位置信息，使其能够分化成适当的细胞类型，并形成具有正确图案的肢体或肢体被截部分的替代结构。这一再生过程宛如胚胎肢体发育的重演。如同在发育的肢体中，所有必需的细胞行为都由上层表皮、向内生长的神经、增殖的谱系限制性干细胞、以及过渡扩增祖细胞及其分化细胞所产生的细胞间信号精心协调

图 22-22 蝾螈肢体再生过程。(A) 延时序列显示了肱骨中段截肢后的再生阶段。该序列涵盖了伤口愈合、残端干细胞与祖细胞在芽基形成过程中的激活增殖，以及各类肢体细胞分化的全过程。(B) 早期芽基示意图。(A 图由 Susan Bryant 和 David Gardiner 提供。)

后代细胞。其中涉及的大多数信号通路与肢体发育过程中使用的通路相同，包括由 Hedgehog、Wnt 和 FGF 家族成员激活的通路。

为何蝾螈能再生如此多的身体部位而哺乳动物却不能，这仍是一个深奥的未解之谜。

= 干细胞可临床用于替代缺失的造血细胞或皮肤细胞 =
在本章前面部分，我们了解到可以通过对小鼠进行辐射以清除其造血干细胞和祖细胞，随后通过输注新的干细胞来挽救其生命，这些干细胞会重新填充骨髓并恢复血细胞生成（见图22-10）。同样地，患有某些类型白血病或淋巴瘤的人类个体，在接受辐射或化学治疗以摧毁癌细胞及剩余造血组织后，可通过输注健康的非癌变造血干细胞获得救治。在理想情况下，可以在清除患者自身造血组织前，从其样本中分选出干细胞；治疗后再将这些干细胞回输，从而避免免疫排斥问题。

干细胞应用的另一个例子是修复大面积烧伤后的皮肤。通过培养烧伤患者未受损区域的细胞，经过漫长而复杂的程序，可以生成足够数量的表皮干细胞，以重新覆盖受损的体表。

= 神经干细胞可在培养环境中进行操作，并用于重建病变的中枢神经系统 =
脊椎动物的中枢神经系统（CNS）是体内最复杂的组织，与表皮组织截然相反。然而，鱼类和两栖动物在被切除部分大脑、脊髓和眼睛后能够再生这些器官的大部分。但在成年哺乳动物中，这些组织的自我修复能力极为有限，能够生成新神经元的干细胞难以寻觅——如此难以发现，以至于多年来人们认为它们根本不存在。

不过我们现在知道，能够生成神经元、胶质细胞或两者兼有的神经干细胞确实存在于成年哺乳动物大脑的某些区域，如图 22-23 所示，这些干细胞可生成小鼠嗅球中的神经元。在成年小鼠和人类大脑中，海马体（一个专门负责学习和记忆的区域）的神经元也在持续更新。在这里，成年大脑功能的可塑性与特定神经元亚群的更替相关：这类神经元每天约产生 1400 个新细胞，相当于每年约 0#的细胞更新率。

在某些鸣禽的大脑中观察到更为显著的神经元更替现象。这些鸟类每年会有大量神经元死亡，并被新生神经元替代，这一过程是鸟类为每个新繁殖季节完善其鸣唱技巧的重要组成部分。

脑神经干细胞可在培养环境中进行研究。例如，从成年或胎儿哺乳动物大脑的自我更新区域提取组织碎片，经解离后在特定条件下培养，会形成悬浮的"神经球"——由神经干细胞及其神经元与胶质细胞后代混合组成的细胞团。这些神经球可传代培养多代，其细胞可随时提取并植入完整动物的大脑，在那里它们将分化为成熟的神经元和胶质细胞。

通过略微调整培养条件，在培养基中添加恰当的生长因子组合，神经干细胞可在培养皿中以分散细胞形式生长，并被诱导增殖为几乎纯净的干细胞群体，而不伴随分化子代细胞。进一步改变培养条件后，这些细胞可随时被诱导分化形成

图 22-23 成年小鼠大脑中神经元的持续生成。从上方观察大脑剖面图，显示前脑室管膜区域——神经干细胞的聚集地。这些细胞持续产生迁移至嗅球的子代细胞，并在该处最终分化为神经元。嗅球内神经元的持续更新机制，可能与鼻腔嗅上皮向嗅球投射的嗅觉受体神经元的更新存在某种关联。在成年小鼠和人类中，海马体（未显示）同样存在持续的神经元更替现象，该区域专门负责学习与记忆功能。（改编自 B. Barres, Cell 97:667-670, 1999。）

根据培养基的成分，可能是神经元和胶质细胞的混合物（图22-24），或者仅仅是这两类细胞中的一种。

根据培养基的成分，可能是神经元和胶质细胞的混合物（图22-24），或者仅仅是这两类细胞中的一种。神经干细胞，无论是通过上述方法获得还是来自本章最后一节描述的多能干细胞，都可以移植到成年大脑中。一旦移植，它们展现出非凡的能力，能够调整自身行为以适应新的位置。例如，来自小鼠海马体的干细胞，当植入小鼠嗅球前体细胞的迁移路径时（见图22-23），会产生神经元，这些神经元能够正确融入嗅球。神经干细胞及其后代在动物体内适应新环境的能力，为中枢神经系统疾病或损伤的治疗提供了应用前景。

= 摘要 =
动物的再生能力各不相同。极端情况下，涡虫扁形动物拥有支持所有细胞类型持续更新的干细胞（成体干细胞），几乎任何微小身体碎片甚至单个成体干细胞都能再生出完整的虫体。蝾螈能在截肢后再生四肢及其他大型身体部位，但再生细胞仍受来源限制：再生组织中的肌肉细胞源自肌肉组织，表皮细胞源自表皮组织，以此类推。哺乳动物的再生能力较为有限。然而，通过利用干细胞生物学，我们正逐渐突破伤口愈合的自然限制。神经系统特定区域含有终身维持神经元生成的干细胞。这些神经干细胞可从原位或胎儿大脑中获取，经体外培养后移植至大脑其他区域，能够生成适应新位置的神经元。

= 细胞重编程与多能干细胞 =
当细胞从哺乳动物体内的一个位置移植到另一个位置，或是从体内取出并在培养中维持时，它们大体上仍忠于其起源。每种特化细胞都对其发育历程有所记忆，似乎命运已定。虽然确实会发生一些有限的转变，并且正如我们所知，某些干细胞能够生成多种分化的细胞类型，但可能性是受限的。每种成体干细胞都服务于特定类型组织的更新，而成体中自我更新的干细胞到分化细胞的整个模式惊人地稳定。在基础分子层面上，这些细胞类型和细胞状态之间的稳定差异的本质是什么？是否存在方法可以超越这些限制？

图 22-24 神经干细胞。图示从胎儿脑组织或胚胎干细胞出发，经由神经球（A）阶段，最终获得纯化的神经干细胞培养物（B）的步骤。这些干细胞既可无限增殖维持原态，也可通过培养基调整诱导其分化（C）为神经元（红色）和胶质细胞（绿色）。具有相同特性的神经干细胞亦可通过类似步骤从胚胎干细胞（ES）或诱导多能干细胞（iPS）中获取（本章后续将展开讨论）。（显微照片源自 L. Conti 等人，《PLoS 生物学》3:e283, 2008。经作者授权使用。）

细胞记忆机制如何运作？又是什么力量促使细胞从一种状态彻底转变为另一种截然不同的状态？

我们已在第七章从宏观角度探讨过这些根本性问题。此处我们将结合干细胞生物学领域进行更深入的分析——该领域近年来在细胞分化状态认知与操控方面取得了革命性突破。随着研究的深入，这些进展必将为医学应用开辟重要途径。

= 细胞核通过移植至异源细胞质可实现重编程 =
若无法通过改变环境来转换特化细胞的基本特性，我们能否以更直接且彻底的方式干预其内部机制来实现这一目标？一种极端的方法是将细胞核移植至另一种大型细胞的细胞质中。倘若决定并维持特定细胞类型的因子存在于细胞质内，那么被移植的细胞核应当会转变其基因表达模式，以与宿主细胞保持一致。在第七章中，我们描述了一项利用非洲爪蟾进行的著名实验。该实验中，分化细胞的细胞核（取自蝌蚪肠壁细胞）被用于替换卵母细胞的细胞核（一种停滞在第一次减数分裂前期的卵细胞前体，处于受精准备状态）。在部分案例中，由此形成的杂交细胞最终发育成了完全正常的青蛙（参见图 7-2A）。这成为了发育生物学核心原理的关键证据：细胞核，即便是已分化细胞的核，也包含完整的基因组，能够支持生物体所有正常细胞类型的发育。同时，该实验表明细胞质因子确实能重编程细胞核：卵母细胞质能将肠道细胞核逆转为早期胚胎状态，使其随后逐步经历基因表达的变化模式，最终发育成完整的成年生物体。

然而，整个故事并非如此简单。首先，这类实验中的重编程并不完美。例如，当移植的细胞核取自肠道细胞时，即使在最终动物的肌肉细胞中，也发现通常仅肠道特有的基因持续表达。其次，实验仅在有限比例的情况下成功，且成功率随着供体动物成熟度的增加而越来越低：若细胞核来自成年青蛙的分化细胞，则需进行大量移植才能获得一次成功。

核移植同样可在哺乳动物中进行，并产生基本相似的结果。例如，从成年绵羊乳腺中取出的分化细胞核移植到去核的绵羊卵细胞中，能够支持发育出一只外观正常的绵羊——即著名的多利。同样，成功率很低：需要进行多次移植才能获得这样一个个体。

= 移植核的重编程涉及染色质的剧烈变化 =
在一个典型的完全分化细胞中，似乎存在维持基因表达模式的机制，这些机制不易被细胞质因子所覆盖。一个明显的可能性是，成年细胞中基因表达模式的稳定性可能至少部分依赖于染色质的自我延续性修饰，正如第四章所讨论的（见图 4-44）。如第七章所述，哺乳动物中的 X 染色体失活现象为此类表观遗传控制提供了一个清晰的例证。每个雌性细胞中存在两条 X 染色体，暴露于相同的化学环境，但一条保持活跃，另一条则以凝聚的失活状态代代相传；细胞质因子无法解释这种差异，这必然反映了

个体染色体固有的机制。在基因组的其他区域，染色质层面的调控也与其他形式的调节相结合，共同控制每个基因的表达。基因可以被完全关闭，或持续开启，或保持在一种不稳定状态，以便根据环境变化迅速开启或关闭。

移植到卵母细胞中的细胞核重编程过程涉及染色质的显著变化。细胞核膨胀，体积增大 50 倍，染色体随之解凝；DNA 和组蛋白的甲基化模式发生全面改变；连接组蛋白 H1（连接相邻核小体的组蛋白）被卵母细胞和早期胚胎特有的变异形式所取代，而原有的组蛋白 H3 类型在许多位点也被独特的异构体替换。显然，卵细胞含有能够重置细胞核染色质状态的因子，清除染色质上旧的组蛋白修饰并施加新的修饰。通过这种方式重编程后，基因组再次具备启动胚胎发育并产生全系列分化细胞类型的能力。

= 胚胎干细胞（ES 细胞）能生成身体的任何部分 =
受精卵，或通过核移植产生的等效细胞，是一种非凡的存在：它能孕育出一个全新的多细胞个体，这意味着它能分化出每一种正常的特化细胞类型，甚至包括用于繁衍下一代的卵子或精子细胞。处于这种状态的细胞被称为全能细胞；而能产生大多数细胞类型但非全部者，则称为多能细胞。然而，这样的全能或多能细胞并非干细胞，因为它们不具备自我更新能力，而是致力于逐步分化的程序。若将其作为研究和利用多能细胞的唯一起点，这项工作将需要持续供应新鲜的受精卵或进行新的核移植操作——这对实验动物的研究而言颇为不便，对人类实际应用更是不可接受。

然而，大自然在此处对科学家们展现出了意想不到的慷慨。我们能够提取处于囊胚阶段的小鼠早期胚胎，通过细胞培养技术从中获得一类名为胚胎干细胞（ES 细胞）的干细胞。这些 ES 细胞源自早期胚胎的内细胞团（即形成胚胎主体而非胚外结构的细胞群），它们具有非凡特性：在适宜的培养条件下，这些细胞不仅能无限增殖，还能保持不受限制的发育潜能。其唯一局限在于无法形成胎盘等胚外组织。因此，它们被归类为多能性干细胞而非全能性干细胞。但这只是微小限制——若将 ES 细胞重新植入囊胚，它们会融入胚胎并分化成体内所有组织和细胞类型，完美整合到所处位置，呈现出正常细胞在该部位应有的特性与行为（图 22-25）。它们甚至能产生生殖细胞，从而繁衍出新一代动物。

图 22-25 ES 细胞的生产与多能性。ES 细胞源自早期胚胎的内细胞团（ICM）。将 ICM 细胞转移至含有适宜培养基的培养皿中，在此它们转化为 ES 细胞，并能在未分化状态下无限增殖。这些 ES 细胞可在任何时间点——如经基因操作后——被注射回发育中的囊胚。在囊胚内，它们融入内细胞团，参与形成结构良好的嵌合体动物，该动物由普通细胞与 ES 源细胞混合构成。ES 源细胞能分化为体内任何细胞类型，包括生殖细胞，由此可培育出不再呈嵌合特征的新一代小鼠，其所有细胞均继承了一半来自培养 ES 细胞系的基因。

胚胎干细胞使我们能够在细胞培养与完整有机体之间架起桥梁：在细胞培养中，我们可以运用强大的基因转化与筛选技术；而在完整有机体中，我们能探索这些基因操作如何影响发育与生理过程。因此，胚胎干细胞为哺乳动物高效基因工程开辟了道路，引发了对哺乳动物分子与发育生物学认知的革命。

具有类似小鼠胚胎干细胞特性的细胞，不仅可从早期人类胚胎和人类胎儿生殖细胞中获取，甚至——正如我们稍后将阐述的——还能从成年哺乳动物组织中的已分化细胞中衍生出来。通过这种方式，人们可以获得潜在取之不竭的多能细胞供应。通过在培养过程中精心选择培养条件，这些细胞能够被操控产生大量几乎任何类型的分化细胞，从而为众多实际应用铺平道路。但在探讨这些应用之前，我们需先理解其背后的生物学基础。

= 一组核心转录调控因子界定并维持着胚胎干细胞状态 =
是什么赋予了胚胎干细胞及相关类型的多能干细胞其非凡的发育潜能？它们又能告诉我们哪些关于干细胞特性、分化承诺以及分化状态稳定性的基本机制？

对于某些胚胎干细胞（ES 细胞）特性而言，答案十分明确。例如，ES 细胞的一个核心特征在于必须规避复制性细胞衰老。如第 17 章所述，这恰恰是成纤维细胞及多种增殖性体细胞的宿命：这类细胞的分裂次数存在上限，至少部分归因于其缺乏端粒酶活性，导致端粒随着每次分裂周期逐渐缩短，最终引发永久性细胞周期停滞。相比之下，ES 细胞表达高水平活性端粒酶，使其能够逃避复制性细胞衰老，实现无限增殖。这一特性与其他发育受限型干细胞（如成年肠道干细胞）共有，后者同样能持续进行数百至数千次细胞周期分裂。

更深层次的问题在于解释胚胎干细胞（ES 细胞）中整个复杂的基因表达模式是如何被组织和维持的。作为第一步，可以寻找在 ES 细胞或早期胚胎中相应多能细胞中特异性表达的基因。这种方法识别出相对较少的候选 ES 关键基因；也就是说，这些基因似乎以某种方式对 ES 细胞的独特特性至关重要。例如，一个名为 Oct4 的基因仅在 ES 细胞及完整生物体中相关类别的细胞中特异性表达——具体而言，在生殖细胞谱系以及内细胞团及其前体细胞中。Oct4 编码一种转录调节因子。当它从 ES 细胞中缺失时，这些细胞会失去其 ES 细胞特性；而当它在胚胎中缺失时，本应分化为内细胞团的细胞会转向胚外分化途径，导致胚胎发育中止。

= 成纤维细胞可通过重编程产生诱导多能干细胞（iPS 细胞） =
在第七章中，我们了解到，如果人工表达主肌肉特异性转录调节因子 MyoD，成纤维细胞及其他某些细胞类型可被诱导改变特性并分化为肌肉细胞。那么，是否可以通过强制表达如 Oct4 等对胚胎干细胞（ES 细胞）至关重要的基因，采用相同技术将成纤维细胞及其他细胞类型转化为 ES 细胞呢？为解决这一问题，研究人员用携带预期能产生此类效果的基因的逆转录病毒载体转染小鼠成纤维细胞。通过这种方式共测试了 24 个候选的 ES 细胞关键基因。单独使用任一基因均无法实现转化，但特定组合下它们能够做到。2006 年，首批突破性实验将所需基因精简至核心的四个。

基因，它们全部编码转录调节因子——Oct4、Sox2、Klf4 和 Myc，简称 OSKM 因子。当这些因子共同表达时，能够重编程小鼠成纤维细胞，永久性地将其转变为与胚胎干细胞（ES 细胞）极为相似的细胞（图 22-26）。通过这种方式产生的类 ES 细胞被称为诱导多能干细胞，或 iPS 细胞。与 ES 细胞一样，iPS 细胞能在培养中无限分裂，并且当被植入小鼠囊胚时，它们能参与形成一个结构完整的嵌合体动物。在此动物体内，它们能促进任何组织的发育，并能转化为任何分化的细胞类型，包括功能性生殖细胞，从而培育出新一代小鼠（参见图 22-25）。

iPS 细胞现已可从成人体细胞中获取，包括除成纤维细胞外的多种分化细胞类型。多种方法可用于驱动转化因子 OSKM 的表达，其中包括在重编程细胞中不留外源 DNA 痕迹的技术。原始转录调控因子组合的变体可推动转化过程，不同特化细胞类型对此有略微不同的需求。例如，虽然 Myc 的过表达能提高过程效率，但事实证明并非绝对必要。且分化细胞类型可能在其正常表型中已表达部分所需因子。例如，毛囊中的某些细胞已表达 Sox2、Klf4 和 Myc；要将它们转化为 iPS 细胞，只需人工强制其表达 Oct4 即可。

= 重编程涉及基因控制系统的重大变革 =
将分化细胞转化为 iPS 细胞，并非如同启动某个可预测、精密设计的机械开关那般简单。在接受 OSKM 因子的细胞中，仅有极少数能真正转变为 iPS 细胞——在最初实验中成功率仅为数千分之一，即便采用更先进的技术改进后，成功者仍属凤毛麟角。实际上，原始实验的成功依赖于巧妙的筛选策略，以精准识别那些发生转化的稀有细胞（图 22-27）。

通过 OSKM 因子转化为 iPS 状态不仅效率低下且过程缓慢：成纤维细胞从引入转化因子到开始表达 iPS 细胞特征性标志物需要 10 天或更长时间。这表明该转化过程涉及一系列漫长的级联变化。这些变化已被广泛研究，它们既影响单个基因的表达，也影响染色质的状态。时间进程如图 22-28 所示。该过程始于 Myc 诱导的细胞增殖和染色质结构松弛，这促进了其他三种转录调节因子与基因组中数百个不同位点的结合。在这些位点中的大部分，Oct4、Sox2 和 Klf4 会协同结合。结合位点包括内源性 Oct4、Sox2 和 Klf4 基因本身，最终形成如前所述的正反馈循环，使这些基因的表达自我维持（见图 22-26）。但自我诱导

图 22-26 使用 OSKM 因子将成纤维细胞重编程为 iPS 细胞

如图所示，转录调控蛋白 Oct4、Sox2 和 Klf4（OSK 因子）会诱导自身及彼此间的合成（灰色阴影标注）。这形成了一个自我维持的反馈回路，有助于将细胞维持在类胚胎干细胞状态，即使在所有实验添加的 OSKM 起始因子被移除后仍能持续。Myc 过表达通过所示机制加速重编程过程的早期阶段（参见图 17-59）。稳定的重编程还涉及 Nanog 基因的永久性诱导表达，该基因编码另一种转录调控因子（参见图 7-10）。（改编自 J. Kim 等人，《细胞》132 卷：1049-1061 页，2008 年）

该实验利用了一个在所有细胞中都存在但通常仅在胚胎干细胞（ES）和早期胚胎细胞中表达的基因（Fbx15），尽管这些细胞并不依赖该基因存活。G418 是一种氨基糖苷类抗生素，能阻断细菌和真核细胞中的蛋白质合成。研究人员对一种成纤维细胞系进行基因改造，使其携带一个受 Fbx15 调控序列控制的基因，该基因能产生降解 G418 的酶。当人工表达 OSKM 因子于该细胞系时，一小部分细胞会发生状态转变并激活 Fbx15 调控序列，从而启动抗 G418 基因的表达。将 G418 加入培养基后，唯有这些细胞能够存活并增殖。经检测，这些细胞表现出诱导多能干细胞（iPS 细胞）的特性。

图 22-28 成纤维细胞重编程为 iPS 细胞过程中伴随的主要事件概览。OSKM 因子表达会引发持续数天至数周的一系列变化。重编程始于体细胞标志物的下调表达。随后出现间质-上皮转化的形态学特征（参见第 1197 页），该过程部分由细胞黏附与信号蛋白表达变化驱动。早期多能性标志物被诱导后，Nanog 和 Oct4 等多能性基因开始表达。与此同时，随着端粒酶被激活及细胞周期基因的调控，细胞获得永生特性，从而实现干细胞自我更新。当细胞激活内源性多能性基因并不再依赖 OSKM 因子时，稳定的重编程便在此时段完成。值得注意的是，绝大多数表达 OSKM 因子的成纤维细胞未能下调体细胞标志物并激活多能性基因，因此未能转化为 iPS 细胞。（改编自 M. Stadtfeld 等人，《细胞·干细胞》2:230-240, 2008，经爱思唯尔授权使用。）

Oct4、Sox2 和 Klf4 的作用仅是细胞转化过程中的一小部分。这三个核心因子激活部分靶基因并抑制其他基因，产生级联效应，从全局到各个层面重组基因调控系统，改变组蛋白修饰模式、DNA 甲基化状态和染色质压缩程度，以及无数蛋白质和非编码 RNA 的表达。在这一复杂过程结束时，最终形成的 iPS 细胞不再依赖于引发变化的 OSKM 人工因子：它已进入稳定、自我维持的协同基因表达状态，能够通过自身内源基因副本自主产生 OSKM 因子（以及多能干细胞所需的所有其他关键成分）。

= 通过实验性调控染色质修饰因子可提升重编程效率 =
早期 iPS 细胞研究中效率低下与转化缓慢的现象表明，这些实验存在阻碍分化状态向 iPS 状态转变的屏障，而克服这些屏障可能是一个艰难且很大程度上依赖偶然性的过程。这或许有助于解释为何实验结果往往多变，即便初始分化细胞在基因型和表型上完全一致，所产生的各 iPS 细胞系间仍存在显著差异。只有部分候选 iPS 细胞系能通过所有多能性测试。此外，在分子层面上，即使经过全面验证的 iPS 细胞系之间也存在差异：尽管它们共享许多特征，但在基因表达模式的细节上——例如 DNA 甲基化模式——仍有所不同。

克服这些困难对于提升我们对多细胞生物中细胞特化如何被控制和组织的理解至关重要；它也将促进许多医学进步。因此，针对重编程过程正在进行深入研究。其中一种方法旨在更清晰地揭示染色质结构在真核生物基因调控中所扮演的角色。

通过对核移植的讨论，我们可以预期，任何分化细胞的重编程都需要对特定基因相关的染色质结构进行根本而广泛的改变。不仅观察到了这些变化，大量实验还表明，通过改变影响染色质结构的蛋白质活性，可以显著提高重编程过程的效率。图 22-29 分类列举了某些经调控后可增强成纤维细胞向 iPS 细胞转化的因子；其中前三行所列的染色质重塑因子、组蛋白修饰因子及组蛋白变体，尤其以对染色质中核小体组织产生深远影响而著称（第四章已作讨论）。

图22-29 已观察到可提升重编程效率的因素。此处重点强调那些能够改变染色质状态的因素，其中前三行所列因素具有最直接的影响。上箭头表示当指定因子的活性增强时重编程效率提高；下箭头表示当指定因子的活性降低时重编程效率提高。例如，组蛋白乙酰转移酶活性增强与组蛋白去乙酰化酶活性增强会产生相反效果，这与其生化活性预期一致（参见第206页）。需注意组蛋白伴侣同样影响编程效率，其作用可能是正向或负向的，具体取决于组装入染色质的组蛋白变体类型。

= 胚胎干细胞与诱导多能干细胞可被引导生成特定成体细胞类型甚至类器官 =
我们可以将胚胎发育视为细胞在从受精卵到终末分化的道路上所面临的一系列选择。即便在培养环境中经历了漫长的停留，胚胎干细胞（ES 细胞）或诱导多能干细胞（iPS 细胞）及其后代仍能识别发育路径中每个分支的信号，并作出与正常早期胚胎细胞相同的反应。然而，若将 ES 或 iPS 细胞直接植入发育后期胚胎或成体组织中，它们无法接收到正确的信号序列；其分化过程便会失控，往往形成称为畸胎瘤的肿瘤，其中包含与植入部位不相符的多种细胞类型（图 22-30）。

通过在培养过程中将 ES 或 iPS 细胞暴露于适当序列的生长因子及其他信号蛋白，并精确控制递送时机，可以引导这些细胞沿着近似正常发育路径的方向分化，最终转化为标准化的、已分化的成体细胞类型（图 22-31 及视频 22.2）。这一过程虽需反复试验，但目前已成功实现多种小鼠和人类分化细胞类型的转化，包括人类多巴胺能神经元及胰岛素分泌 \beta 细胞——这两种细胞分别缺失于帕金森病与 1 型糖尿病患者体内。

值得注意的是，在适宜条件下，小鼠或人类的 ES 细胞、iPS 细胞及其后代能够在培养体系中增殖、分化并自组装形成微型三维器官，即类器官，其组织结构与真实器官高度相似。图 22-32 展示了一个早期惊人案例：人类 ES 细胞成功发育出眼类器官结构。

小鼠和人类的胚胎干细胞（ES）及诱导多能干细胞（iPS），以及由它们衍生的祖细胞，已被用于形成模拟多种发育器官的类器官，其中包括人类大脑的重要部分——这可以说是地球上最复杂精密的构造。这类类器官为研究器官发育提供了强大的培养皿模型，使人们能够识别和研究相关基因，并以在完整生物体中无法实现的方式探索细胞间相互作用的作用。我们之前讨论过一个显著的例证：单个多能肠道干细胞在适当的培养条件下能够形成复杂的肠道类器官（见图 22-14）。

= 一种特化类型的细胞可被强制直接转分化成另一种类型 =
我们刚刚描述的路径，即通过转化为 iPS 细胞从一种分化细胞转变为另一种分化细胞，似乎绕了不必要的弯路。我们能否直接将分化细胞类型 A 转化为分化细胞类型 B，而无需回溯到多能干细胞？多年来，已知在少数特殊情况下可以实现这种转分化，

图 22-30 畸胎瘤。这些肿瘤包含来自每个胚胎胚层（内胚层、中胚层和外胚层，包括此处可见的毛发和牙齿）的组织。这些肿瘤通常是良性的，当将 ES 或 iPS 细胞注射到免疫相容的成年动物体内时可能形成，这证明了这些干细胞的多能性。（由曹宣促提供。）

图 22-31 小鼠或人类 ES 或 iPS 细胞在培养中分化为特定细胞的过程。ES 和 iPS 细胞以单层贴壁培养时可无限保持多能性。若将其解离并形成称为拟胚体的聚集体，则会启动细胞特化进程。通过在不同因子添加的培养基中培养拟胚体细胞，可引导其向多种方向分化。值得注意的是，与小鼠相比，从人多能干细胞获得分化细胞所需时间显著延长，这反映了人类发育速率远慢于小鼠。（基于 B. Fuchs 和 J.A. Segre 发表于《细胞》100:143-155, 2000 的研究。）

例如通过强制表达 MyoD 可将成纤维细胞转化为骨骼肌细胞（参见第 428 页）。但如今，随着对 ES 和 iPS 细胞研究的深入，已发现更多实现此类转化的方法，包括将成纤维细胞转化为神经元、肝细胞和肠上皮细胞等广泛类型。

一个具有特殊医学意义的优雅例子来自心脏研究。通过强制表达适当的转录因子组合

图 22-32 培养的人类胚胎干细胞可形成三维类器官。(A)示意图显示，在适当条件下，小鼠或人类多能干细胞及其培养后代能够增殖、分化并自组装成三维眼状结构（视杯），该结构包含多层视网膜，其组织结构与正常眼发育过程中体内形成的视网膜相似。(B)人类胚胎干细胞在培养中形成的视杯荧光显微图像。该结构包含发育中的视网膜（绿色染色），具有多层神经细胞，以及下方的色素上皮层（顶端表面红色染色）。所有细胞核均呈蓝色染色。（A 图改编自 M. Eiraku 和 Y. Sasai，《当前神经生物学观点》22:768-777, 2012；B 图来自 T. Nakano 等，《细胞干细胞》10:771-785, 2012。经爱思唯尔许可使用。）

调控因子——并非 Oct4、Sox2、Klf4 和 Myc，而是 Gata4、Mef2c 与 Tbx5——能够直接将心脏成纤维细胞转化为心肌细胞。这一过程已在活体小鼠中通过逆转录病毒载体实现，当携带转基因的载体直接注入心肌组织时，转化效率极高。尽管成纤维细胞仅占心脏组织体积的一小部分，但在正常心脏中其数量超过心肌细胞，且在心肌细胞已死亡的区域大量存活。因此，在典型的非致命性心脏病发作中，当心肌细胞因缺氧死亡时，成纤维细胞会增殖并产生胶原性细胞外基质，用纤维瘢痕替代失去的肌肉组织。这是一种效果欠佳的修复方式。通过强制心脏中适当因子的表达，如上所述，已证明至少在老鼠身上，能够超越自然，通过心脏成纤维细胞的转分化再生失去的心肌。虽然将这项技术应用于人类心脏病治疗仍前路漫长，但它揭示了未来可能的前景——不仅针对这一医学难题，还包括许多其他疾病。

尽管将这项技术应用于人类心脏病治疗仍前路漫长，但它揭示了未来可能的前景——不仅针对这一医学难题，还包括许多其他疾病。

= ES 和 iPS 细胞在药物发现和疾病分析中也大有可为 =
围绕 ES 和 iPS 细胞以及转分化技术的大部分兴奋点，源于利用人工生成细胞进行组织修复的前景。这开始让人觉得，几乎任何类型的组织都可能被替换，从而治疗以往除器官移植外无法治愈的退行性疾病。该领域的研究进展迅速，但仍有许多困难需要克服。

随着 iPS 细胞和直接转分化技术的出现，至少在理论上，器官移植面临的一个主要障碍——免疫排斥问题——已被克服。胚胎干细胞（ES 细胞）由于通常来源于无关捐赠者的早期胚胎，其基因永远不会与接受细胞移植者的细胞完全一致。因此，移植的细胞及其后代容易遭受免疫系统的排斥。相比之下，iPS 细胞和转分化细胞都可以从个体自身组织的小样本中生成，当移植回同一个体时，理应能避免免疫攻击。

然而，通过细胞和类器官移植进行组织修复并非胚胎干细胞、诱导多能干细胞及转分化细胞的唯一应用领域：还存在其他更具即时价值的方法。特别值得一提的是，这些细胞可用于在培养中生成大量、同质化的任意选定类型的特化细胞群体，这些细胞既能用于疾病机制的研究，也能用于寻找针对特定细胞缺陷的新药物（图22-33）。

<nowiki>当疾病由遗传因素引起时，可以从患者体内提取诱导多能干细胞（iPS 细胞），利用这些细胞产生功能异常的特异性细胞类型，以此研究功能障碍的发生机制，并筛选可能有助于纠正该状况的药物。蒂莫西综合征便是一个例证。这种罕见遗传病因特定类型 \mathrm{Ca^{2 + }} 通道的基因突变导致危及生命的心律严重紊乱（以及其他多种异常）。为探究其病理机制，研究人员从患者皮肤成纤维细胞中培育出 iPS 细胞，并诱导其分化为心肌细胞。与正常对照组以相同方式制备的心肌细胞相比，这些细胞表现出不规则的心肌收缩以及可被详细表征的 \mathrm{Ca^{2 + }} 内流和电活动异常模式。基于这些发现，开发体外检测方法以筛选可能纠正心肌细胞异常行为的药物仅剩一步之遥。</nowiki>

即使在病因不明的遗传性疾病中，诱导多能干细胞（iPS 细胞）也有助于理解病情。例如，脑类器官的研究就展示了其应用价值。

图 22-33 iPS 细胞在药物发现及遗传性疾病分析与治疗中的应用。图表左侧展示了如何利用遗传性疾病患者来源的 iPS 细胞生成分化细胞，进而分析疾病机制并发现治疗药物。右侧则说明了如何在 iPS 细胞中修复基因缺陷，随后诱导其定向分化并安全移植回个体体内，避免免疫排斥风险。（改编自 D.A. Robinton 和 G.Q. Daley，《自然》481:295-305，经 SNCSC 许可转载）

利用来自患有小头畸形个体的 iPS 细胞生成，该病症以大脑生长和发育严重受阻为特征。对这些发育中的大脑类器官的仔细分析显示，此例小头畸形似乎是由于大脑祖细胞增殖与分化过早停止所致，导致分化出的大脑细胞数量异常稀少。

= 摘要 =
在成年哺乳动物体内，各种类型的组织特异性干细胞高度特化，每种仅能产生有限范围的分化细胞类型。细胞在胚胎发育过程中被限定于特定的分化路径。一种强制回归多能或全能状态的方法是通过核移植：将分化细胞的细胞核注入去核卵母细胞中，其细胞质能将注入细胞核的基因组重编程至近似早期胚胎状态。这使得被注入的卵母细胞能够发育成一个完整的新个体。基因组回归此状态涉及染色质结构和 DNA 甲基化在基因组范围内的根本性改变。

值得注意的是，从早期哺乳动物胚胎内细胞团提取的细胞能够在培养中无限期保持多能性状态。当将这些胚胎干细胞（ES 细胞）移植回宿主早期胚胎时，它们能够分化成任何组织类型的细胞，包括生殖系。ES 细胞在小鼠遗传工程领域具有不可估量的价值。通过强制表达关键转录调控因子组合，可以从成体分化细胞（如成纤维细胞）中培育出具有相似特性的诱导多能干细胞（iPS 细胞）。类似方法还可用于直接将已分化的成体细胞从一种特化类型重编程为另一种类型。理论上，从成人个体细胞培育出的 iPS 细胞可用于该个体自身的组织修复，从而避免免疫排斥问题。更直接地，iPS 细胞提供了特化细胞的来源，可用于体外分析影响人类细胞的突变效应，并筛选治疗遗传性疾病的药物。胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）及其后代均能在培养中形成微小器官（类器官），这为人类发育与疾病研究提供了强有力的模型。

= 问题 =

= 哪些陈述是正确的？请解释原因。 =
22-1 在小鼠小肠中，隐窝内的干细胞通过不对称分裂来维持构成隐窝和绒毛的细胞群体；每次分裂后，一个子细胞保持为干细胞，另一个则开始快速分裂以产生分化的后代。

22-2 所有组织中的干细胞都是相同的。

22-3 每个能够再生的组织都是由特定于该组织的干细胞群体进行更新的。

22-4 尽管小鼠会持续更换其嗅球中的神经元，鸣禽为每个交配季节优化歌声时会替换大量神经元，但人类不具备更换大脑中神经元的能力。

= 讨论以下问题。 =
22-5 在 20 世纪 50 年代，科学家们给大鼠喂食 \mathrm{^3H} -胸苷，以标记正在合成 DNA 的细胞，并随后追踪标记细胞长达一年的命运。他们在不同组织中发现了三种细胞标记模式。某些组织如中枢神经系统和视网膜的神经元细胞未被标记。相比之下，肌肉、肾脏和肝脏各自显示出少量保留标记的细胞，这些细胞显然未进一步分裂或丢失。最后，诸如舌头和食道的鳞状上皮细胞中有相当数量的细胞被标记，12 小时内可见放射性核对；然而，标记细胞随时间推移而消失。如果标记细胞是由干细胞产生的，您预计会看到这三种标记模式中的哪一种？请解释您的答案。

22-6 在任何特定时间，小鼠的单个肠隐窝大约包含 15 个干细胞和 10 个潘氏细胞。细胞分裂大约每天发生一次，分裂后的子细胞只有在保持与潘氏细胞接触的情况下才能维持干细胞特性。这种对潘氏细胞接触的持续竞争提出了隐窝可能随时间推移变成单克隆的可能性；也就是说，某一时间点的隐窝细胞可能仅源自早期存在的 15 个干细胞中的一个。为了验证这种可能性，研究人员使用所谓的"彩点标记"，该标记在激活后会在隐窝干细胞中表达三种荧光蛋白之一。随后通过观察不同时期的隐窝，检测其是否包含多种颜色或仅单一颜色的细胞（图 Q22-1）。隐窝是否会随时间变成单克隆？如何判断？

22-7 胰腺中新 \beta 细胞的起源——是来自干细胞还是已有的 \beta 细胞——直到最近才通过谱系追踪技术得以解决。研究人员设计了转基因小鼠，使其在胰岛素启动子（仅活跃于 \beta 细胞）控制下表达他莫昔芬激活型 Cre 重组酶。通过这些小鼠，科学家能通过添加他莫昔芬移除 DNA 的抑制片段，从而表达可用组织化学染色检测的人胎盘碱性磷酸酶（HPAP）。在一次性给予他莫昔芬使幼鼠中约 30% 的 \beta 细胞转化为表达 HPAP 的细胞后，研究人员追踪了标记 \beta 细胞占比一年，期间胰腺中 \beta 细胞总数增长了 6.5 倍。若新 \beta 细胞源自干细胞，你认为 \beta 细胞比例将如何随时间变化？若新 \beta 细胞源自现有 \beta 细胞呢？图 Q22-2 的结果支持哪种假设？

22-8 最早用于检测造血干细胞的实验方法之一利用了它们在重度辐照小鼠脾脏中形成集落的能力。通过改变移植骨髓细胞的数量，研究人员发现脾脏集落数量与剂量呈线性关系，且曲线通过原点，

图 Q22-2 不同年龄小鼠胰岛中标记 \beta 细胞的百分比（问题 22-7）。所有小鼠在 6-8 周龄时注射一次他莫昔芬脉冲，随后在不同时间点对其胰腺细胞进行 HPAP 染色。误差棒代表各时间点所有分析动物的标准差。（改编自 Y. Dor 等人《自然》429:41-46, 2004，图 2）

这表明单个细胞能够形成独立集落。然而，由于集落形成率相对于移植细胞数量较为罕见，可能存在由两个或更多未分散细胞团块作为实际起始源的情况。

一篇经典论文通过利用辐射产生的罕见、细胞学上可见的基因组重排解决了这一问题。受体小鼠首先接受辐射以清除骨髓细胞，随后在移植后再次接受辐射，从而在移植细胞群体中产生罕见的基因组重排。之后通过筛选脾脏集落来寻找携带基因组重排的集落。你认为这个实验如何区分单细胞定植与细胞团块定植？

22-9 利用针对细胞表面靶标的抗体组合纯化造血干细胞是可行的。通过去除表达特定谱系表面标志物（如 B 细胞、粒细胞、髓系单核细胞和 T 细胞）的细胞，研究人员获得了富含干细胞的细胞群体。他们通过阳性筛选表达疑似干细胞表面标志物的细胞，进一步富集了这群假定干细胞。图 Q22-3 显示了这些假定干细胞与未分选骨髓细胞在辐照小鼠体内形成脾脏集落的情况。考虑到仅有约十分之一的细胞能定植于脾脏，这些结果是否支持富集群体主要由造血干细胞组成的观点？需要哪些额外信息才能确信富集细胞是真正的干细胞？骨髓细胞中造血干细胞的比例是多少？

图 Q22-3 经干细胞富集的细胞与未分选骨髓细胞形成的脾脏集落（问题 22-9）。

22-10 诱导多能干细胞（iPS 细胞）的生成最初是通过使用逆转录病毒载体将 OSKM（Oct4、Sox2、Klf4 和 Myc）这组转录调控因子导入细胞实现的。成纤维细胞重编程的效率通常较低 (0.01%) ，部分原因是需要大量逆转录病毒整合才能实现重编程，而每次整合事件都伴随着不适当地破坏或激活关键基因的风险。您认为还可以通过哪些其他方式或形式来递送 OSKM 转录调控因子，以避免这些问题？

22-11 为验证血液中是否存在影响小鼠中枢神经系统神经发生的因子，您采用连体共生技术——即将两个个体的循环系统相连——来观测海马齿状回神经源性微环境的变化。如图 Q22-4A 所示，您将两只年轻小鼠、两只老年小鼠或一老一幼两只小鼠的循环系统相连。五周后，使用双皮质素（Dcx）抗体对齿状回切片进行染色（该标记物可识别新生神经元），并统计新生神经元数量，结果汇总于图 Q22-4B 和 C。年轻-年轻连体组与老年-老年连体组的结果与单独饲养的年轻或老年小鼠无异。这些结果是否支持血液因子影响海马齿状回神经发生的观点？请说明理由。在一老一幼的连体实验中，哪只小鼠（若存在受益方）会获益？

图 Q22-4 异种共生对小鼠海马齿状回新生神经元数量的影响（问题 22-11）。(A) 成对小鼠间的循环系统连接（异种共生）。(B) 年轻小鼠与年轻小鼠配对（同龄共生）或年轻小鼠与老年小鼠配对（异龄共生）中的 Dcx 阳性细胞（新生神经元）。(C) 老年小鼠与老年小鼠配对（同龄共生）或老年小鼠与年轻小鼠配对（异龄共生）中的 Dcx 阳性细胞。同龄共生指同年龄小鼠间的异种共生；异龄共生指不同年龄小鼠间的异种共生。星号表示结果的统计学显著性：*表示 P< 0.05 预期该结果在 20 次重复中偶然发生的概率小于 1 次；**表示 < 0.01 预期该结果在 100 次重复中偶然发生的概率小于 1 次。

= 参考文献 =

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[[Notein一笔记]] • [[supermemo]]
</div>
</div>
</div>


<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">iOS</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[supermemo]] • [[应用4]]
</div>
</div>
</div>


<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">MAC</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[应用3]] • [[应用4]]
</div>
</div>
</div>


<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">Windows</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[supermemo]] • [[应用4]]
</div>
</div>
</div>


<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">Linux</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[应用3]] • [[应用4]]
</div>
</div>
</div>
</div>

</div>
</includeonly>

<noinclude>
== 无纸化学习导航模板 ==
这是一个无纸化学习平台和应用的导航模板。

=== 使用方法 ===
在相关条目底部添加：
<pre>
{{无纸化学习}}
</pre>

模板:无纸化学习

2025-08-30T05:36:45Z

Magezeya：

<includeonly>
<div style="width: 100%; margin: 1em 0; border: 1px solid #a2a9b1; background-color: #f8f9fa; font-size: 95%; line-height: 1.5em; box-sizing: border-box;">
<div style="text-align: center; font-size: 125%; font-weight: bold; padding: 0.4em; background: #ececec; border-bottom: 1px solid #a2a9b1;">无纸化学习</div>

<div style="display: flex; flex-wrap: wrap; justify-content: space-around; padding: 0.5em;">


<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">安卓</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Notein一笔记]] • [[supermemo]]
</div>
</div>
</div>


<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">iOS</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[supermemo]] • [[应用4]]
</div>
</div>
</div>


<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">MAC</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[应用3]] • [[应用4]]
</div>
</div>
</div>


<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">Windows</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[supermemo]] • [[应用4]]
</div>
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<div style="flex: 1; min-width: 200px; padding: 0.5em;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; background: #d4d4d4; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 4px;">Linux</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; margin-bottom: 0.5em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #2e7d32;">免费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[Onenote]] • [[obsidian]]·[[思源笔记]]
</div>
</div>

<div style="background: #e8e8e8; padding: 0.3em; border-radius: 3px;">
<div style="text-align: center; font-weight: bold; color: #c62828;">付费</div>
<div style="text-align: center; padding: 0.2em;">

[[应用3]] • [[应用4]]
</div>
</div>
</div>
</div>

<div style="text-align: center; font-size: 90%; padding: 0.5em; border-top: 1px solid #a2a9b1; background: #ececec;">
[[无纸化学习]]
</div>
</div>
</includeonly>

<noinclude>
== 无纸化学习导航模板 ==
这是一个无纸化学习平台和应用的导航模板。

=== 使用方法 ===
在相关条目底部添加：
<pre>
{{无纸化学习}}
</pre>

思源笔记

2025-08-30T05:36:00Z

Magezeya：/* 使用 */

== 下载 ==
https://b3log.org/siyuan/download.html

在这个网站上选择自己的那一端，点击即可下载

== 使用 ==
第一次使用会让你新建一个工作空间，类似于obsidian的仓库。我们可以选择一个文件夹作为工作空间（避免选择软件安装的文件夹。）如果需要新建一个项目空间可以按照如下操作进行

[[文件:思源笔记教程-工作空间.png|无框|1000x1000像素]]

对于任何一个工作空间而言，我们可以在本地打开这个对应的文件夹

[[文件:思源笔记教程-工作空间文件夹1.png|左|无框|1000x1000像素]]

然后我们的文件存储在data目录下，如下
[[文件:思源笔记教程-工作空间文件夹2.png|无|缩略图|800x800像素]]
那个看起来混乱的文件夹就是你的笔记本，内含若干.cy格式文件，实际上是json格式，可以通过改后缀的方式进行阅读。

笔记本新建的方法
[[文件:思源笔记教程-笔记本.png|无|缩略图|599x599像素]]
其余的内容可以通过用户指南获取相关的教程

== 使用经验 ==

思源笔记

2025-08-30T05:34:02Z

Magezeya：

文件:思源笔记教程-笔记本.png

2025-08-30T05:33:02Z

Magezeya：

文件:思源笔记教程-工作空间文件夹2.png

2025-08-30T05:29:38Z

Magezeya：

文件:思源笔记教程-工作空间文件夹1.png

2025-08-30T05:27:42Z

Magezeya：

文件:思源笔记教程-工作空间.png

2025-08-30T05:21:26Z

Magezeya：

工作空间切换示例

思源笔记

2025-08-30T05:17:54Z

Magezeya：创建页面，内容为“使用教程”

使用教程

无纸化学习

2025-08-30T05:17:18Z

Magezeya：/* 笔记软件评测 */

本篇文章记录无纸化学习的各个方面，主要是测评和方法等。编者阅历有限，希望其他的编者也能参与进来补充完整

== 电子资料获取方式 ==
[[查阅资料]]

== 笔记软件评测 ==
以下评测如果需要新增评测条目，可以按照以下格式进行

{{无纸化学习}}

以上的索引为对应具体的使用方法和经验的词条。

同时欢迎其他人对各种的笔记软件提供使用方法，教程等经验性得内容。但是希望可以单开一个个独立的词条并链接过来，避免这个词条过长
如果一个笔记软件的主要功能需要付费解锁，可以放在付费列，如果核心功能基本不受到任何影响，而且付费项在无关紧要的地方（比如云空间，或者增加的AI功能等这些不影响核心笔记功能使用的地方），为了方便后来者选择自己的笔记软件，归入免费
您可以将这个模板用于未来其他笔记软件的评测。<syntaxhighlight lang="text">
软件名称

概述

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux（使用粗体）

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：提供相关的下载链接，尽量不将较大的文件上传上来。
</syntaxhighlight>

==== 付费 ====

===== Notein一笔记 =====
概述

Notein一笔记是一款专注于PDF标注与处理的付费笔记应用。它采用买断制付费模式，核心优势在于强大的PDF阅读与批注体验，并内置了实用的文件管理与编辑功能。其定位更偏向于专业的PDF工具而非知识管理工具。

2. 价格与授权

授权模式：一次性买断制

价格：约50元人民币

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型： PDF，无边界笔记，笔记本，PPT，doc，excel，epub，caj，图片

组织方式：内置文件夹和标签，收藏功能

模板：支持一定的笔记本样式的模板

OCR能力：不支持

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持PDF文本手写批注，具有专门的阅读模式，支持多数安卓平台设备的触控笔快捷键（华为，荣耀，三星，小米，OPPO，vivo，联想）支持插入外链，支持插入图片，录音，文本等。可以创建图层（但是没有图层蒙版）

PDF编辑：支持合并、拆分、提取页面，改变页边栏，增加目录，书签等操作，支持PDF导出为多层PDF，单纯PDF。

2.3 文件管理

文件类型支持：支持PPT，doc，excel，epub，caj，图片等，展现方式与PDF类似，但是部分文件格式导入过程较为缓慢

文件管理方式：内置管理器，但是需要把自己阅读的文件先导入，不支持批量导入

3. 同步与云服务

官方云同步：没有官方云服务

第三方网盘同步： OneDrive，华为云

同步可靠性：有自动备份

没有多人协作能力

4. 特色功能

多文件对照阅读，支持单向内部文件链接，支持连接到url

5. 性能与跨平台

'''平台支持：安卓，鸿蒙'''

性能表现：本体启动速度快，但是个别格式文件启动慢，大文件导入慢

离线使用：可以

6. 缺点与不足

存储空间压力，导入机制对设备本地存储容量有较高要求。

知识网络没有可视化功能

没有AI功能

获取方式：https://notein.cn/

===== supermemo =====
概述

并非传统的笔记软件，但是和生物竞赛的应用环境非常相配的一个间隔复习软件。可以进行渐进阅读，增量学习，依赖supermome算法进行复习，据说比多邻国算法强3倍。但是使用本身相当硬核，付费较贵，而且主要对epu格式书籍的适配更好

2. 价格与授权

授权模式：买断制（对应版本）

价格： supermemo19Windows版售价为70美元（约合人民币450元）supermemo18Windows版售价32美元（约和人民币200元）。需要海外支付
[[文件:Supermemo18购买界面.png|缩略图|463x463像素|supermemo18的购买界面，生化瞩目]]

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：核心是制作问答对（卡片）。支持文本、图片、音频（如录制自己的发音对比）等多种格式。（类似于anki，但是算法，功能性都不一样）

组织方式：采用基于优先级的待办事项队列来管理每日的学习和复习任务

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：通过渐进阅读功能，可以将PDF文本导入并分解为摘录，然后逐步制作成记忆卡片

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：管理方式比较复杂，需要自行学习，然后这个管理本身是为记忆服务的。

文件管理方式：软件会根据算法，为每张卡片计算出了不同难度、不同复习次数下对应的最佳复习间隔。（SM-18，SM-19。anki算法是SM-2，这也是最常见的基于遗忘曲线的复习算法）

3. 同步与云服务

官方云同步：提供同步功能，支持在SuperMemo平台（在线和离线）同步课程

第三方网盘同步：生态闭塞

4. 特色功能

间隔重复算法：这是SuperMemo的立身之本。其算法（如SM-2，也是Anki算法的原型）经过多年迭代，旨在科学地计算最优复习间隔，节省记忆时间。

渐进阅读：允许用户增量式地阅读文章，逐步将文章内容转化为结构化、易于记忆的知识点（问答卡片），解决记忆的质量问题。

复习队列：解决记忆的价值问题。可以给不同知识卡片设定优先级，确保在有限的学习时间内，总是先复习最重要、最高价值的内容。

AI（主要是移动端应用）：AI助手（解答学习疑问）等（付费）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：提供Windows桌面端、iOS和Android移动端应用以及网络浏览器版本，但是除了Windows版以外都是半残废'''

性能表现： ui及其复古

离线使用：支持

6. 缺点与不足

学习难度非常陡峭。移动端几乎残废，没有协作能力，生态闭塞。'''贵'''

获取方式：https://supermemo.store/

wiki百科<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Main_Page

安装教程<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Installing_SuperMemo_(in_a_minute)

===== obsidian =====
概述

Obsidian是一款以本地优先、Markdown为基础的双向链接笔记软件，主打知识网络构建和高度可定制性。它通过双向链接和图谱视图帮助用户建立非线性的知识体系，适合长期知识管理、学术研究、写作和项目管理。其核心优势在于'''数据完全本地存储（但是明文）'''、'''强大的社区插件生态'''和'''可深度定制的界面'''

整体体验类似wiki，属于知识管理软件

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。核心功能完全免费，部分高级功能（如官方同步、发布）需付费（订阅制）

价格：

* Sync（同步服务）：约 $10/月或 $96/年，提供端到端加密的多设备同步。
* Publish（发布服务）：约 $20/月或 $192/年，可将笔记发布为专业网站。

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：提供Markdown编辑器，支持实时预览、表格、任务列表、代码块、数学公式（LaTeX）等46。支持“所见即所得”编辑模式，支持内嵌PDF（就是在你的笔记里面直接嵌入一个PDF阅读器，你可以直接看）

组织方式：核心是双向链接 (<code>[[ ]]</code>) 和关系图谱（Graph View），自动生成反向链接和未链接提及，形成知识网络29。支持标签（<code>#tag</code>）和文件夹层级管理。

模板：支持模板，支持自动化，甚至可以嵌入AI

OCR能力：社区应该有（但是社区就是连接到github，所以存在语言和网络需求）

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：原生支持较弱，主要通过社区插件（如<code>PDF Highlights</code>、<code>Annotator</code>）实现PDF导入和标注，标注内容可链接回笔记。

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：基于本地文件系统（称为“库”Vault），所有笔记均为标准Markdown（<code>.md</code>）文件，可用任何文本编辑器打开。内置文件浏览器。可以通过外部代码（如Python）进行一些不依赖脚本的自动化。所有信息明文存储在本地，有一定的安全风险，相反十分开放。

文件管理方式：依赖系统文件管理器，迁移方便

3. 同步与云服务

官方云同步：提供付费的Obsidian Sync服务，支持端到端加密、版本历史和跨设备同步

第三方网盘同步：几乎支持任何云盘

同步可靠性：因情况而异，多端同步多数情况较差

4. 特色功能

社区插件市场提供近千款插件，涵盖日程管理、看板、间隔重复、AI辅助等，极大扩展功能，有能力你也可以写

支持css，可以定制外观

存在一个画布模式（canvas），可以自行放置笔记图片文件并进行链接，效果类似于那种探案电视剧里面的白板，界面看起来像渲染软件的shader界面

5. 性能与跨平台

'''平台支持：极其全面。提供Windows、macOS、Linux桌面端，以及iOS和Android移动端应用，但是没有原生的免费跨平台能力'''

性能表现：启动和基础操作流畅。但在打开非常大的库（数万笔记）或启用过多复杂插件时，可能会遇到性能压力，实测文件数量达到两万时，48gb内存，7950hx需要半个小时启动。所以不建议搞巨多文件，不适合渐进阅读，更适合做wiki式的笔记。

离线使用：原生所有功能本地实现，完全可以离线用。可以通过一些方式使用本地部署大模型，但是需要折腾。

6. 缺点与不足

几乎没有协作能力，学习曲线略陡峭，移动端效果不佳

获取方式：https://obsidian.md/

==== 免费 ====

===== onenote =====
概述

Microsoft OneNote 是微软公司开发的一款数字笔记本应用，采用自由格式的画布设计，支持多媒介内容混合排版。它深度集成于 Microsoft 365 生态系统，主打强大的信息收集、整理和跨设备同步能力，适合用于课堂笔记、会议记录、项目规划和知识库构建。（更像办公软件）

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。基础功能免费，高级功能需订阅 Microsoft 365。绝大多数功能都可以免费获取，付费主要是为365生态付费

价格：这个价格实际是onedrive的价格

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：支持富文本、手写、录音、录像、图片、表格、便签等多种媒介。其独特的自由画布设计允许在任何位置输入和放置内容，可以融入365生态。原则上支持手写笔，但是这个功能做的很差。

组织方式：采用“笔记本 - 分区 - 页面 - 子页面”的多层级结构，逻辑清晰，符合传统笔记本的使用习惯。（你只有三层的分类余地）如果不是本地存储的笔记本，实际上是onedrive上的一个文件夹，而且笔记是特有格式，转移不便。

OCR能力：原则上有，但是移动端功能残废

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：不是原生支持PDF，你理论上可以导入进来看，但是是单向的，而且非常难用

PDF编辑：不具备原生的PDF编辑（如合并、拆分）能力

2.3 文件管理

文件类型支持：可作为容器嵌入各种文件（如Excel表格、Word文档、Visio图表），双击即可在原应用中打开编辑，主要为365生态内容

文件管理方式：云端本地都行，一般用云端，本地起到备份作用。实际是一堆文件夹里面放着专有文件格式

3. 同步与云服务

官方云同步： onedrive

第三方网盘同步：不支持

同步可靠性：多端即时同步能力是这个笔记软件的核心强点，你可以在移动端进行编辑，几乎同时同步到其他端（但是貌似其他的专业办公软件也能做到），会存在冲突情况，这个时候需要自行选择版本了

4. 特色功能

存在单向链接，原则上有AI功能，中国大陆用不了。

深度Office集成：与Word, Excel, Outlook等应用无缝协作。例如，可将Outlook会议详情一键发送至OneNote。

协作功能：支持多人实时共同编辑同一页面，更改会高亮显示并记录作者信息。

“@me”功能：可以创建待办事项并在Microsoft To Do中同步管理。

强大的网络研究工具，可裁剪网页内容并自动附上源链接。内质一个搜索引擎（纯多余）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：拥有Windows（预装）、macOS、iOS、Android、Web网页版应用，并对Windows用户提供功能更完整的OneNote for Windows 10/11（现已合并）和OneNote (Desktop) 两个版本。（基本上要依赖windows端）'''

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线缺点不少，能用。

6. 缺点与不足

复杂文件同步经常冲突

非原生PDF支持： “打印至OneNote”的方式对于需要精确PDF标注和归档的用户来说不够专业。

自由画布的副作用：内容对齐困难，排版可能显得杂乱，强迫症用户体验不佳。

功能复杂且隐蔽：很多高级功能藏得很深，学习曲线相对陡峭。（但是依然是非常好上手的类型）

存储限制：免费用户的5GB OneDrive空间对于重度用户而言很快会被多媒体笔记占满。

获取方式：https://www.onenote.com/?omkt=zh-CN&public=1

==== [[思源笔记]] ====
概述

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：免费

价格：部分高级功能付费（主要是关于同步的）

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：特有文件，但是可以导出

组织方式：大纲

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持阅读，批注，链接

PDF编辑：没有PDF编辑能力

2.3 文件管理

文件类型支持：支持绝大多数文件

文件管理方式：内置管理器

3. 同步与云服务

官方云同步：是

第三方网盘同步：需要付费

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、web内容原格式剪裁，AI功能，间隔重复（fsrs），脑图，数据库，思维导图，甚至五线谱等

5. 性能与跨平台

'''平台支持：全端'''

性能表现：流畅度很高，对大量文件的适应度尚可

离线使用：可离线

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：https://b3log.org/siyuan/download.html
[[Category:无纸化学习]]

无纸化学习

2025-08-30T05:09:38Z

Magezeya：/* 思源笔记 */

本篇文章记录无纸化学习的各个方面，主要是测评和方法等。编者阅历有限，希望其他的编者也能参与进来补充完整

== 电子资料获取方式 ==
[[查阅资料]]

== 笔记软件评测 ==
以下评测如果需要新增评测条目，可以按照以下格式进行

{{无纸化学习}}

以上的索引为对应具体的使用方法和经验的词条。

同时欢迎其他人对各种的笔记软件提供使用方法，教程等经验性得内容。但是希望可以单开一个个独立的词条并链接过来，避免这个词条过长
如果一个笔记软件的主要功能需要付费解锁，可以放在付费列，如果核心功能基本不受到任何影响，而且付费项在无关紧要的地方（比如云空间，或者增加的AI功能等这些不影响核心笔记功能使用的地方），为了方便后来者选择自己的笔记软件，归入免费
您可以将这个模板用于未来其他笔记软件的评测。<syntaxhighlight lang="text">
软件名称

概述

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux（使用粗体）

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：提供相关的下载链接，尽量不将较大的文件上传上来。
</syntaxhighlight>

==== 付费 ====

===== Notein一笔记 =====
概述

Notein一笔记是一款专注于PDF标注与处理的付费笔记应用。它采用买断制付费模式，核心优势在于强大的PDF阅读与批注体验，并内置了实用的文件管理与编辑功能。其定位更偏向于专业的PDF工具而非知识管理工具。

2. 价格与授权

授权模式：一次性买断制

价格：约50元人民币

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型： PDF，无边界笔记，笔记本，PPT，doc，excel，epub，caj，图片

组织方式：内置文件夹和标签，收藏功能

模板：支持一定的笔记本样式的模板

OCR能力：不支持

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持PDF文本手写批注，具有专门的阅读模式，支持多数安卓平台设备的触控笔快捷键（华为，荣耀，三星，小米，OPPO，vivo，联想）支持插入外链，支持插入图片，录音，文本等。可以创建图层（但是没有图层蒙版）

PDF编辑：支持合并、拆分、提取页面，改变页边栏，增加目录，书签等操作，支持PDF导出为多层PDF，单纯PDF。

2.3 文件管理

文件类型支持：支持PPT，doc，excel，epub，caj，图片等，展现方式与PDF类似，但是部分文件格式导入过程较为缓慢

文件管理方式：内置管理器，但是需要把自己阅读的文件先导入，不支持批量导入

3. 同步与云服务

官方云同步：没有官方云服务

第三方网盘同步： OneDrive，华为云

同步可靠性：有自动备份

没有多人协作能力

4. 特色功能

多文件对照阅读，支持单向内部文件链接，支持连接到url

5. 性能与跨平台

'''平台支持：安卓，鸿蒙'''

性能表现：本体启动速度快，但是个别格式文件启动慢，大文件导入慢

离线使用：可以

6. 缺点与不足

存储空间压力，导入机制对设备本地存储容量有较高要求。

知识网络没有可视化功能

没有AI功能

获取方式：https://notein.cn/

===== supermemo =====
概述

并非传统的笔记软件，但是和生物竞赛的应用环境非常相配的一个间隔复习软件。可以进行渐进阅读，增量学习，依赖supermome算法进行复习，据说比多邻国算法强3倍。但是使用本身相当硬核，付费较贵，而且主要对epu格式书籍的适配更好

2. 价格与授权

授权模式：买断制（对应版本）

价格： supermemo19Windows版售价为70美元（约合人民币450元）supermemo18Windows版售价32美元（约和人民币200元）。需要海外支付
[[文件:Supermemo18购买界面.png|缩略图|463x463像素|supermemo18的购买界面，生化瞩目]]

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：核心是制作问答对（卡片）。支持文本、图片、音频（如录制自己的发音对比）等多种格式。（类似于anki，但是算法，功能性都不一样）

组织方式：采用基于优先级的待办事项队列来管理每日的学习和复习任务

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：通过渐进阅读功能，可以将PDF文本导入并分解为摘录，然后逐步制作成记忆卡片

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：管理方式比较复杂，需要自行学习，然后这个管理本身是为记忆服务的。

文件管理方式：软件会根据算法，为每张卡片计算出了不同难度、不同复习次数下对应的最佳复习间隔。（SM-18，SM-19。anki算法是SM-2，这也是最常见的基于遗忘曲线的复习算法）

3. 同步与云服务

官方云同步：提供同步功能，支持在SuperMemo平台（在线和离线）同步课程

第三方网盘同步：生态闭塞

4. 特色功能

间隔重复算法：这是SuperMemo的立身之本。其算法（如SM-2，也是Anki算法的原型）经过多年迭代，旨在科学地计算最优复习间隔，节省记忆时间。

渐进阅读：允许用户增量式地阅读文章，逐步将文章内容转化为结构化、易于记忆的知识点（问答卡片），解决记忆的质量问题。

复习队列：解决记忆的价值问题。可以给不同知识卡片设定优先级，确保在有限的学习时间内，总是先复习最重要、最高价值的内容。

AI（主要是移动端应用）：AI助手（解答学习疑问）等（付费）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：提供Windows桌面端、iOS和Android移动端应用以及网络浏览器版本，但是除了Windows版以外都是半残废'''

性能表现： ui及其复古

离线使用：支持

6. 缺点与不足

学习难度非常陡峭。移动端几乎残废，没有协作能力，生态闭塞。'''贵'''

获取方式：https://supermemo.store/

wiki百科<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Main_Page

安装教程<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Installing_SuperMemo_(in_a_minute)

===== obsidian =====
概述

Obsidian是一款以本地优先、Markdown为基础的双向链接笔记软件，主打知识网络构建和高度可定制性。它通过双向链接和图谱视图帮助用户建立非线性的知识体系，适合长期知识管理、学术研究、写作和项目管理。其核心优势在于'''数据完全本地存储（但是明文）'''、'''强大的社区插件生态'''和'''可深度定制的界面'''

整体体验类似wiki，属于知识管理软件

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。核心功能完全免费，部分高级功能（如官方同步、发布）需付费（订阅制）

价格：

* Sync（同步服务）：约 $10/月或 $96/年，提供端到端加密的多设备同步。
* Publish（发布服务）：约 $20/月或 $192/年，可将笔记发布为专业网站。

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：提供Markdown编辑器，支持实时预览、表格、任务列表、代码块、数学公式（LaTeX）等46。支持“所见即所得”编辑模式，支持内嵌PDF（就是在你的笔记里面直接嵌入一个PDF阅读器，你可以直接看）

组织方式：核心是双向链接 (<code>[[ ]]</code>) 和关系图谱（Graph View），自动生成反向链接和未链接提及，形成知识网络29。支持标签（<code>#tag</code>）和文件夹层级管理。

模板：支持模板，支持自动化，甚至可以嵌入AI

OCR能力：社区应该有（但是社区就是连接到github，所以存在语言和网络需求）

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：原生支持较弱，主要通过社区插件（如<code>PDF Highlights</code>、<code>Annotator</code>）实现PDF导入和标注，标注内容可链接回笔记。

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：基于本地文件系统（称为“库”Vault），所有笔记均为标准Markdown（<code>.md</code>）文件，可用任何文本编辑器打开。内置文件浏览器。可以通过外部代码（如Python）进行一些不依赖脚本的自动化。所有信息明文存储在本地，有一定的安全风险，相反十分开放。

文件管理方式：依赖系统文件管理器，迁移方便

3. 同步与云服务

官方云同步：提供付费的Obsidian Sync服务，支持端到端加密、版本历史和跨设备同步

第三方网盘同步：几乎支持任何云盘

同步可靠性：因情况而异，多端同步多数情况较差

4. 特色功能

社区插件市场提供近千款插件，涵盖日程管理、看板、间隔重复、AI辅助等，极大扩展功能，有能力你也可以写

支持css，可以定制外观

存在一个画布模式（canvas），可以自行放置笔记图片文件并进行链接，效果类似于那种探案电视剧里面的白板，界面看起来像渲染软件的shader界面

5. 性能与跨平台

'''平台支持：极其全面。提供Windows、macOS、Linux桌面端，以及iOS和Android移动端应用，但是没有原生的免费跨平台能力'''

性能表现：启动和基础操作流畅。但在打开非常大的库（数万笔记）或启用过多复杂插件时，可能会遇到性能压力，实测文件数量达到两万时，48gb内存，7950hx需要半个小时启动。所以不建议搞巨多文件，不适合渐进阅读，更适合做wiki式的笔记。

离线使用：原生所有功能本地实现，完全可以离线用。可以通过一些方式使用本地部署大模型，但是需要折腾。

6. 缺点与不足

几乎没有协作能力，学习曲线略陡峭，移动端效果不佳

获取方式：https://obsidian.md/

==== 免费 ====

===== onenote =====
概述

Microsoft OneNote 是微软公司开发的一款数字笔记本应用，采用自由格式的画布设计，支持多媒介内容混合排版。它深度集成于 Microsoft 365 生态系统，主打强大的信息收集、整理和跨设备同步能力，适合用于课堂笔记、会议记录、项目规划和知识库构建。（更像办公软件）

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。基础功能免费，高级功能需订阅 Microsoft 365。绝大多数功能都可以免费获取，付费主要是为365生态付费

价格：这个价格实际是onedrive的价格

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：支持富文本、手写、录音、录像、图片、表格、便签等多种媒介。其独特的自由画布设计允许在任何位置输入和放置内容，可以融入365生态。原则上支持手写笔，但是这个功能做的很差。

组织方式：采用“笔记本 - 分区 - 页面 - 子页面”的多层级结构，逻辑清晰，符合传统笔记本的使用习惯。（你只有三层的分类余地）如果不是本地存储的笔记本，实际上是onedrive上的一个文件夹，而且笔记是特有格式，转移不便。

OCR能力：原则上有，但是移动端功能残废

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：不是原生支持PDF，你理论上可以导入进来看，但是是单向的，而且非常难用

PDF编辑：不具备原生的PDF编辑（如合并、拆分）能力

2.3 文件管理

文件类型支持：可作为容器嵌入各种文件（如Excel表格、Word文档、Visio图表），双击即可在原应用中打开编辑，主要为365生态内容

文件管理方式：云端本地都行，一般用云端，本地起到备份作用。实际是一堆文件夹里面放着专有文件格式

3. 同步与云服务

官方云同步： onedrive

第三方网盘同步：不支持

同步可靠性：多端即时同步能力是这个笔记软件的核心强点，你可以在移动端进行编辑，几乎同时同步到其他端（但是貌似其他的专业办公软件也能做到），会存在冲突情况，这个时候需要自行选择版本了

4. 特色功能

存在单向链接，原则上有AI功能，中国大陆用不了。

深度Office集成：与Word, Excel, Outlook等应用无缝协作。例如，可将Outlook会议详情一键发送至OneNote。

协作功能：支持多人实时共同编辑同一页面，更改会高亮显示并记录作者信息。

“@me”功能：可以创建待办事项并在Microsoft To Do中同步管理。

强大的网络研究工具，可裁剪网页内容并自动附上源链接。内质一个搜索引擎（纯多余）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：拥有Windows（预装）、macOS、iOS、Android、Web网页版应用，并对Windows用户提供功能更完整的OneNote for Windows 10/11（现已合并）和OneNote (Desktop) 两个版本。（基本上要依赖windows端）'''

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线缺点不少，能用。

6. 缺点与不足

复杂文件同步经常冲突

非原生PDF支持： “打印至OneNote”的方式对于需要精确PDF标注和归档的用户来说不够专业。

自由画布的副作用：内容对齐困难，排版可能显得杂乱，强迫症用户体验不佳。

功能复杂且隐蔽：很多高级功能藏得很深，学习曲线相对陡峭。（但是依然是非常好上手的类型）

存储限制：免费用户的5GB OneDrive空间对于重度用户而言很快会被多媒体笔记占满。

获取方式：https://www.onenote.com/?omkt=zh-CN&public=1

==== 思源笔记 ====
概述

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：免费

价格：部分高级功能付费（主要是关于同步的）

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：特有文件，但是可以导出

组织方式：大纲

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持阅读，批注，链接

PDF编辑：没有PDF编辑能力

2.3 文件管理

文件类型支持：支持绝大多数文件

文件管理方式：内置管理器

3. 同步与云服务

官方云同步：是

第三方网盘同步：需要付费

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、web内容原格式剪裁，AI功能，间隔重复（fsrs），脑图，数据库，思维导图，甚至五线谱等

5. 性能与跨平台

'''平台支持：全端'''

性能表现：流畅度很高，对大量文件的适应度尚可

离线使用：可离线

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：https://b3log.org/siyuan/download.html
[[Category:无纸化学习]]

无纸化学习

2025-08-30T04:39:19Z

Magezeya：/* 免费 */

本篇文章记录无纸化学习的各个方面，主要是测评和方法等。编者阅历有限，希望其他的编者也能参与进来补充完整

== 电子资料获取方式 ==
[[查阅资料]]

== 笔记软件评测 ==
以下评测如果需要新增评测条目，可以按照以下格式进行

{{无纸化学习}}

以上的索引为对应具体的使用方法和经验的词条。

同时欢迎其他人对各种的笔记软件提供使用方法，教程等经验性得内容。但是希望可以单开一个个独立的词条并链接过来，避免这个词条过长
如果一个笔记软件的主要功能需要付费解锁，可以放在付费列，如果核心功能基本不受到任何影响，而且付费项在无关紧要的地方（比如云空间，或者增加的AI功能等这些不影响核心笔记功能使用的地方），为了方便后来者选择自己的笔记软件，归入免费
您可以将这个模板用于未来其他笔记软件的评测。<syntaxhighlight lang="text">
软件名称

概述

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux（使用粗体）

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：提供相关的下载链接，尽量不将较大的文件上传上来。
</syntaxhighlight>

==== 付费 ====

===== Notein一笔记 =====
概述

Notein一笔记是一款专注于PDF标注与处理的付费笔记应用。它采用买断制付费模式，核心优势在于强大的PDF阅读与批注体验，并内置了实用的文件管理与编辑功能。其定位更偏向于专业的PDF工具而非知识管理工具。

2. 价格与授权

授权模式：一次性买断制

价格：约50元人民币

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型： PDF，无边界笔记，笔记本，PPT，doc，excel，epub，caj，图片

组织方式：内置文件夹和标签，收藏功能

模板：支持一定的笔记本样式的模板

OCR能力：不支持

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持PDF文本手写批注，具有专门的阅读模式，支持多数安卓平台设备的触控笔快捷键（华为，荣耀，三星，小米，OPPO，vivo，联想）支持插入外链，支持插入图片，录音，文本等。可以创建图层（但是没有图层蒙版）

PDF编辑：支持合并、拆分、提取页面，改变页边栏，增加目录，书签等操作，支持PDF导出为多层PDF，单纯PDF。

2.3 文件管理

文件类型支持：支持PPT，doc，excel，epub，caj，图片等，展现方式与PDF类似，但是部分文件格式导入过程较为缓慢

文件管理方式：内置管理器，但是需要把自己阅读的文件先导入，不支持批量导入

3. 同步与云服务

官方云同步：没有官方云服务

第三方网盘同步： OneDrive，华为云

同步可靠性：有自动备份

没有多人协作能力

4. 特色功能

多文件对照阅读，支持单向内部文件链接，支持连接到url

5. 性能与跨平台

'''平台支持：安卓，鸿蒙'''

性能表现：本体启动速度快，但是个别格式文件启动慢，大文件导入慢

离线使用：可以

6. 缺点与不足

存储空间压力，导入机制对设备本地存储容量有较高要求。

知识网络没有可视化功能

没有AI功能

获取方式：https://notein.cn/

===== supermemo =====
概述

并非传统的笔记软件，但是和生物竞赛的应用环境非常相配的一个间隔复习软件。可以进行渐进阅读，增量学习，依赖supermome算法进行复习，据说比多邻国算法强3倍。但是使用本身相当硬核，付费较贵，而且主要对epu格式书籍的适配更好

2. 价格与授权

授权模式：买断制（对应版本）

价格： supermemo19Windows版售价为70美元（约合人民币450元）supermemo18Windows版售价32美元（约和人民币200元）。需要海外支付
[[文件:Supermemo18购买界面.png|缩略图|463x463像素|supermemo18的购买界面，生化瞩目]]

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：核心是制作问答对（卡片）。支持文本、图片、音频（如录制自己的发音对比）等多种格式。（类似于anki，但是算法，功能性都不一样）

组织方式：采用基于优先级的待办事项队列来管理每日的学习和复习任务

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：通过渐进阅读功能，可以将PDF文本导入并分解为摘录，然后逐步制作成记忆卡片

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：管理方式比较复杂，需要自行学习，然后这个管理本身是为记忆服务的。

文件管理方式：软件会根据算法，为每张卡片计算出了不同难度、不同复习次数下对应的最佳复习间隔。（SM-18，SM-19。anki算法是SM-2，这也是最常见的基于遗忘曲线的复习算法）

3. 同步与云服务

官方云同步：提供同步功能，支持在SuperMemo平台（在线和离线）同步课程

第三方网盘同步：生态闭塞

4. 特色功能

间隔重复算法：这是SuperMemo的立身之本。其算法（如SM-2，也是Anki算法的原型）经过多年迭代，旨在科学地计算最优复习间隔，节省记忆时间。

渐进阅读：允许用户增量式地阅读文章，逐步将文章内容转化为结构化、易于记忆的知识点（问答卡片），解决记忆的质量问题。

复习队列：解决记忆的价值问题。可以给不同知识卡片设定优先级，确保在有限的学习时间内，总是先复习最重要、最高价值的内容。

AI（主要是移动端应用）：AI助手（解答学习疑问）等（付费）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：提供Windows桌面端、iOS和Android移动端应用以及网络浏览器版本，但是除了Windows版以外都是半残废'''

性能表现： ui及其复古

离线使用：支持

6. 缺点与不足

学习难度非常陡峭。移动端几乎残废，没有协作能力，生态闭塞。'''贵'''

获取方式：https://supermemo.store/

wiki百科<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Main_Page

安装教程<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Installing_SuperMemo_(in_a_minute)

===== obsidian =====
概述

Obsidian是一款以本地优先、Markdown为基础的双向链接笔记软件，主打知识网络构建和高度可定制性。它通过双向链接和图谱视图帮助用户建立非线性的知识体系，适合长期知识管理、学术研究、写作和项目管理。其核心优势在于'''数据完全本地存储（但是明文）'''、'''强大的社区插件生态'''和'''可深度定制的界面'''

整体体验类似wiki，属于知识管理软件

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。核心功能完全免费，部分高级功能（如官方同步、发布）需付费（订阅制）

价格：

* Sync（同步服务）：约 $10/月或 $96/年，提供端到端加密的多设备同步。
* Publish（发布服务）：约 $20/月或 $192/年，可将笔记发布为专业网站。

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：提供Markdown编辑器，支持实时预览、表格、任务列表、代码块、数学公式（LaTeX）等46。支持“所见即所得”编辑模式，支持内嵌PDF（就是在你的笔记里面直接嵌入一个PDF阅读器，你可以直接看）

组织方式：核心是双向链接 (<code>[[ ]]</code>) 和关系图谱（Graph View），自动生成反向链接和未链接提及，形成知识网络29。支持标签（<code>#tag</code>）和文件夹层级管理。

模板：支持模板，支持自动化，甚至可以嵌入AI

OCR能力：社区应该有（但是社区就是连接到github，所以存在语言和网络需求）

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：原生支持较弱，主要通过社区插件（如<code>PDF Highlights</code>、<code>Annotator</code>）实现PDF导入和标注，标注内容可链接回笔记。

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：基于本地文件系统（称为“库”Vault），所有笔记均为标准Markdown（<code>.md</code>）文件，可用任何文本编辑器打开。内置文件浏览器。可以通过外部代码（如Python）进行一些不依赖脚本的自动化。所有信息明文存储在本地，有一定的安全风险，相反十分开放。

文件管理方式：依赖系统文件管理器，迁移方便

3. 同步与云服务

官方云同步：提供付费的Obsidian Sync服务，支持端到端加密、版本历史和跨设备同步

第三方网盘同步：几乎支持任何云盘

同步可靠性：因情况而异，多端同步多数情况较差

4. 特色功能

社区插件市场提供近千款插件，涵盖日程管理、看板、间隔重复、AI辅助等，极大扩展功能，有能力你也可以写

支持css，可以定制外观

存在一个画布模式（canvas），可以自行放置笔记图片文件并进行链接，效果类似于那种探案电视剧里面的白板，界面看起来像渲染软件的shader界面

5. 性能与跨平台

'''平台支持：极其全面。提供Windows、macOS、Linux桌面端，以及iOS和Android移动端应用，但是没有原生的免费跨平台能力'''

性能表现：启动和基础操作流畅。但在打开非常大的库（数万笔记）或启用过多复杂插件时，可能会遇到性能压力，实测文件数量达到两万时，48gb内存，7950hx需要半个小时启动。所以不建议搞巨多文件，不适合渐进阅读，更适合做wiki式的笔记。

离线使用：原生所有功能本地实现，完全可以离线用。可以通过一些方式使用本地部署大模型，但是需要折腾。

6. 缺点与不足

几乎没有协作能力，学习曲线略陡峭，移动端效果不佳

获取方式：https://obsidian.md/

==== 免费 ====

===== onenote =====
概述

Microsoft OneNote 是微软公司开发的一款数字笔记本应用，采用自由格式的画布设计，支持多媒介内容混合排版。它深度集成于 Microsoft 365 生态系统，主打强大的信息收集、整理和跨设备同步能力，适合用于课堂笔记、会议记录、项目规划和知识库构建。（更像办公软件）

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。基础功能免费，高级功能需订阅 Microsoft 365。绝大多数功能都可以免费获取，付费主要是为365生态付费

价格：这个价格实际是onedrive的价格

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：支持富文本、手写、录音、录像、图片、表格、便签等多种媒介。其独特的自由画布设计允许在任何位置输入和放置内容，可以融入365生态。原则上支持手写笔，但是这个功能做的很差。

组织方式：采用“笔记本 - 分区 - 页面 - 子页面”的多层级结构，逻辑清晰，符合传统笔记本的使用习惯。（你只有三层的分类余地）如果不是本地存储的笔记本，实际上是onedrive上的一个文件夹，而且笔记是特有格式，转移不便。

OCR能力：原则上有，但是移动端功能残废

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：不是原生支持PDF，你理论上可以导入进来看，但是是单向的，而且非常难用

PDF编辑：不具备原生的PDF编辑（如合并、拆分）能力

2.3 文件管理

文件类型支持：可作为容器嵌入各种文件（如Excel表格、Word文档、Visio图表），双击即可在原应用中打开编辑，主要为365生态内容

文件管理方式：云端本地都行，一般用云端，本地起到备份作用。实际是一堆文件夹里面放着专有文件格式

3. 同步与云服务

官方云同步： onedrive

第三方网盘同步：不支持

同步可靠性：多端即时同步能力是这个笔记软件的核心强点，你可以在移动端进行编辑，几乎同时同步到其他端（但是貌似其他的专业办公软件也能做到），会存在冲突情况，这个时候需要自行选择版本了

4. 特色功能

存在单向链接，原则上有AI功能，中国大陆用不了。

深度Office集成：与Word, Excel, Outlook等应用无缝协作。例如，可将Outlook会议详情一键发送至OneNote。

协作功能：支持多人实时共同编辑同一页面，更改会高亮显示并记录作者信息。

“@me”功能：可以创建待办事项并在Microsoft To Do中同步管理。

强大的网络研究工具，可裁剪网页内容并自动附上源链接。内质一个搜索引擎（纯多余）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：拥有Windows（预装）、macOS、iOS、Android、Web网页版应用，并对Windows用户提供功能更完整的OneNote for Windows 10/11（现已合并）和OneNote (Desktop) 两个版本。（基本上要依赖windows端）'''

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线缺点不少，能用。

6. 缺点与不足

复杂文件同步经常冲突

非原生PDF支持： “打印至OneNote”的方式对于需要精确PDF标注和归档的用户来说不够专业。

自由画布的副作用：内容对齐困难，排版可能显得杂乱，强迫症用户体验不佳。

功能复杂且隐蔽：很多高级功能藏得很深，学习曲线相对陡峭。（但是依然是非常好上手的类型）

存储限制：免费用户的5GB OneDrive空间对于重度用户而言很快会被多媒体笔记占满。

获取方式：https://www.onenote.com/?omkt=zh-CN&public=1

==== 思源笔记 ====
概述

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

'''平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux（使用粗体）'''

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：提供相关的下载链接，尽量不将较大的文件上传上来。
[[Category:无纸化学习]]

无纸化学习

2025-08-30T04:38:15Z

Magezeya：

用户讨论:Magezeya

2025-08-27T14:50:04Z

Magezeya：/* 一些关于我对生物竞赛的疑问 */ 新章节

老师好

== 一些关于我对生物竞赛的疑问 ==

为啥很少有人用anki等记忆卡片类的工具学习啊，命名好像生物竞赛生是世界上最适合用这个方式的群体

无纸化学习

2025-08-27T14:44:24Z

Magezeya：/* 笔记软件评测 */

本篇文章记录无纸化学习的各个方面，主要是测评和方法等。编者阅历有限，希望其他的编者也能参与进来补充完整

== 电子资料获取方式 ==
[[查阅资料]]

== 笔记软件评测 ==
以下评测如果需要新增评测条目，可以按照以下格式进行

{{无纸化学习}}

以上的索引为对应具体的使用方法和经验的词条。

同时欢迎其他人对各种的笔记软件提供使用方法，教程等经验性得内容。但是希望可以单开一个个独立的词条并链接过来，避免这个词条过长
如果一个笔记软件的主要功能需要付费解锁，可以放在付费列，如果核心功能基本不受到任何影响，而且付费项在无关紧要的地方（比如云空间，或者增加的AI功能等这些不影响核心笔记功能使用的地方），为了方便后来者选择自己的笔记软件，归入免费
您可以将这个模板用于未来其他笔记软件的评测。

软件名称

概述

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

'''平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux（使用粗体）'''

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

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==== 付费 ====

===== Notein一笔记 =====
概述

Notein一笔记是一款专注于PDF标注与处理的付费笔记应用。它采用买断制付费模式，核心优势在于强大的PDF阅读与批注体验，并内置了实用的文件管理与编辑功能。其定位更偏向于专业的PDF工具而非知识管理工具。

2. 价格与授权

授权模式：一次性买断制

价格：约50元人民币

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型： PDF，无边界笔记，笔记本，PPT，doc，excel，epub，caj，图片

组织方式：内置文件夹和标签，收藏功能

模板：支持一定的笔记本样式的模板

OCR能力：不支持

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持PDF文本手写批注，具有专门的阅读模式，支持多数安卓平台设备的触控笔快捷键（华为，荣耀，三星，小米，OPPO，vivo，联想）支持插入外链，支持插入图片，录音，文本等。可以创建图层（但是没有图层蒙版）

PDF编辑：支持合并、拆分、提取页面，改变页边栏，增加目录，书签等操作，支持PDF导出为多层PDF，单纯PDF。

2.3 文件管理

文件类型支持：支持PPT，doc，excel，epub，caj，图片等，展现方式与PDF类似，但是部分文件格式导入过程较为缓慢

文件管理方式：内置管理器，但是需要把自己阅读的文件先导入，不支持批量导入

3. 同步与云服务

官方云同步：没有官方云服务

第三方网盘同步： OneDrive，华为云

同步可靠性：有自动备份

没有多人协作能力

4. 特色功能

多文件对照阅读，支持单向内部文件链接，支持连接到url

5. 性能与跨平台

'''平台支持：安卓，鸿蒙'''

性能表现：本体启动速度快，但是个别格式文件启动慢，大文件导入慢

离线使用：可以

6. 缺点与不足

存储空间压力，导入机制对设备本地存储容量有较高要求。

知识网络没有可视化功能

没有AI功能

获取方式：https://notein.cn/

===== supermemo =====
概述

并非传统的笔记软件，但是和生物竞赛的应用环境非常相配的一个间隔复习软件。可以进行渐进阅读，增量学习，依赖supermome算法进行复习，据说比多邻国算法强3倍。但是使用本身相当硬核，付费较贵，而且主要对epu格式书籍的适配更好

2. 价格与授权

授权模式：买断制（对应版本）

价格： supermemo19Windows版售价为70美元（约合人民币450元）supermemo18Windows版售价32美元（约和人民币200元）。需要海外支付
[[文件:Supermemo18购买界面.png|缩略图|463x463像素|supermemo18的购买界面，生化瞩目]]

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：核心是制作问答对（卡片）。支持文本、图片、音频（如录制自己的发音对比）等多种格式。（类似于anki，但是算法，功能性都不一样）

组织方式：采用基于优先级的待办事项队列来管理每日的学习和复习任务

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：通过渐进阅读功能，可以将PDF文本导入并分解为摘录，然后逐步制作成记忆卡片

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：管理方式比较复杂，需要自行学习，然后这个管理本身是为记忆服务的。

文件管理方式：软件会根据算法，为每张卡片计算出了不同难度、不同复习次数下对应的最佳复习间隔。（SM-18，SM-19。anki算法是SM-2，这也是最常见的基于遗忘曲线的复习算法）

3. 同步与云服务

官方云同步：提供同步功能，支持在SuperMemo平台（在线和离线）同步课程

第三方网盘同步：生态闭塞

4. 特色功能

间隔重复算法：这是SuperMemo的立身之本。其算法（如SM-2，也是Anki算法的原型）经过多年迭代，旨在科学地计算最优复习间隔，节省记忆时间。

渐进阅读：允许用户增量式地阅读文章，逐步将文章内容转化为结构化、易于记忆的知识点（问答卡片），解决记忆的质量问题。

复习队列：解决记忆的价值问题。可以给不同知识卡片设定优先级，确保在有限的学习时间内，总是先复习最重要、最高价值的内容。

AI（主要是移动端应用）：AI助手（解答学习疑问）等（付费）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：提供Windows桌面端、iOS和Android移动端应用以及网络浏览器版本，但是除了Windows版以外都是半残废'''

性能表现： ui及其复古

离线使用：支持

6. 缺点与不足

学习难度非常陡峭。移动端几乎残废，没有协作能力，生态闭塞。'''贵'''

获取方式：https://supermemo.store/

wiki百科<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Main_Page

安装教程<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Installing_SuperMemo_(in_a_minute)

===== obsidian =====
概述

Obsidian是一款以本地优先、Markdown为基础的双向链接笔记软件，主打知识网络构建和高度可定制性。它通过双向链接和图谱视图帮助用户建立非线性的知识体系，适合长期知识管理、学术研究、写作和项目管理。其核心优势在于'''数据完全本地存储（但是明文）'''、'''强大的社区插件生态'''和'''可深度定制的界面'''

整体体验类似wiki，属于知识管理软件

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。核心功能完全免费，部分高级功能（如官方同步、发布）需付费（订阅制）

价格：

* Sync（同步服务）：约 $10/月或 $96/年，提供端到端加密的多设备同步。
* Publish（发布服务）：约 $20/月或 $192/年，可将笔记发布为专业网站。

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：提供Markdown编辑器，支持实时预览、表格、任务列表、代码块、数学公式（LaTeX）等46。支持“所见即所得”编辑模式，支持内嵌PDF（就是在你的笔记里面直接嵌入一个PDF阅读器，你可以直接看）

组织方式：核心是双向链接 (<code>[[ ]]</code>) 和关系图谱（Graph View），自动生成反向链接和未链接提及，形成知识网络29。支持标签（<code>#tag</code>）和文件夹层级管理。

模板：支持模板，支持自动化，甚至可以嵌入AI

OCR能力：社区应该有（但是社区就是连接到github，所以存在语言和网络需求）

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：原生支持较弱，主要通过社区插件（如<code>PDF Highlights</code>、<code>Annotator</code>）实现PDF导入和标注，标注内容可链接回笔记。

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：基于本地文件系统（称为“库”Vault），所有笔记均为标准Markdown（<code>.md</code>）文件，可用任何文本编辑器打开。内置文件浏览器。可以通过外部代码（如Python）进行一些不依赖脚本的自动化。所有信息明文存储在本地，有一定的安全风险，相反十分开放。

文件管理方式：依赖系统文件管理器，迁移方便

3. 同步与云服务

官方云同步：提供付费的Obsidian Sync服务，支持端到端加密、版本历史和跨设备同步

第三方网盘同步：几乎支持任何云盘

同步可靠性：因情况而异，多端同步多数情况较差

4. 特色功能

社区插件市场提供近千款插件，涵盖日程管理、看板、间隔重复、AI辅助等，极大扩展功能，有能力你也可以写

支持css，可以定制外观

存在一个画布模式（canvas），可以自行放置笔记图片文件并进行链接，效果类似于那种探案电视剧里面的白板，界面看起来像渲染软件的shader界面

5. 性能与跨平台

'''平台支持：极其全面。提供Windows、macOS、Linux桌面端，以及iOS和Android移动端应用，但是没有原生的免费跨平台能力'''

性能表现：启动和基础操作流畅。但在打开非常大的库（数万笔记）或启用过多复杂插件时，可能会遇到性能压力，实测文件数量达到两万时，48gb内存，7950hx需要半个小时启动。所以不建议搞巨多文件，不适合渐进阅读，更适合做wiki式的笔记。

离线使用：原生所有功能本地实现，完全可以离线用。可以通过一些方式使用本地部署大模型，但是需要折腾。

6. 缺点与不足

几乎没有协作能力，学习曲线略陡峭，移动端效果不佳

获取方式：https://obsidian.md/

==== 免费 ====

===== onenote =====
概述

Microsoft OneNote 是微软公司开发的一款数字笔记本应用，采用自由格式的画布设计，支持多媒介内容混合排版。它深度集成于 Microsoft 365 生态系统，主打强大的信息收集、整理和跨设备同步能力，适合用于课堂笔记、会议记录、项目规划和知识库构建。（更像办公软件）

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。基础功能免费，高级功能需订阅 Microsoft 365。绝大多数功能都可以免费获取，付费主要是为365生态付费

价格：这个价格实际是onedrive的价格

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：支持富文本、手写、录音、录像、图片、表格、便签等多种媒介。其独特的自由画布设计允许在任何位置输入和放置内容，可以融入365生态。原则上支持手写笔，但是这个功能做的很差。

组织方式：采用“笔记本 - 分区 - 页面 - 子页面”的多层级结构，逻辑清晰，符合传统笔记本的使用习惯。（你只有三层的分类余地）如果不是本地存储的笔记本，实际上是onedrive上的一个文件夹，而且笔记是特有格式，转移不便。

OCR能力：原则上有，但是移动端功能残废

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：不是原生支持PDF，你理论上可以导入进来看，但是是单向的，而且非常难用

PDF编辑：不具备原生的PDF编辑（如合并、拆分）能力

2.3 文件管理

文件类型支持：可作为容器嵌入各种文件（如Excel表格、Word文档、Visio图表），双击即可在原应用中打开编辑，主要为365生态内容

文件管理方式：云端本地都行，一般用云端，本地起到备份作用。实际是一堆文件夹里面放着专有文件格式

3. 同步与云服务

官方云同步： onedrive

第三方网盘同步：不支持

同步可靠性：多端即时同步能力是这个笔记软件的核心强点，你可以在移动端进行编辑，几乎同时同步到其他端（但是貌似其他的专业办公软件也能做到），会存在冲突情况，这个时候需要自行选择版本了

4. 特色功能

存在单向链接，原则上有AI功能，中国大陆用不了。

深度Office集成：与Word, Excel, Outlook等应用无缝协作。例如，可将Outlook会议详情一键发送至OneNote。

协作功能：支持多人实时共同编辑同一页面，更改会高亮显示并记录作者信息。

“@me”功能：可以创建待办事项并在Microsoft To Do中同步管理。

强大的网络研究工具，可裁剪网页内容并自动附上源链接。内质一个搜索引擎（纯多余）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：拥有Windows（预装）、macOS、iOS、Android、Web网页版应用，并对Windows用户提供功能更完整的OneNote for Windows 10/11（现已合并）和OneNote (Desktop) 两个版本。（基本上要依赖windows端）'''

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线缺点不少，能用。

6. 缺点与不足

复杂文件同步经常冲突

非原生PDF支持： “打印至OneNote”的方式对于需要精确PDF标注和归档的用户来说不够专业。

自由画布的副作用：内容对齐困难，排版可能显得杂乱，强迫症用户体验不佳。

功能复杂且隐蔽：很多高级功能藏得很深，学习曲线相对陡峭。（但是依然是非常好上手的类型）

存储限制：免费用户的5GB OneDrive空间对于重度用户而言很快会被多媒体笔记占满。

获取方式：https://www.onenote.com/?omkt=zh-CN&public=1

[[Category:无纸化学习]]

无纸化学习

2025-08-27T14:43:41Z

Magezeya：/* Notein一笔记 */

本篇文章记录无纸化学习的各个方面，主要是测评和方法等。编者阅历有限，希望其他的编者也能参与进来补充完整

== 电子资料获取方式 ==
[[查阅资料]]

== 笔记软件评测 ==
以下评测如果需要新增评测条目，可以按照以下格式进行

{{无纸化学习}}

同时欢迎其他人对各种的笔记软件提供使用方法，教程等经验性得内容。但是希望可以单开一个个独立的词条并链接过来，避免这个词条过长
如果一个笔记软件的主要功能需要付费解锁，可以放在付费列，如果核心功能基本不受到任何影响，而且付费项在无关紧要的地方（比如云空间，或者增加的AI功能等这些不影响核心笔记功能使用的地方），为了方便后来者选择自己的笔记软件，归入免费
您可以将这个模板用于未来其他笔记软件的评测。

软件名称

概述

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

'''平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux（使用粗体）'''

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：提供相关的下载链接，尽量不将较大的文件上传上来。

==== 付费 ====

===== Notein一笔记 =====
概述

Notein一笔记是一款专注于PDF标注与处理的付费笔记应用。它采用买断制付费模式，核心优势在于强大的PDF阅读与批注体验，并内置了实用的文件管理与编辑功能。其定位更偏向于专业的PDF工具而非知识管理工具。

2. 价格与授权

授权模式：一次性买断制

价格：约50元人民币

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型： PDF，无边界笔记，笔记本，PPT，doc，excel，epub，caj，图片

组织方式：内置文件夹和标签，收藏功能

模板：支持一定的笔记本样式的模板

OCR能力：不支持

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持PDF文本手写批注，具有专门的阅读模式，支持多数安卓平台设备的触控笔快捷键（华为，荣耀，三星，小米，OPPO，vivo，联想）支持插入外链，支持插入图片，录音，文本等。可以创建图层（但是没有图层蒙版）

PDF编辑：支持合并、拆分、提取页面，改变页边栏，增加目录，书签等操作，支持PDF导出为多层PDF，单纯PDF。

2.3 文件管理

文件类型支持：支持PPT，doc，excel，epub，caj，图片等，展现方式与PDF类似，但是部分文件格式导入过程较为缓慢

文件管理方式：内置管理器，但是需要把自己阅读的文件先导入，不支持批量导入

3. 同步与云服务

官方云同步：没有官方云服务

第三方网盘同步： OneDrive，华为云

同步可靠性：有自动备份

没有多人协作能力

4. 特色功能

多文件对照阅读，支持单向内部文件链接，支持连接到url

5. 性能与跨平台

'''平台支持：安卓，鸿蒙'''

性能表现：本体启动速度快，但是个别格式文件启动慢，大文件导入慢

离线使用：可以

6. 缺点与不足

存储空间压力，导入机制对设备本地存储容量有较高要求。

知识网络没有可视化功能

没有AI功能

获取方式：https://notein.cn/

===== supermemo =====
概述

并非传统的笔记软件，但是和生物竞赛的应用环境非常相配的一个间隔复习软件。可以进行渐进阅读，增量学习，依赖supermome算法进行复习，据说比多邻国算法强3倍。但是使用本身相当硬核，付费较贵，而且主要对epu格式书籍的适配更好

2. 价格与授权

授权模式：买断制（对应版本）

价格： supermemo19Windows版售价为70美元（约合人民币450元）supermemo18Windows版售价32美元（约和人民币200元）。需要海外支付
[[文件:Supermemo18购买界面.png|缩略图|463x463像素|supermemo18的购买界面，生化瞩目]]

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：核心是制作问答对（卡片）。支持文本、图片、音频（如录制自己的发音对比）等多种格式。（类似于anki，但是算法，功能性都不一样）

组织方式：采用基于优先级的待办事项队列来管理每日的学习和复习任务

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：通过渐进阅读功能，可以将PDF文本导入并分解为摘录，然后逐步制作成记忆卡片

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：管理方式比较复杂，需要自行学习，然后这个管理本身是为记忆服务的。

文件管理方式：软件会根据算法，为每张卡片计算出了不同难度、不同复习次数下对应的最佳复习间隔。（SM-18，SM-19。anki算法是SM-2，这也是最常见的基于遗忘曲线的复习算法）

3. 同步与云服务

官方云同步：提供同步功能，支持在SuperMemo平台（在线和离线）同步课程

第三方网盘同步：生态闭塞

4. 特色功能

间隔重复算法：这是SuperMemo的立身之本。其算法（如SM-2，也是Anki算法的原型）经过多年迭代，旨在科学地计算最优复习间隔，节省记忆时间。

渐进阅读：允许用户增量式地阅读文章，逐步将文章内容转化为结构化、易于记忆的知识点（问答卡片），解决记忆的质量问题。

复习队列：解决记忆的价值问题。可以给不同知识卡片设定优先级，确保在有限的学习时间内，总是先复习最重要、最高价值的内容。

AI（主要是移动端应用）：AI助手（解答学习疑问）等（付费）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：提供Windows桌面端、iOS和Android移动端应用以及网络浏览器版本，但是除了Windows版以外都是半残废'''

性能表现： ui及其复古

离线使用：支持

6. 缺点与不足

学习难度非常陡峭。移动端几乎残废，没有协作能力，生态闭塞。'''贵'''

获取方式：https://supermemo.store/

wiki百科<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Main_Page

安装教程<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Installing_SuperMemo_(in_a_minute)

===== obsidian =====
概述

Obsidian是一款以本地优先、Markdown为基础的双向链接笔记软件，主打知识网络构建和高度可定制性。它通过双向链接和图谱视图帮助用户建立非线性的知识体系，适合长期知识管理、学术研究、写作和项目管理。其核心优势在于'''数据完全本地存储（但是明文）'''、'''强大的社区插件生态'''和'''可深度定制的界面'''

整体体验类似wiki，属于知识管理软件

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。核心功能完全免费，部分高级功能（如官方同步、发布）需付费（订阅制）

价格：

* Sync（同步服务）：约 $10/月或 $96/年，提供端到端加密的多设备同步。
* Publish（发布服务）：约 $20/月或 $192/年，可将笔记发布为专业网站。

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：提供Markdown编辑器，支持实时预览、表格、任务列表、代码块、数学公式（LaTeX）等46。支持“所见即所得”编辑模式，支持内嵌PDF（就是在你的笔记里面直接嵌入一个PDF阅读器，你可以直接看）

组织方式：核心是双向链接 (<code>[[ ]]</code>) 和关系图谱（Graph View），自动生成反向链接和未链接提及，形成知识网络29。支持标签（<code>#tag</code>）和文件夹层级管理。

模板：支持模板，支持自动化，甚至可以嵌入AI

OCR能力：社区应该有（但是社区就是连接到github，所以存在语言和网络需求）

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：原生支持较弱，主要通过社区插件（如<code>PDF Highlights</code>、<code>Annotator</code>）实现PDF导入和标注，标注内容可链接回笔记。

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：基于本地文件系统（称为“库”Vault），所有笔记均为标准Markdown（<code>.md</code>）文件，可用任何文本编辑器打开。内置文件浏览器。可以通过外部代码（如Python）进行一些不依赖脚本的自动化。所有信息明文存储在本地，有一定的安全风险，相反十分开放。

文件管理方式：依赖系统文件管理器，迁移方便

3. 同步与云服务

官方云同步：提供付费的Obsidian Sync服务，支持端到端加密、版本历史和跨设备同步

第三方网盘同步：几乎支持任何云盘

同步可靠性：因情况而异，多端同步多数情况较差

4. 特色功能

社区插件市场提供近千款插件，涵盖日程管理、看板、间隔重复、AI辅助等，极大扩展功能，有能力你也可以写

支持css，可以定制外观

存在一个画布模式（canvas），可以自行放置笔记图片文件并进行链接，效果类似于那种探案电视剧里面的白板，界面看起来像渲染软件的shader界面

5. 性能与跨平台

'''平台支持：极其全面。提供Windows、macOS、Linux桌面端，以及iOS和Android移动端应用，但是没有原生的免费跨平台能力'''

性能表现：启动和基础操作流畅。但在打开非常大的库（数万笔记）或启用过多复杂插件时，可能会遇到性能压力，实测文件数量达到两万时，48gb内存，7950hx需要半个小时启动。所以不建议搞巨多文件，不适合渐进阅读，更适合做wiki式的笔记。

离线使用：原生所有功能本地实现，完全可以离线用。可以通过一些方式使用本地部署大模型，但是需要折腾。

6. 缺点与不足

几乎没有协作能力，学习曲线略陡峭，移动端效果不佳

获取方式：https://obsidian.md/

==== 免费 ====

===== onenote =====
概述

Microsoft OneNote 是微软公司开发的一款数字笔记本应用，采用自由格式的画布设计，支持多媒介内容混合排版。它深度集成于 Microsoft 365 生态系统，主打强大的信息收集、整理和跨设备同步能力，适合用于课堂笔记、会议记录、项目规划和知识库构建。（更像办公软件）

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。基础功能免费，高级功能需订阅 Microsoft 365。绝大多数功能都可以免费获取，付费主要是为365生态付费

价格：这个价格实际是onedrive的价格

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：支持富文本、手写、录音、录像、图片、表格、便签等多种媒介。其独特的自由画布设计允许在任何位置输入和放置内容，可以融入365生态。原则上支持手写笔，但是这个功能做的很差。

组织方式：采用“笔记本 - 分区 - 页面 - 子页面”的多层级结构，逻辑清晰，符合传统笔记本的使用习惯。（你只有三层的分类余地）如果不是本地存储的笔记本，实际上是onedrive上的一个文件夹，而且笔记是特有格式，转移不便。

OCR能力：原则上有，但是移动端功能残废

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：不是原生支持PDF，你理论上可以导入进来看，但是是单向的，而且非常难用

PDF编辑：不具备原生的PDF编辑（如合并、拆分）能力

2.3 文件管理

文件类型支持：可作为容器嵌入各种文件（如Excel表格、Word文档、Visio图表），双击即可在原应用中打开编辑，主要为365生态内容

文件管理方式：云端本地都行，一般用云端，本地起到备份作用。实际是一堆文件夹里面放着专有文件格式

3. 同步与云服务

官方云同步： onedrive

第三方网盘同步：不支持

同步可靠性：多端即时同步能力是这个笔记软件的核心强点，你可以在移动端进行编辑，几乎同时同步到其他端（但是貌似其他的专业办公软件也能做到），会存在冲突情况，这个时候需要自行选择版本了

4. 特色功能

存在单向链接，原则上有AI功能，中国大陆用不了。

深度Office集成：与Word, Excel, Outlook等应用无缝协作。例如，可将Outlook会议详情一键发送至OneNote。

协作功能：支持多人实时共同编辑同一页面，更改会高亮显示并记录作者信息。

“@me”功能：可以创建待办事项并在Microsoft To Do中同步管理。

强大的网络研究工具，可裁剪网页内容并自动附上源链接。内质一个搜索引擎（纯多余）

5. 性能与跨平台

'''平台支持：拥有Windows（预装）、macOS、iOS、Android、Web网页版应用，并对Windows用户提供功能更完整的OneNote for Windows 10/11（现已合并）和OneNote (Desktop) 两个版本。（基本上要依赖windows端）'''

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线缺点不少，能用。

6. 缺点与不足

复杂文件同步经常冲突

非原生PDF支持： “打印至OneNote”的方式对于需要精确PDF标注和归档的用户来说不够专业。

自由画布的副作用：内容对齐困难，排版可能显得杂乱，强迫症用户体验不佳。

功能复杂且隐蔽：很多高级功能藏得很深，学习曲线相对陡峭。（但是依然是非常好上手的类型）

存储限制：免费用户的5GB OneDrive空间对于重度用户而言很快会被多媒体笔记占满。

获取方式：https://www.onenote.com/?omkt=zh-CN&public=1

[[Category:无纸化学习]]

无纸化学习

2025-08-27T14:42:08Z

Magezeya：/* 笔记软件评测 */

本篇文章记录无纸化学习的各个方面，主要是测评和方法等。编者阅历有限，希望其他的编者也能参与进来补充完整

== 电子资料获取方式 ==
[[查阅资料]]

== 笔记软件评测 ==
以下评测如果需要新增评测条目，可以按照以下格式进行

{{无纸化学习}}

同时欢迎其他人对各种的笔记软件提供使用方法，教程等经验性得内容。但是希望可以单开一个个独立的词条并链接过来，避免这个词条过长
如果一个笔记软件的主要功能需要付费解锁，可以放在付费列，如果核心功能基本不受到任何影响，而且付费项在无关紧要的地方（比如云空间，或者增加的AI功能等这些不影响核心笔记功能使用的地方），为了方便后来者选择自己的笔记软件，归入免费
您可以将这个模板用于未来其他笔记软件的评测。

软件名称

概述（末尾加上支持的平台，并且使用加粗体）

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：提供相关的下载链接，尽量不将较大的文件上传上来。

==== 付费 ====

===== Notein一笔记 =====
概述

Notein一笔记是一款专注于PDF标注与处理的付费笔记应用。它采用买断制付费模式，核心优势在于强大的PDF阅读与批注体验，并内置了实用的文件管理与编辑功能。其定位更偏向于专业的PDF工具而非知识管理工具。

2. 价格与授权

授权模式：一次性买断制

价格：约50元人民币

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型： PDF，无边界笔记，笔记本，PPT，doc，excel，epub，caj，图片

组织方式：内置文件夹和标签，收藏功能

模板：支持一定的笔记本样式的模板

OCR能力：不支持

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持PDF文本手写批注，具有专门的阅读模式，支持多数安卓平台设备的触控笔快捷键（华为，荣耀，三星，小米，OPPO，vivo，联想）支持插入外链，支持插入图片，录音，文本等。可以创建图层（但是没有图层蒙版）

PDF编辑：支持合并、拆分、提取页面，改变页边栏，增加目录，书签等操作，支持PDF导出为多层PDF，单纯PDF。

2.3 文件管理

文件类型支持：支持PPT，doc，excel，epub，caj，图片等，展现方式与PDF类似，但是部分文件格式导入过程较为缓慢

文件管理方式：内置管理器，但是需要把自己阅读的文件先导入，不支持批量导入

3. 同步与云服务

官方云同步：没有官方云服务

第三方网盘同步： OneDrive，华为云

同步可靠性：有自动备份

没有多人协作能力

4. 特色功能

多文件对照阅读，支持单向内部文件链接，支持连接到url

5. 性能与跨平台

平台支持：安卓，鸿蒙

性能表现：本体启动速度快，但是个别格式文件启动慢，大文件导入慢

离线使用：可以

6. 缺点与不足

存储空间压力，导入机制对设备本地存储容量有较高要求。

知识网络没有可视化功能

没有AI功能

获取方式：https://notein.cn/

===== supermemo =====
概述

并非传统的笔记软件，但是和生物竞赛的应用环境非常相配的一个间隔复习软件。可以进行渐进阅读，增量学习，依赖supermome算法进行复习，据说比多邻国算法强3倍。但是使用本身相当硬核，付费较贵，而且主要对epu格式书籍的适配更好

2. 价格与授权

授权模式：买断制（对应版本）

价格： supermemo19Windows版售价为70美元（约合人民币450元）supermemo18Windows版售价32美元（约和人民币200元）。需要海外支付
[[文件:Supermemo18购买界面.png|缩略图|463x463像素|supermemo18的购买界面，生化瞩目]]

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：核心是制作问答对（卡片）。支持文本、图片、音频（如录制自己的发音对比）等多种格式。（类似于anki，但是算法，功能性都不一样）

组织方式：采用基于优先级的待办事项队列来管理每日的学习和复习任务

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：通过渐进阅读功能，可以将PDF文本导入并分解为摘录，然后逐步制作成记忆卡片

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：管理方式比较复杂，需要自行学习，然后这个管理本身是为记忆服务的。

文件管理方式：软件会根据算法，为每张卡片计算出了不同难度、不同复习次数下对应的最佳复习间隔。（SM-18，SM-19。anki算法是SM-2，这也是最常见的基于遗忘曲线的复习算法）

3. 同步与云服务

官方云同步：提供同步功能，支持在SuperMemo平台（在线和离线）同步课程

第三方网盘同步：生态闭塞

4. 特色功能

间隔重复算法：这是SuperMemo的立身之本。其算法（如SM-2，也是Anki算法的原型）经过多年迭代，旨在科学地计算最优复习间隔，节省记忆时间。

渐进阅读：允许用户增量式地阅读文章，逐步将文章内容转化为结构化、易于记忆的知识点（问答卡片），解决记忆的质量问题。

复习队列：解决记忆的价值问题。可以给不同知识卡片设定优先级，确保在有限的学习时间内，总是先复习最重要、最高价值的内容。

AI（主要是移动端应用）：AI助手（解答学习疑问）等（付费）

5. 性能与跨平台

平台支持：提供Windows桌面端、iOS和Android移动端应用以及网络浏览器版本，但是除了Windows版以外都是半残废

性能表现： ui及其复古

离线使用：支持

6. 缺点与不足

学习难度非常陡峭。移动端几乎残废，没有协作能力，生态闭塞。'''贵'''

获取方式：https://supermemo.store/

wiki百科<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Main_Page

安装教程<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Installing_SuperMemo_(in_a_minute)

===== obsidian =====
概述

Obsidian是一款以本地优先、Markdown为基础的双向链接笔记软件，主打知识网络构建和高度可定制性。它通过双向链接和图谱视图帮助用户建立非线性的知识体系，适合长期知识管理、学术研究、写作和项目管理。其核心优势在于'''数据完全本地存储（但是明文）'''、'''强大的社区插件生态'''和'''可深度定制的界面'''

整体体验类似wiki，属于知识管理软件

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。核心功能完全免费，部分高级功能（如官方同步、发布）需付费（订阅制）

价格：

* Sync（同步服务）：约 $10/月或 $96/年，提供端到端加密的多设备同步。
* Publish（发布服务）：约 $20/月或 $192/年，可将笔记发布为专业网站。

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：提供Markdown编辑器，支持实时预览、表格、任务列表、代码块、数学公式（LaTeX）等46。支持“所见即所得”编辑模式，支持内嵌PDF（就是在你的笔记里面直接嵌入一个PDF阅读器，你可以直接看）

组织方式：核心是双向链接 (<code>[[ ]]</code>) 和关系图谱（Graph View），自动生成反向链接和未链接提及，形成知识网络29。支持标签（<code>#tag</code>）和文件夹层级管理。

模板：支持模板，支持自动化，甚至可以嵌入AI

OCR能力：社区应该有（但是社区就是连接到github，所以存在语言和网络需求）

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：原生支持较弱，主要通过社区插件（如<code>PDF Highlights</code>、<code>Annotator</code>）实现PDF导入和标注，标注内容可链接回笔记。

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：基于本地文件系统（称为“库”Vault），所有笔记均为标准Markdown（<code>.md</code>）文件，可用任何文本编辑器打开。内置文件浏览器。可以通过外部代码（如Python）进行一些不依赖脚本的自动化。所有信息明文存储在本地，有一定的安全风险，相反十分开放。

文件管理方式：依赖系统文件管理器，迁移方便

3. 同步与云服务

官方云同步：提供付费的Obsidian Sync服务，支持端到端加密、版本历史和跨设备同步

第三方网盘同步：几乎支持任何云盘

同步可靠性：因情况而异，多端同步多数情况较差

4. 特色功能

社区插件市场提供近千款插件，涵盖日程管理、看板、间隔重复、AI辅助等，极大扩展功能，有能力你也可以写

支持css，可以定制外观

存在一个画布模式（canvas），可以自行放置笔记图片文件并进行链接，效果类似于那种探案电视剧里面的白板，界面看起来像渲染软件的shader界面

5. 性能与跨平台

平台支持：极其全面。提供Windows、macOS、Linux桌面端，以及iOS和Android移动端应用，但是没有原生的免费跨平台能力

性能表现：启动和基础操作流畅。但在打开非常大的库（数万笔记）或启用过多复杂插件时，可能会遇到性能压力，实测文件数量达到两万时，48gb内存，7950hx需要半个小时启动。所以不建议搞巨多文件，不适合渐进阅读，更适合做wiki式的笔记。

离线使用：原生所有功能本地实现，完全可以离线用。可以通过一些方式使用本地部署大模型，但是需要折腾。

6. 缺点与不足

几乎没有协作能力，学习曲线略陡峭，移动端效果不佳

获取方式：https://obsidian.md/

==== 免费 ====

===== onenote =====
概述

Microsoft OneNote 是微软公司开发的一款数字笔记本应用，采用自由格式的画布设计，支持多媒介内容混合排版。它深度集成于 Microsoft 365 生态系统，主打强大的信息收集、整理和跨设备同步能力，适合用于课堂笔记、会议记录、项目规划和知识库构建。（更像办公软件）

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。基础功能免费，高级功能需订阅 Microsoft 365。绝大多数功能都可以免费获取，付费主要是为365生态付费

价格：这个价格实际是onedrive的价格

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：支持富文本、手写、录音、录像、图片、表格、便签等多种媒介。其独特的自由画布设计允许在任何位置输入和放置内容，可以融入365生态。原则上支持手写笔，但是这个功能做的很差。

组织方式：采用“笔记本 - 分区 - 页面 - 子页面”的多层级结构，逻辑清晰，符合传统笔记本的使用习惯。（你只有三层的分类余地）如果不是本地存储的笔记本，实际上是onedrive上的一个文件夹，而且笔记是特有格式，转移不便。

OCR能力：原则上有，但是移动端功能残废

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：不是原生支持PDF，你理论上可以导入进来看，但是是单向的，而且非常难用

PDF编辑：不具备原生的PDF编辑（如合并、拆分）能力

2.3 文件管理

文件类型支持：可作为容器嵌入各种文件（如Excel表格、Word文档、Visio图表），双击即可在原应用中打开编辑，主要为365生态内容

文件管理方式：云端本地都行，一般用云端，本地起到备份作用。实际是一堆文件夹里面放着专有文件格式

3. 同步与云服务

官方云同步： onedrive

第三方网盘同步：不支持

同步可靠性：多端即时同步能力是这个笔记软件的核心强点，你可以在移动端进行编辑，几乎同时同步到其他端（但是貌似其他的专业办公软件也能做到），会存在冲突情况，这个时候需要自行选择版本了

4. 特色功能

存在单向链接，原则上有AI功能，中国大陆用不了。

深度Office集成：与Word, Excel, Outlook等应用无缝协作。例如，可将Outlook会议详情一键发送至OneNote。

协作功能：支持多人实时共同编辑同一页面，更改会高亮显示并记录作者信息。

“@me”功能：可以创建待办事项并在Microsoft To Do中同步管理。

强大的网络研究工具，可裁剪网页内容并自动附上源链接。内质一个搜索引擎（纯多余）

5. 性能与跨平台

平台支持：拥有Windows（预装）、macOS、iOS、Android、Web网页版应用，并对Windows用户提供功能更完整的OneNote for Windows 10/11（现已合并）和OneNote (Desktop) 两个版本。（基本上要依赖windows端）

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线缺点不少，能用。

6. 缺点与不足

复杂文件同步经常冲突

非原生PDF支持： “打印至OneNote”的方式对于需要精确PDF标注和归档的用户来说不够专业。

自由画布的副作用：内容对齐困难，排版可能显得杂乱，强迫症用户体验不佳。

功能复杂且隐蔽：很多高级功能藏得很深，学习曲线相对陡峭。（但是依然是非常好上手的类型）

存储限制：免费用户的5GB OneDrive空间对于重度用户而言很快会被多媒体笔记占满。

获取方式：https://www.onenote.com/?omkt=zh-CN&public=1

[[Category:无纸化学习]]

无纸化学习

2025-08-27T14:41:50Z

Magezeya：

本篇文章记录无纸化学习的各个方面，主要是测评和方法等。编者阅历有限，希望其他的编者也能参与进来补充完整

== 电子资料获取方式 ==
[[查阅资料]]

== 笔记软件评测 ==
以下评测如果需要新增评测条目，可以按照以下格式进行

{{无纸化学习}}

同时欢迎其他人对各种的笔记软件提供使用方法，教程等经验性得内容。但是希望可以单开一个个独立的词条并链接过来，避免这个词条过长
如果一个笔记软件的主要功能需要付费解锁，可以放在付费列，如果核心功能基本不受到任何影响，而且付费项在无关紧要的地方（比如云空间，或者增加的AI功能等这些不影响核心笔记功能使用的地方），为了方便后来者选择自己的笔记软件，归入免费
您可以将这个模板用于未来其他笔记软件的评测。

软件名称（三级子标题）

概述（末尾加上支持的平台，并且使用加粗体）

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：提供相关的下载链接，尽量不将较大的文件上传上来。

==== 付费 ====

===== Notein一笔记 =====
概述

Notein一笔记是一款专注于PDF标注与处理的付费笔记应用。它采用买断制付费模式，核心优势在于强大的PDF阅读与批注体验，并内置了实用的文件管理与编辑功能。其定位更偏向于专业的PDF工具而非知识管理工具。

2. 价格与授权

授权模式：一次性买断制

价格：约50元人民币

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型： PDF，无边界笔记，笔记本，PPT，doc，excel，epub，caj，图片

组织方式：内置文件夹和标签，收藏功能

模板：支持一定的笔记本样式的模板

OCR能力：不支持

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持PDF文本手写批注，具有专门的阅读模式，支持多数安卓平台设备的触控笔快捷键（华为，荣耀，三星，小米，OPPO，vivo，联想）支持插入外链，支持插入图片，录音，文本等。可以创建图层（但是没有图层蒙版）

PDF编辑：支持合并、拆分、提取页面，改变页边栏，增加目录，书签等操作，支持PDF导出为多层PDF，单纯PDF。

2.3 文件管理

文件类型支持：支持PPT，doc，excel，epub，caj，图片等，展现方式与PDF类似，但是部分文件格式导入过程较为缓慢

文件管理方式：内置管理器，但是需要把自己阅读的文件先导入，不支持批量导入

3. 同步与云服务

官方云同步：没有官方云服务

第三方网盘同步： OneDrive，华为云

同步可靠性：有自动备份

没有多人协作能力

4. 特色功能

多文件对照阅读，支持单向内部文件链接，支持连接到url

5. 性能与跨平台

平台支持：安卓，鸿蒙

性能表现：本体启动速度快，但是个别格式文件启动慢，大文件导入慢

离线使用：可以

6. 缺点与不足

存储空间压力，导入机制对设备本地存储容量有较高要求。

知识网络没有可视化功能

没有AI功能

获取方式：https://notein.cn/

===== supermemo =====
概述

并非传统的笔记软件，但是和生物竞赛的应用环境非常相配的一个间隔复习软件。可以进行渐进阅读，增量学习，依赖supermome算法进行复习，据说比多邻国算法强3倍。但是使用本身相当硬核，付费较贵，而且主要对epu格式书籍的适配更好

2. 价格与授权

授权模式：买断制（对应版本）

价格： supermemo19Windows版售价为70美元（约合人民币450元）supermemo18Windows版售价32美元（约和人民币200元）。需要海外支付
[[文件:Supermemo18购买界面.png|缩略图|463x463像素|supermemo18的购买界面，生化瞩目]]

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：核心是制作问答对（卡片）。支持文本、图片、音频（如录制自己的发音对比）等多种格式。（类似于anki，但是算法，功能性都不一样）

组织方式：采用基于优先级的待办事项队列来管理每日的学习和复习任务

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：通过渐进阅读功能，可以将PDF文本导入并分解为摘录，然后逐步制作成记忆卡片

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：管理方式比较复杂，需要自行学习，然后这个管理本身是为记忆服务的。

文件管理方式：软件会根据算法，为每张卡片计算出了不同难度、不同复习次数下对应的最佳复习间隔。（SM-18，SM-19。anki算法是SM-2，这也是最常见的基于遗忘曲线的复习算法）

3. 同步与云服务

官方云同步：提供同步功能，支持在SuperMemo平台（在线和离线）同步课程

第三方网盘同步：生态闭塞

4. 特色功能

间隔重复算法：这是SuperMemo的立身之本。其算法（如SM-2，也是Anki算法的原型）经过多年迭代，旨在科学地计算最优复习间隔，节省记忆时间。

渐进阅读：允许用户增量式地阅读文章，逐步将文章内容转化为结构化、易于记忆的知识点（问答卡片），解决记忆的质量问题。

复习队列：解决记忆的价值问题。可以给不同知识卡片设定优先级，确保在有限的学习时间内，总是先复习最重要、最高价值的内容。

AI（主要是移动端应用）：AI助手（解答学习疑问）等（付费）

5. 性能与跨平台

平台支持：提供Windows桌面端、iOS和Android移动端应用以及网络浏览器版本，但是除了Windows版以外都是半残废

性能表现： ui及其复古

离线使用：支持

6. 缺点与不足

学习难度非常陡峭。移动端几乎残废，没有协作能力，生态闭塞。'''贵'''

获取方式：https://supermemo.store/

wiki百科<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Main_Page

安装教程<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Installing_SuperMemo_(in_a_minute)

===== obsidian =====
概述

Obsidian是一款以本地优先、Markdown为基础的双向链接笔记软件，主打知识网络构建和高度可定制性。它通过双向链接和图谱视图帮助用户建立非线性的知识体系，适合长期知识管理、学术研究、写作和项目管理。其核心优势在于'''数据完全本地存储（但是明文）'''、'''强大的社区插件生态'''和'''可深度定制的界面'''

整体体验类似wiki，属于知识管理软件

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。核心功能完全免费，部分高级功能（如官方同步、发布）需付费（订阅制）

价格：

* Sync（同步服务）：约 $10/月或 $96/年，提供端到端加密的多设备同步。
* Publish（发布服务）：约 $20/月或 $192/年，可将笔记发布为专业网站。

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：提供Markdown编辑器，支持实时预览、表格、任务列表、代码块、数学公式（LaTeX）等46。支持“所见即所得”编辑模式，支持内嵌PDF（就是在你的笔记里面直接嵌入一个PDF阅读器，你可以直接看）

组织方式：核心是双向链接 (<code>[[ ]]</code>) 和关系图谱（Graph View），自动生成反向链接和未链接提及，形成知识网络29。支持标签（<code>#tag</code>）和文件夹层级管理。

模板：支持模板，支持自动化，甚至可以嵌入AI

OCR能力：社区应该有（但是社区就是连接到github，所以存在语言和网络需求）

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：原生支持较弱，主要通过社区插件（如<code>PDF Highlights</code>、<code>Annotator</code>）实现PDF导入和标注，标注内容可链接回笔记。

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：基于本地文件系统（称为“库”Vault），所有笔记均为标准Markdown（<code>.md</code>）文件，可用任何文本编辑器打开。内置文件浏览器。可以通过外部代码（如Python）进行一些不依赖脚本的自动化。所有信息明文存储在本地，有一定的安全风险，相反十分开放。

文件管理方式：依赖系统文件管理器，迁移方便

3. 同步与云服务

官方云同步：提供付费的Obsidian Sync服务，支持端到端加密、版本历史和跨设备同步

第三方网盘同步：几乎支持任何云盘

同步可靠性：因情况而异，多端同步多数情况较差

4. 特色功能

社区插件市场提供近千款插件，涵盖日程管理、看板、间隔重复、AI辅助等，极大扩展功能，有能力你也可以写

支持css，可以定制外观

存在一个画布模式（canvas），可以自行放置笔记图片文件并进行链接，效果类似于那种探案电视剧里面的白板，界面看起来像渲染软件的shader界面

5. 性能与跨平台

平台支持：极其全面。提供Windows、macOS、Linux桌面端，以及iOS和Android移动端应用，但是没有原生的免费跨平台能力

性能表现：启动和基础操作流畅。但在打开非常大的库（数万笔记）或启用过多复杂插件时，可能会遇到性能压力，实测文件数量达到两万时，48gb内存，7950hx需要半个小时启动。所以不建议搞巨多文件，不适合渐进阅读，更适合做wiki式的笔记。

离线使用：原生所有功能本地实现，完全可以离线用。可以通过一些方式使用本地部署大模型，但是需要折腾。

6. 缺点与不足

几乎没有协作能力，学习曲线略陡峭，移动端效果不佳

获取方式：https://obsidian.md/

==== 免费 ====

===== onenote =====
概述

Microsoft OneNote 是微软公司开发的一款数字笔记本应用，采用自由格式的画布设计，支持多媒介内容混合排版。它深度集成于 Microsoft 365 生态系统，主打强大的信息收集、整理和跨设备同步能力，适合用于课堂笔记、会议记录、项目规划和知识库构建。（更像办公软件）

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。基础功能免费，高级功能需订阅 Microsoft 365。绝大多数功能都可以免费获取，付费主要是为365生态付费

价格：这个价格实际是onedrive的价格

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：支持富文本、手写、录音、录像、图片、表格、便签等多种媒介。其独特的自由画布设计允许在任何位置输入和放置内容，可以融入365生态。原则上支持手写笔，但是这个功能做的很差。

组织方式：采用“笔记本 - 分区 - 页面 - 子页面”的多层级结构，逻辑清晰，符合传统笔记本的使用习惯。（你只有三层的分类余地）如果不是本地存储的笔记本，实际上是onedrive上的一个文件夹，而且笔记是特有格式，转移不便。

OCR能力：原则上有，但是移动端功能残废

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：不是原生支持PDF，你理论上可以导入进来看，但是是单向的，而且非常难用

PDF编辑：不具备原生的PDF编辑（如合并、拆分）能力

2.3 文件管理

文件类型支持：可作为容器嵌入各种文件（如Excel表格、Word文档、Visio图表），双击即可在原应用中打开编辑，主要为365生态内容

文件管理方式：云端本地都行，一般用云端，本地起到备份作用。实际是一堆文件夹里面放着专有文件格式

3. 同步与云服务

官方云同步： onedrive

第三方网盘同步：不支持

同步可靠性：多端即时同步能力是这个笔记软件的核心强点，你可以在移动端进行编辑，几乎同时同步到其他端（但是貌似其他的专业办公软件也能做到），会存在冲突情况，这个时候需要自行选择版本了

4. 特色功能

存在单向链接，原则上有AI功能，中国大陆用不了。

深度Office集成：与Word, Excel, Outlook等应用无缝协作。例如，可将Outlook会议详情一键发送至OneNote。

协作功能：支持多人实时共同编辑同一页面，更改会高亮显示并记录作者信息。

“@me”功能：可以创建待办事项并在Microsoft To Do中同步管理。

强大的网络研究工具，可裁剪网页内容并自动附上源链接。内质一个搜索引擎（纯多余）

5. 性能与跨平台

平台支持：拥有Windows（预装）、macOS、iOS、Android、Web网页版应用，并对Windows用户提供功能更完整的OneNote for Windows 10/11（现已合并）和OneNote (Desktop) 两个版本。（基本上要依赖windows端）

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线缺点不少，能用。

6. 缺点与不足

复杂文件同步经常冲突

非原生PDF支持： “打印至OneNote”的方式对于需要精确PDF标注和归档的用户来说不够专业。

自由画布的副作用：内容对齐困难，排版可能显得杂乱，强迫症用户体验不佳。

功能复杂且隐蔽：很多高级功能藏得很深，学习曲线相对陡峭。（但是依然是非常好上手的类型）

存储限制：免费用户的5GB OneDrive空间对于重度用户而言很快会被多媒体笔记占满。

获取方式：https://www.onenote.com/?omkt=zh-CN&public=1

[[Category:无纸化学习]]

无纸化学习

2025-08-27T14:40:36Z

Magezeya：

本篇文章记录无纸化学习的各个方面，主要是测评和方法等。编者阅历有限，希望其他的编者也能参与进来补充完整

== 电子资料获取方式 ==
[[查阅资料]]

== 笔记软件评测 ==
以下评测如果需要新增评测条目，可以按照以下格式进行

{{无纸化学习}}

同时欢迎其他人对各种的笔记软件提供使用方法，教程等经验性得内容。但是希望可以单开一个个独立的词条并链接过来，避免这个词条过长
如果一个笔记软件的主要功能需要付费解锁，可以放在付费列，如果核心功能基本不受到任何影响，而且付费项在无关紧要的地方（比如云空间，或者增加的AI功能等这些不影响核心笔记功能使用的地方），为了方便后来者选择自己的笔记软件，归入免费
您可以将这个模板用于未来其他笔记软件的评测。

软件名称（三级子标题）

概述（末尾加上支持的平台，并且使用加粗体）

在此处填写软件的简要介绍

2. 价格与授权

授权模式：例如：免费、freemium、订阅制、买断制、开源等

价格：填写具体价格或套餐详情

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：例如：纯文本、Markdown、富文本、白板、手写等

组织方式：例如：文件夹、标签、双链、块、笔记本等

模板：支持模板？支持程度如何？

OCR能力：是否支持图片或手写文字识别？

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持程度如何？批注工具是否丰富？

PDF编辑：是否支持合并、拆分、提取页面等高级操作？

2.3 文件管理

文件类型支持：除PDF外，还支持哪些格式？如Word, Excel, 图片等

文件管理方式：内置管理器还是依赖系统文件管理器？

3. 同步与云服务

官方云同步：是否有自己的云服务？

第三方网盘同步：支持哪些第三方云盘？如WebDAV, Google Drive, Dropbox, OneDrive等

同步可靠性：同步是否稳定？有无冲突解决方案？

4. 特色功能

例如：双向链接、全局搜索、Zettelkasten卡片盒法支持、多设备同时编辑、协作功能、AI功能等

5. 性能与跨平台

平台支持：例如：Android, iOS, Windows, macOS, Web网页版, Linux

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线功能是否完整？

6. 缺点与不足

列出软件目前存在的主要缺点、局限性或潜在风险。

获取方式：提供相关的下载链接，尽量不将较大的文件上传上来。

==== 付费 ====

===== Notein一笔记 =====
概述

Notein一笔记是一款专注于PDF标注与处理的付费笔记应用。它采用买断制付费模式，核心优势在于强大的PDF阅读与批注体验，并内置了实用的文件管理与编辑功能。其定位更偏向于专业的PDF工具而非知识管理工具。

2. 价格与授权

授权模式：一次性买断制

价格：约50元人民币

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型： PDF，无边界笔记，笔记本，PPT，doc，excel，epub，caj，图片

组织方式：内置文件夹和标签，收藏功能

模板：支持一定的笔记本样式的模板

OCR能力：不支持

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：支持PDF文本手写批注，具有专门的阅读模式，支持多数安卓平台设备的触控笔快捷键（华为，荣耀，三星，小米，OPPO，vivo，联想）支持插入外链，支持插入图片，录音，文本等。可以创建图层（但是没有图层蒙版）

PDF编辑：支持合并、拆分、提取页面，改变页边栏，增加目录，书签等操作，支持PDF导出为多层PDF，单纯PDF。

2.3 文件管理

文件类型支持：支持PPT，doc，excel，epub，caj，图片等，展现方式与PDF类似，但是部分文件格式导入过程较为缓慢

文件管理方式：内置管理器，但是需要把自己阅读的文件先导入，不支持批量导入

3. 同步与云服务

官方云同步：没有官方云服务

第三方网盘同步： OneDrive，华为云

同步可靠性：有自动备份

没有多人协作能力

4. 特色功能

多文件对照阅读，支持单向内部文件链接，支持连接到url

5. 性能与跨平台

平台支持：安卓，鸿蒙

性能表现：本体启动速度快，但是个别格式文件启动慢，大文件导入慢

离线使用：可以

6. 缺点与不足

存储空间压力，导入机制对设备本地存储容量有较高要求。

知识网络没有可视化功能

没有AI功能

获取方式：https://notein.cn/

==== 免费 ====

===== onenote =====
概述

Microsoft OneNote 是微软公司开发的一款数字笔记本应用，采用自由格式的画布设计，支持多媒介内容混合排版。它深度集成于 Microsoft 365 生态系统，主打强大的信息收集、整理和跨设备同步能力，适合用于课堂笔记、会议记录、项目规划和知识库构建。（更像办公软件）

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。基础功能免费，高级功能需订阅 Microsoft 365。绝大多数功能都可以免费获取，付费主要是为365生态付费

价格：这个价格实际是onedrive的价格

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：支持富文本、手写、录音、录像、图片、表格、便签等多种媒介。其独特的自由画布设计允许在任何位置输入和放置内容，可以融入365生态。原则上支持手写笔，但是这个功能做的很差。

组织方式：采用“笔记本 - 分区 - 页面 - 子页面”的多层级结构，逻辑清晰，符合传统笔记本的使用习惯。（你只有三层的分类余地）如果不是本地存储的笔记本，实际上是onedrive上的一个文件夹，而且笔记是特有格式，转移不便。

OCR能力：原则上有，但是移动端功能残废

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：不是原生支持PDF，你理论上可以导入进来看，但是是单向的，而且非常难用

PDF编辑：不具备原生的PDF编辑（如合并、拆分）能力

2.3 文件管理

文件类型支持：可作为容器嵌入各种文件（如Excel表格、Word文档、Visio图表），双击即可在原应用中打开编辑，主要为365生态内容

文件管理方式：云端本地都行，一般用云端，本地起到备份作用。实际是一堆文件夹里面放着专有文件格式

3. 同步与云服务

官方云同步： onedrive

第三方网盘同步：不支持

同步可靠性：多端即时同步能力是这个笔记软件的核心强点，你可以在移动端进行编辑，几乎同时同步到其他端（但是貌似其他的专业办公软件也能做到），会存在冲突情况，这个时候需要自行选择版本了

4. 特色功能

存在单向链接，原则上有AI功能，中国大陆用不了。

深度Office集成：与Word, Excel, Outlook等应用无缝协作。例如，可将Outlook会议详情一键发送至OneNote。

协作功能：支持多人实时共同编辑同一页面，更改会高亮显示并记录作者信息。

“@me”功能：可以创建待办事项并在Microsoft To Do中同步管理。

强大的网络研究工具，可裁剪网页内容并自动附上源链接。内质一个搜索引擎（纯多余）

5. 性能与跨平台

平台支持：拥有Windows（预装）、macOS、iOS、Android、Web网页版应用，并对Windows用户提供功能更完整的OneNote for Windows 10/11（现已合并）和OneNote (Desktop) 两个版本。（基本上要依赖windows端）

性能表现：启动速度、打开大文件速度、流畅度如何？

离线使用：离线缺点不少，能用。

6. 缺点与不足

复杂文件同步经常冲突

非原生PDF支持： “打印至OneNote”的方式对于需要精确PDF标注和归档的用户来说不够专业。

自由画布的副作用：内容对齐困难，排版可能显得杂乱，强迫症用户体验不佳。

功能复杂且隐蔽：很多高级功能藏得很深，学习曲线相对陡峭。（但是依然是非常好上手的类型）

存储限制：免费用户的5GB OneDrive空间对于重度用户而言很快会被多媒体笔记占满。

获取方式：https://www.onenote.com/?omkt=zh-CN&public=1

===== obsidian =====
见Windows，移动端一言难尽

=== iOS ===

==== 付费 ====

==== 免费 ====

=== Mac ===

==== 付费 ====

==== 免费 ====

===== OneNote =====
见安卓

===== obsidian =====
见Windows

=== Windows ===

==== 付费 ====

===== supermemo =====
概述

并非传统的笔记软件，但是和生物竞赛的应用环境非常相配的一个间隔复习软件。可以进行渐进阅读，增量学习，依赖supermome算法进行复习，据说比多邻国算法强3倍。但是使用本身相当硬核，付费较贵，而且主要对epu格式书籍的适配更好

2. 价格与授权

授权模式：买断制（对应版本）

价格： supermemo19Windows版售价为70美元（约合人民币450元）supermemo18Windows版售价32美元（约和人民币200元）。需要海外支付
[[文件:Supermemo18购买界面.png|缩略图|463x463像素|supermemo18的购买界面，生化瞩目]]

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：核心是制作问答对（卡片）。支持文本、图片、音频（如录制自己的发音对比）等多种格式。（类似于anki，但是算法，功能性都不一样）

组织方式：采用基于优先级的待办事项队列来管理每日的学习和复习任务

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：通过渐进阅读功能，可以将PDF文本导入并分解为摘录，然后逐步制作成记忆卡片

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：管理方式比较复杂，需要自行学习，然后这个管理本身是为记忆服务的。

文件管理方式：软件会根据算法，为每张卡片计算出了不同难度、不同复习次数下对应的最佳复习间隔。（SM-18，SM-19。anki算法是SM-2，这也是最常见的基于遗忘曲线的复习算法）

3. 同步与云服务

官方云同步：提供同步功能，支持在SuperMemo平台（在线和离线）同步课程

第三方网盘同步：生态闭塞

4. 特色功能

间隔重复算法：这是SuperMemo的立身之本。其算法（如SM-2，也是Anki算法的原型）经过多年迭代，旨在科学地计算最优复习间隔，节省记忆时间。

渐进阅读：允许用户增量式地阅读文章，逐步将文章内容转化为结构化、易于记忆的知识点（问答卡片），解决记忆的质量问题。

复习队列：解决记忆的价值问题。可以给不同知识卡片设定优先级，确保在有限的学习时间内，总是先复习最重要、最高价值的内容。

AI（主要是移动端应用）：AI助手（解答学习疑问）等（付费）

5. 性能与跨平台

平台支持：提供Windows桌面端、iOS和Android移动端应用以及网络浏览器版本，但是除了Windows版以外都是半残废

性能表现： ui及其复古

离线使用：支持

6. 缺点与不足

学习难度非常陡峭。移动端几乎残废，没有协作能力，生态闭塞。'''贵'''

获取方式：https://supermemo.store/

wiki百科<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Main_Page

安装教程<nowiki/>https://help.supermemo.org/wiki/Installing_SuperMemo_(in_a_minute)

==== 免费 ====

===== OneNote =====
见安卓

===== obsidian =====
概述

Obsidian是一款以本地优先、Markdown为基础的双向链接笔记软件，主打知识网络构建和高度可定制性。它通过双向链接和图谱视图帮助用户建立非线性的知识体系，适合长期知识管理、学术研究、写作和项目管理。其核心优势在于'''数据完全本地存储（但是明文）'''、'''强大的社区插件生态'''和'''可深度定制的界面'''

整体体验类似wiki，属于知识管理软件

2. 价格与授权

授权模式：免费增值模式 (Freemium)。核心功能完全免费，部分高级功能（如官方同步、发布）需付费（订阅制）

价格：

* Sync（同步服务）：约 $10/月或 $96/年，提供端到端加密的多设备同步。
* Publish（发布服务）：约 $20/月或 $192/年，可将笔记发布为专业网站。

2. 核心功能

2.1 笔记功能

笔记类型：提供Markdown编辑器，支持实时预览、表格、任务列表、代码块、数学公式（LaTeX）等46。支持“所见即所得”编辑模式，支持内嵌PDF（就是在你的笔记里面直接嵌入一个PDF阅读器，你可以直接看）

组织方式：核心是双向链接 (<code>[[ ]]</code>) 和关系图谱（Graph View），自动生成反向链接和未链接提及，形成知识网络29。支持标签（<code>#tag</code>）和文件夹层级管理。

模板：支持模板，支持自动化，甚至可以嵌入AI

OCR能力：社区应该有（但是社区就是连接到github，所以存在语言和网络需求）

（如有其他自行添加）

2.2 PDF支持

PDF阅读与批注：原生支持较弱，主要通过社区插件（如<code>PDF Highlights</code>、<code>Annotator</code>）实现PDF导入和标注，标注内容可链接回笔记。

PDF编辑：不支持合并、拆分、提取页面等高级操作

2.3 文件管理

文件类型支持：基于本地文件系统（称为“库”Vault），所有笔记均为标准Markdown（<code>.md</code>）文件，可用任何文本编辑器打开。内置文件浏览器。可以通过外部代码（如Python）进行一些不依赖脚本的自动化。所有信息明文存储在本地，有一定的安全风险，相反十分开放。

文件管理方式：依赖系统文件管理器，迁移方便

3. 同步与云服务

官方云同步：提供付费的Obsidian Sync服务，支持端到端加密、版本历史和跨设备同步

第三方网盘同步：几乎支持任何云盘

同步可靠性：因情况而异，多端同步多数情况较差

4. 特色功能

社区插件市场提供近千款插件，涵盖日程管理、看板、间隔重复、AI辅助等，极大扩展功能，有能力你也可以写

支持css，可以定制外观

存在一个画布模式（canvas），可以自行放置笔记图片文件并进行链接，效果类似于那种探案电视剧里面的白板，界面看起来像渲染软件的shader界面

5. 性能与跨平台

平台支持：极其全面。提供Windows、macOS、Linux桌面端，以及iOS和Android移动端应用，但是没有原生的免费跨平台能力

性能表现：启动和基础操作流畅。但在打开非常大的库（数万笔记）或启用过多复杂插件时，可能会遇到性能压力，实测文件数量达到两万时，48gb内存，7950hx需要半个小时启动。所以不建议搞巨多文件，不适合渐进阅读，更适合做wiki式的笔记。

离线使用：原生所有功能本地实现，完全可以离线用。可以通过一些方式使用本地部署大模型，但是需要折腾。

6. 缺点与不足

几乎没有协作能力，学习曲线略陡峭，移动端效果不佳

获取方式：https://obsidian.md/

=== Linux ===

===== obsidian =====
见Windows

[[Category:无纸化学习]]

第十九章线虫动物：线虫动物门和线形动物门

2025-08-27T12:06:23Z

Magezeya：撤销Sofia（讨论）的修订版本11781

八个蜕皮动物门分为三个亚群：有颚动物（动吻曳鳃铠甲），泛节肢动物（有爪缓步节支），线虫动物（线虫和线形）。

两门的成虫都有特殊的角质层，绝大多数不含几丁质（几丁质只见于线虫的咽部角质层和线形的幼虫角质层），两个门都没有原肾管（protonephridia），没有环肌。表皮有表皮索，而且背腹两条表皮索似乎是线虫+线性的祖先特征。表皮索中有纵向神经索。这两个门的雄性都有泄殖腔，但海洋线虫Nectonema 属除外，它们的肠道后部缩小，因此无法形成泄殖腔。然而，雌性线虫的生殖口与肛门分开，通常位于身体中部，远离肛门。另一个相应的特征是精子细胞中缺乏纤毛，尽管这两个分类群的精子都经过了高度改良，结构上彼此不可比拟，而且缺乏纤毛在陆生动物中很常见。与其他蜕皮动物类群一样，线虫缺乏可动的表皮纤毛。

线虫在发育过程中会蜕皮三到四次；成虫前期与成虫大体相似，因此被称为juveniles（尽管“larva”一词也经常使用，尤其是寄生物种）。线形只观察到一次蜕皮，即寄生生活结束时。线性有真正的幼虫，它是微观的（< 1 毫米），形态与成虫完全不同。

== 线虫动物门 ==

=== 线虫门的分类 ===
Chitwood 和 Chitwood 在 1933 年基于解剖学的蛔虫分类法一直盛行，将线虫动物门分为无尾感器纲和尾感器纲；后分别改称腺肾纲和胞管肾纲（侧尾腺纲）。后来发现，尾感器纲较为进化，而无尾感器纲可能是并系。

分子研究区分了三个纲： Chromadorea、、Enoplia、 Dorylaimia。

'''CHROMADOREA：有孔状/裂隙状化感器，从唇上的孔或裂隙，以至于唇后方的复杂的螺旋；角质层有环，有时饰有突起和刚毛；有或没有phasmids，通常位于后部。食管通常分为球'''

'''状，有 3 至 5 个食管腺；排泄系统呈腺状或管状，雌性有 1 或 2 个卵巢。'''

'''ENOPLIA：有口袋状化感器，不是螺旋状，通常位于唇后，角质层光滑或有细条纹。'''

'''线虫的体型呈现'''

'''体壁，支撑和运动'''

'''与其他蜕皮动物一样，身体被一层发育良好的角质层覆盖，角质层由表皮分泌，而这表皮便缺乏可动的纤毛。角质层主要由lipids and proteins associated with mucopolysaccharides组成。胶原蛋白，一种结构蛋白，是主要成分(>80%).除了某些物种的咽部，线虫角质层缺乏几丁质。此外，卵壳中也有几丁质。角质层是半透性的，除了作为纵向肌肉收缩的拮抗剂外，还起到分泌排泄或物质吸收的作用。'''

'''新的蜕皮后角质层通常具有表皮褶皱（皱襞），新的角质层在其上变得高度卷曲，使得蠕虫在蜕皮后能够以手风琴状的方式增加长度。'''

'''表皮随着类群的变化而变化，从单细胞到合胞体。通常加厚形成背、腹、侧索。背腹索包含不成对的纵神经，侧索包含排泄管和神经元。表皮内侧一层纵肌，是斜纹肌。'''

{{:Invertebrates Fourth Edition 译文版}}

{{学科分类}}

[[Category:动物学]]

讨论:类人流星闪耀时

2025-08-27T12:03:55Z

Magezeya：已将重定向目标从讨论:流星闪耀时更改为讨论:流星下的许愿墙

#重定向 [[讨论:流星下的许愿墙]]

类人流星闪耀时

2025-08-27T12:03:21Z

Magezeya：已将重定向目标从流星闪耀时更改为流星下的许愿墙

#重定向 [[流星下的许愿墙]]

Bio index

2025-08-27T11:52:03Z

Magezeya：/* 非正式生物竞赛内容 */

距离2026年联赛还有{{Countdown|2026-5-10|text=-天}}

== 问题页面 ==

=== · '''[[提出你的问题]] ''' ===

=== '''· [[幻想乡问题精选]] ''' ===

=== '''• [[愿程二群Q&A整理]]''（未完成）''''' ===

=== '''· 网站使用说明：[[Osm使用手册]]''（欢迎提问，随时可能补充）''''' ===
==任务==

=== 编辑意向的任务 ===
* [[S]]
* [[无纸化学习]]（需要进行长期补充，希望看见的可以进来看看，补充）
* [[植物命名法]]（未完成）
* [[距佬|花距的物种分布和结构来源]]（''未完成''）
* [[生理学毒素和特异性阻断剂]]（''未完成''）
* [[无脊椎动物比较]](''未完成'')
* [[无脊椎动物系统比较]]''（未完成）''
* [[心电图及各种疾病时的变型]]''（未完成）''
* [[被子植物各科介绍]]''（未完成）''

*[[两栖动物的皮肤及其衍生物]]''(未完成）''
*[[2023诺贝尔生理学或医学奖简介]]''(未完成）''
*[[生物信息数据库及工具简介整理]]''（未完成）''
*[[报告基因整理]]''（未完成）''
*[[糖酵解]]''（未完成）''
*[[细胞死亡方式整理]]''（未完成）''
*[[重要的同源器官]]''（未完成）''
*[[RNA的生物合成]] ''(未完成)''
*[[金属酶]] ''（未完成）''
*[[关于Histidine]] ''（未完成）''
*[[组织学与胚胎学]]''（未完成）''
*[[常见序列整理]]（未完成）
* [[类人群星闪耀时——古人类们]]''（基本完成)''
* [[核酸酶整理]]''（未完成）''
* [[模式生物相关知识]]''（未完成）''
* [[关于锥虫二三事]]''（未完成）''
* [[前列腺素]]''（未完成）''
* [[各种脂肪酸的俗称及对应命名总结]]''（未完成）''
* [[常见受体阻断与激动剂]]''（未完成）''
* [[昆虫口器类型总结]]''（接近完成）''
*[[植物的同源器官及变态演化]]''（未完成）''
*[[中文重名的生物学定义]]''(未完成）''
*[[诸子百家-进化论的形成]]''（未完成）''
*[[昆虫激素整理]]''（未完成）''
*[[生态学小汇总（2）]]''（正在加班补充中）''
*[[胎座表格|胎座表格''（未完成）'']]
*[[生理学计算汇总]]''（现有问题：无法引入公式）''
*[[人名疾病整理]]''（待编辑，欢迎大家补充）''
*[[生物统计漫谈]]''（未完成）''
*[[果实]] （未完成）

==现有条目==

*[[特殊:孤立页面|特殊:孤立页面（没有被双向链接的条目）]]

=== 永远<s>填坑</s>更新的页面 ===

* [[教材错误与矛盾]]''（未完成）''
* [[动物中首次出现的结构]]''（未完成，希望大家共同来填～）''
* [[绝对化表述：所有&一切&任何都]]''（未完成）''
* [[常见动物生理学抑制剂整理]] ''(未完成)''
* [[生物缩写]]''（未完成）''
* [[文献阅读分享]]（''怎么没人编辑😢''）文献读的有A佬这么多的还是太少了。
* [[查阅资料|查阅资料的网站]] （未完成）

=== 外文教材翻译 ===
* [[Invertebrates Fourth Edition 译文版]]
* [[Invertebrates（Brusca）Fourth Edition 重制版]]
* [[Vertebrates:Comparative Anatomy,Function,Evolution]]
* [[An Introduction to Behavioural Ecology]]
* [[BERNE & LEVY 生理学第八版]]
* [[Guyton&Hall 生理学第十四版]]
* [[免疫系统工作原理（第七版）]]
* [[Molecular Biology of the Cell]]
* [[Molecular Population Genetics]]
* [[Plant systematics|Plant Systematics]]
* [[Plant Physiology and Development, Seventh Edition (Lincoln Taiz）]]
* [[Taiz的WEB TOPIC]]
* [[Anoxygenic Phototropic Bacteria]]
* [[Animal eyes]]
* [[Esau's Plant Anatomy]]
* [[POPULATION GENETICS 第二版]]
* [[蚯蚓的形态学|蚯蚓的形态学（《Biology and Ecology of Earthworms》）]]

=== 生物学综合 ===

==== 公告栏 ====
*[[OSM生物刊]]

==== 生物学基础 ====
*[[生物之最]]

*[[生物口诀学]]
*[[常见数值]]
*[[十分钟读完基础物理化学]]
*[[模式生物的种名]]
*[[Strange but True]]
*[[中国外来入侵物种名单]]

* [[生物网站]]
* [[生物学英文名词词根词缀整理]]

==== 题目 ====
*[[全国中学生生物学联赛试题|全国中学生生物学联赛试题及答案（2000-2024）]]
*[[共同出题（旨在收集平时散出的题，你要是喜欢也可以泡在这里出题）]]

==== 非正式生物竞赛内容 ====
*[[生竞梗百科是什么梗|生竞梗百科]]
*[[生竞巨佬闪耀时]]
*[[笑话数则]]
*[[西洋笑传之阉鸡、骟马、歌唱巨星]]
*[[全F主义]]
*[[【非正式】deepseek浅谈生竞判断题填涂策略期望得分]]
*[[生竞·警示录]]
*[[流星下的许愿墙]]
*[[那些你最想做的事]]
*[[联赛题预测]]
*[[联赛分数与排名对应表]]
*[[如何评判大改革后的第一次联考-论2025年联赛]]
*[[生竞回忆墙]]
*[[金厕纸杯试卷大赛]]
*[[吐槽2025年联赛]]
*[[无题]]
*[[无纸化学习]]

==== New Ideas ====

* [[混沌学摘录]]
* [[瓜的小论]]
* [[苟书纠错与存疑]]

=== 第一部分：生物化学、分子生物学、细胞生物学、生物技术 ===

==== 生物化学 ====
*[[氨基酸性质整理]]
*[[磷酸戊糖途径和卡尔文循环之间的联系|磷酸戊糖途径和卡尔文循环的联系]]
*[[生化代谢产能分析]]
*[[生化过程抑制剂整理]]
*[[脂质代谢]]
*[[酶]]
*[[酶动力学作图]]
*[[颜色反应]]
*[[C/D/E-DNA]]
*[[TCA回补反应]]
*[[生物化学中的"20"与"7"|生物化学中的"20"、"7"与“12”]]
*[[Sanger测序]]
*[[维生素与辅酶]]
*[[血红蛋白与Hb相关疾病]]
*[[元素追踪]]
*[[兼职蛋白]]
*[[从PPi学生化|从ppi学生化]]
*[[泛素相关知识]]
*[[糖]]
*[[TCA的C去向]]
*[[所以我们这么辛苦生产NTP是为什么]]

==== 分子生物学 ====
*[[DNA聚合酶]]
*[[调控RNA]]
*[[DNA解链酶]]
*[[RNA的生物合成]]
*[[复制叉反转]]
*[[拓扑异构酶]]
*[[核酸酶整理]]

==== 细胞生物学 ====
*[[癌]]
*[[细胞染色带型整理]]
*[[糖基化区分]]
*[[细胞同步化方法]]
*[[mTOR的性质]]
*[[细胞因子和细胞因子受体|细胞因子]]
*[[G蛋白偶联受体及其信号转导|信号转导I：G蛋白偶联受体]]
*[[酶联受体及其信号转导|信号转导II：酶联受体]]
*[[其他受体及其信号转导|信号转导III：其他受体]]（未完成）
*[[内膜系统运输]]
*[[细胞间连接]]
*[[核受体]]
*[[红细胞的膜骨架]]
*[[溶酶体疾病和过氧化物酶体疾病]]
*[[Hippo信号通路]]
*[[14-3-3蛋白]]
*[[各细胞组分标志酶]](未完成)
*[[凋亡的特征和分子标记]]
*[[减数分裂驱动]]
*[[第四种细胞骨架]]
*[[有关核孔运输的迷思]]
*[[脂质的膜内/膜间转运]]
*[[内质网的细胞生物学]]
*[[关于各种通道/受体]]
*[[阿尔兹海默症]]

==== 生物技术 ====
*[[各种工具酶]]
*[[生物学实验技术手册v1.0]]
*[[生化分子细胞技术列表]]
*[[蛋白质含量测定]]
*[[CRISPR-Cas系统及相关技术]]
*[[离心相关总结]]
*[[快速反应技术]]
*[[western blot条带结果分析整理]]
*[[电泳染色方法]]''（未完成）''

=== 第二部分：植物学、植物生理学、微生物学 ===

==== 植物学 ====
*[[APG IV]]
*[[植物命名法]]
*[[被子植物各科介绍]]
*[[藻类分类整理]]
*[[藻类生活史总结]]
*[[裸子植物]]
*[[苔藓植物]]
*[[花]]
*[[维管植物的结构]]
*[[蔬菜水果的食用部分总结]]
*[[自交不亲和]]
*[[无融合生殖]]
*[[好玩但不考的植物学知识]]
*[[柿树科]]
*[[植物学表格知识]]
*[[种子]]
*[[果实]]
*[[胎座表格]]
*[[苔藓总结]]
*[[距佬|花距的物种分布和结构来源]]
*[[植物演化]]''（未完成）''
*[[图注缩写对照]]

==== 植物生理学 ====
*[[植物生长物质整理]]
*[[植物激素一表览]]
*[[植物矿质元素整理]]
*[[植物抗逆生理整理]]
*[[植物的矿质生理学]]
*[[植物的水生理学]]
*[[植物细胞水势整理]]
*[[植物常见氧化酶总结]]
*[[环境因素对植物发育的影响]]
*[[植物激素演化]]
*[[红光受体]]
*[[蓝光受体]]
*[[C4途径]]
*[[各种特殊的光合作用总结]]
*[[叶黄素循环]]

==== 微生物学 ====
*[[常见抑制剂整理|常见抗生素抑制剂整理]]
*[[与人有关的病毒]]
*[[病毒分类整理]]
*[[病毒的结构]]
*[[低等真核生物]]
*[[衣原体]]
*[[细菌染色法]]
*[[各种染料和染色的总结]]
*[[培养基总结]]
*[[转染菌种特性]]
*[[细菌vs.古菌vs.真核]]
*[[细菌常见贮藏物整理|细菌常见包含体整理]]
*[[污水处理]]
*[[细菌的营养类型]]
*[[酵母的小菌落]]

=== 第三部分：动物学、生理学、生态学、动物行为学 ===

==== 动物学 ====
*[[原生动物门]]''（已基本完成，欢迎大家来补充）''
*[[寄生动物总结]]
*[[总鳍鱼整理]]
*[[论证于脊椎动物到底是怎么个进化路线]]
*[[脊椎动物的中枢神经]]
*[[动物学人名结构整理]]
*[https://life.scnu.edu.cn/biology/jingpin/dwx/course_learn/chapter_20/chapter_2/learn/default.htm 动物地理区系划分]
*[[肺鱼特征整理]]
*[[辅助呼吸器官]]
*[[鸟的趾整理]]
*[[鸟类分目比较]]
*[[无脊椎动物比较]]
*[[脊椎动物的心脏]]
*[[昆虫的外部解剖]]
*[[昆虫的变态整理]]
*[[昆虫特征分类]]
*[[昆虫的标本制作]]''（基本完成）''
*[[脊椎动物的皮肤]]
*[[脊椎动物的骨骼系统]]
*[[脊椎动物的循环系统]]
*[[脊椎动物的呼吸系统]]
*[[脊椎动物的中枢神经]]
*[[丢失的五脏六腑]]
*[[蛇|蛇的重要考点]]
*[[脑神经整理|人脑神经整理]]
*[[百背不记的始祖鸟]]
*[[卵裂]]
*[[昆虫的复眼]]
*[[最非凡的心脏——潘氏孔相关释疑]]
*[[羊膜卵/胚胎概述]]
*[[脊椎动物的牙齿类型]]
*[[脊比笔记：循环系统]]
*[[动物的各种“式”]]''（望补充完善！）''

==== 生理学 ====
*[[器官的神经调控]]
*[[内分泌整理]]
*[[脊椎动物的泌尿和生殖系统]]
*[[关于各种利尿剂的总结]]
*[[止血和凝血]]
*[[血型]]
*[[先天免疫系统]]
*[[哺乳动物的适应性免疫系统]]
*[[神经递质|中枢神经递质]]
*[[特殊呼吸型整理]]
*[[心功能曲线-血管功能曲线]]
*[[肾脏与酸碱平衡]]
*[[载体蛋白和通道蛋白]]
*[[BCR和TCR]]
*[[“小体”s]]
*[[抗抑郁药]]
*[[致幻剂]]
*[[阿片受体与中枢镇痛药]]
*[[麻醉剂大汇总]]
*[[前列腺素]]
*[[昆虫激素整理]]

==== 生态学 ====
*[[生态学人名规律整理]]
*[[生物的地理分区]]
*[[生物多样性]]
*[[种群大小的测定]]
*[[各种生态系统特征]]
*[[Gloger 规则]]
*[[隔离因素的分类]]
*[[生态学小汇总（1）]]

==== 动物行为学 ====
*[[动物行为学术语]]
*[[常用动物行为学实验方法]]
*[[人名拟态的典例整理]]

=== 第四部分：遗传学、演化生物学、生物信息学 ===

==== 遗传学 ====
*[[表观遗传疾病]]
*[[染色体结构与结构变异]]
*[[各种显性隐性常染性连锁遗传疾病总结|各种显性隐性常染性连锁遗传病总结]]
*[[表观遗传学]]
*[[数量性状的遗传效应]]（未完成）

==== 演化生物学 ====
*[[系统发育学]]''（基本完成）''
*[[初级内共生新知]]
*[[构建系统发生树常用方法]]
*[[分类:生物|index]] [[进化生物学与古大陆变迁]]''（未完成）''
*[[类人群星闪耀时——古人类们]]
*[[显生宙演化]]

==== 生物信息学 ====

* [[比对算法]]
* [[生物信息数据库及工具简介整理]]
* [[基因组结构变异的检测方法]]

讨论:流星闪耀时

2025-08-27T11:51:09Z

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讨论:流星下的许愿墙

2025-08-27T11:51:09Z

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流星闪耀时

2025-08-27T11:51:09Z

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流星下的许愿墙

2025-08-27T11:51:09Z

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= '''祝每个梦想都能实现''' =
= 许愿墙（2025联赛版） =
<blockquote><small>许愿自己和身边的人进队，进必还愿。——2025.5.9氨基甲酰血红蛋白</small></blockquote>希望今年可以进省队，进必还愿。——2025.5.5日luphut

我也想进队😭 ----2025.5.5tftz

调色板别炒9nine冷饭了，感紧出新作。 ----2025.5.5tftz

我明年想进省队----2025.5.5报告基因FJX

希望今年可以进省队——2025.5.5 hukk

希望稳进浙江省队，也祝我们夺得11个省队名额！——2025.5.5晚 C.C.

有点想进队呢——2025.5.6 文弋

望考联赛时阮梅附体，保我进队——2025.5.7yifan

许愿省队(ง •̀_•́)ง——2025.5.6 神秘的炒饭

许愿自己🪳以及同校的💩🌵🌱🌼🍀🪲🍟👽🩵🧠尽量多地进省队！^ ^<small>（以及祝我抽卡顺利（）</small>——2025.5.6 W. Machine

许愿进省队，进国集！朝向梦想进发！王学长保佑！韦学长保佑！球球啦！——2025.5.6 MangoCat

希望今年稳进省队！！！进必还愿。——2025.5.6 Xswl

许愿自己和身边的大家都可以多多进省队^_^———2025.5.6 Okazaki3333

<nowiki>🙏🏼——2025.5.6 --[[用户:Tsusha|Tsusha]]（[[用户讨论:Tsusha|留言]]） 2025年5月6日 (二) 20:29 (CST)

希望今年自己及身边的蒟蒻都进省队！明年开始冲击化学(๑•̀ㅂ•́)و✧🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇 国家集训队50个，我只要一个 —— 磷酸丙糖异构酶 2025.5.6 FYJ

肯定希望进省队啊，也是想给自己一个交代，不负自己的期待，故在此立志，等我一周后来还愿——神秘的偷马头 2025.5.6 YXH

<nowiki>希望今年一定进省队，球球啦--[[用户:羊驼洋子|羊驼洋子]]（[[用户讨论:羊驼洋子|留言]]） 2025年5月6日 (二) 19:50 (CST)

当然是想进省队啦，虽然我不信什么许愿的吧，但还是把目标写下来比较好喵～———Redemption 2025.5.6 20:20

许愿省队~~希望可以向我喜欢的人更靠近一步~~ ————WangBoDe 2025.5.6 20:25<blockquote>希望你最终能骄傲地站在那个人身边！！！</blockquote>许愿捞个省三以上的奖项，这样明年就可以继续和大家一起学生物竞赛(´∀｀)♡ ————竹下。2025.5.6 21:20

稳一（冲省），不辜负。希望zn的大家都考好，灯芯草一定要进省队！！！——曾一航。2025.5.6

陕西省队🙏🏻🙏🏻🙏🏻希望结果配得上我所受痛苦——单位捕捞努力的🐟2025.5.6

晚安。————蛞蝓 2025.5.10<blockquote>晚安。——🐟</blockquote>

希望今年我和身边的朋友能多多进省队，不负这场盛夏！！！——Ywxm 2025.5.7 00:15<blockquote>走过的春夏秋冬毕竟不辜负你们！！！</blockquote>想成为一只优秀的小猫。考省一最好，当然也有省队梦，虽然有点难度，但是只要把过程做好了，一定有个结果等着我！也希望身边优秀的同学们能一起进队，考出自己最好的成绩—— 加猫酶 Catting enzyme 2025.5.7 XYQ<blockquote>猫猫加油！</blockquote>希望雪豹可以今年进省一，明年进省队！（知道雪豹是什么东西的一定认出来这东西的来历了，那么朋友，祝你也祝我！）⊹꙳ ˶˙ᵕ˙˶ ⊹꙳——Gardenia Ai2025/5/7

省一（悲），最后能爆个强运蒙进队（我在讲什么）——沿阶草 2025/5/7

联赛考好点，离未来更进一步。不奢求省队，毕竟来日方长。祝愿我们一起并肩的🐵 🐭 🐰 🦊 🐻 🐼 🐨 🐯 🦁 🐮 🐷 🐽 🦆 🐥 🐣 🐤 🐧 🐔 🐒 🙊 🐙 🐸 🐶 🐱 🐭 🦉 🐍 🦎 🦀 🦑 🦖 🐂 🦕 🦐 ☘ 🍀🐦🐆🐠 🐟 🐡 🐬 🦈 🐳 🐋👻 ，都能取得自己理想的成绩！！！——🍬 2025/5/7

省队，加油。还有🫛—— 🐤 2025/5/7

这里是雪豹，痛斥楼上那个把我们队的全部飞禽走兽都拉进来的犬，但别说还怪好玩的🤓👆——Gardenia Ai 2025/5/7

<small>不奢求什么啦，只希望最后几天能踏踏实实地做好该做的，考场上发挥出自己应有的水平就行啦，别辜负了自己这么久的努力。也希望自己的一些愿望能够实现呢，</small>祝各位都多多圆梦！！<small>——2025/5/7 hd</small>

鸟要挣脱出壳，蛋就是世界。待盛夏，五月息兴，满城且赏黄金之香————Aureatring 2025/5/7<blockquote>待盛夏，八月既半，与尔共襄西安举！！！</blockquote>进省队！！！！！希望我能够回来这里还愿——2025.5.7 微.

希望能够稳住省一的位置，向着省队冲刺，同时也祝段、曾、隆、伍、李等进队！——光追 2025/5/7

也就省二水平，还是暗自希望有个省一用来假装自己很努力。祝愿哈集米，海基参，河基妈，哈基赫，哈基舟都进省队！——shiningstars 2025/5/7

全员省一，最好全省队！——T 2025/5/7<blockquote>托你的福，到时候所有人都来还你的愿！！！</blockquote>愿每份努力都能不被辜负！缘为热爱，莫问前程！原为热爱，莫问前程！愿为热爱，莫问前程！——卡共和 2025/5/7

自己和身边的人都能得偿所愿，一切顺利（国米拿欧冠（在这里夹带私货是不是不太好（算了）——Aaaa 2025/5/7

希望还愿墙也是这么满——恐龙王子 2025/5/7

我们学校这一级第二年就剩三个人了……希望都可以进省队！我们将在没有黑暗的地方相见！——范进 2025/5/7<blockquote>希望你中举！！！</blockquote>希望能有省一，省队......万一呢（？），别辜负自己的努力!也同时祝松狮同学考到山东省前20！！！——Paper moon 2025/5/7

希望所有在这许愿的小伙伴们得偿所愿！考不进省队我瞧不起你—<small>2025/5/7 ling</small>

许愿能进队——新可 2025/5/7

自己进省队，好朋友也是——2610115639 2025/5/8

全省前五，国集前十:

无论如何，她会等我回来的，我们也终将相会秋叶原 ——鹭 5/10<blockquote>
到时候喜帖群里人手一份呐！！</blockquote>
进省队，and be with him不辜负自己和他——HuGo 2025/5/8<blockquote>祝苦心人，天不负；祝有情人，成眷属！！！</blockquote>求你了给我省一吧2025，也另祝同队的大家都能得偿所愿！！！阿水fighting！二总小钟上岸！！！——垂直 2025/5/8

联赛不留遗憾，今年夏天，西安国赛现场见！！！——半月瓣 2025/5/8

希望……能进队（虽然希望不大）——内涵 2025/5/8

希望拿湖南省一🤯🤯 ——爱解剖青蛙的文昌鱼 2025/5/8

强省弱校的我也想要进队呜啊啊啊…我也要去国赛和大家面基……——星南 2025/5/9

我要拿省一，我要进省队，我要拿金牌。———寸阳 2025/5/9

保一冲省！————Odonata 2025/5/9

'''一定要进省队啊，，，，我相信奇迹会发生，请奇迹眷顾一下我吧!!!1!!!!--------河南 26 鹿皮护腿2025/5/9'''<blockquote>眷顾你的从不是奇迹，而是你日复一日的努力！</blockquote>巴蜀前15进不了安徽省队，我不是巴蜀前15，所以我一定能进安徽省队吧🙏🙏🙏——————安徽共生的菟丝子 2025/5/9

希望和他一起进省队！(●'◡'●) ——————安徽一只菜狗 2025/5/9

（不过好像，只是单相思罢了૮(˶ᵔᵕᵔ˶)აqwq，没关系那也要一起进省队！）<blockquote>到时候进了省队发现是双向奔赴别忘了报喜哟！</blockquote>

asdfz全员进省队！都给我进省队！——————还是这只菜狗 2025/5/10

愿我们西安相见——————安徽 N·CHEN·Y 2025/5/10

河北许愿省一！加油！生竞快乐！————乙年 2025/5/10

希望能有广东省队，希望抽卡十连三金，希望明天考试多点简单题！—————广东沃特曼 2025/5/10

高一省队，复刻ch！—煮风<blockquote>生竞快乐！</blockquote><blockquote>bushi这是什么——ch</blockquote>希望可以高一进省队，不负自己的努力！！！！！!———四川 F&E 5.10

不要炸掉，稳稳落地！许愿前三！！！———zzb 5.10

想去做实验好想好想做实验！一切顺利！——Z. 5.10

考的都会蒙的都对——R. 5.10

正常发挥，和dzj都进省队 —— ezxr 5.10

联赛加油，省队再见，西安会师，银河赴约！——cheng 5.10

愿西安见—— Z-Double Tyr

高一省一高二省队一定要进一次队啊——薰戴胜 5.10

希望今年马鞍山②中的每个人都可以得到自己想要的结果——fan5.11 0：00

好运爆炸，进省队！——郭宗乐 5.11

只是希望自己能在得知自己无法取得成绩之后放下压力与包袱，仰望那星辰与大海---愿所有失意之人也可得到心灵的安宁

——一个无名者的挣扎

让我擦边进队吧！！！我愿意十年不看擦边！！！——91二体雄蕊先生2025.5.13

让我进陕西省队吧，要不然就要退竞了😭。——TYZ某🥝先生2025.5.13

只有十名护城河，最终答案千万别把我挤出去！——金益2025.5.13

请让我擦边进队吧！！！拜托了，我不想止步于此！！！我喜欢生物，我还想跟大家一起剖花呢，我不想让看不起我的人得逞！！！——Nectaris2025.5.13

最终稿一定要改的好一点（当然不要删改太多就行）！想冲击浙江省前十！也希望同校同学大部分都进队！——C.C. 2025.5.13

许愿全员省队，至少高二如此。——Herbert West2025.5.19

= 还愿墙（2025联赛版） =
你们还愿就是我还愿——恐龙王子

我提前就开始三年禁飞，能不能遵守约定让我擦边进队。。。。。。

最终稿完蛋了，拜拜。。。———金益

终稿已出，祝愿我的同学们全部保送。

应该是进了，不知道稳不稳。先还半个愿吧 ——Xswl

来还愿了——本人浙江前十，省队5人！虽然没有11个省队有些小遗憾🐶，但是无论是个人还是团队，都算考的很好了。——C.C.

省队！！！苦心人，天不负呀！——卡共和 2025/5/27

我有个同学人称meso，他进了省队!本省高一第一名！真心祝福他今年考走（虽然我被这个“清shi留名”的卷子硬控大概不能进了--[[用户:卡布喜·米糖|卡布喜·米糖]]（[[用户讨论:卡布喜·米糖|留言]]） 2025年5月27日 (二) 15:46 (CST)

最后真心祝福大家：'''Miracle begins!愿望统统实现！'''--[[用户:卡布喜·米糖|卡布喜·米糖]]（[[用户讨论:卡布喜·米糖|留言]]） 2025年5月27日 (二) 15:49 (CST)

Let us march towards our '''Bright New Dawn'''!--[[用户:卡布喜·米糖|卡布喜·米糖]]（[[用户讨论:卡布喜·米糖|留言]]） 2025年5月27日 (二) 15:58 (CST)

进了，希望国赛一切顺利

前来还愿，愿国赛前毫不懈怠，国赛中沉着冷静，不负吾愿。——F&E

25年省队，还愿来了。--[[用户:Hukk|Hukk]]（[[用户讨论:Hukk|留言]]） 2025年6月16日 (一) 13:18 (CST)

好耶！安徽第一！还愿！———共生的菟丝子

省队还愿！（但是抽卡依旧非酋，，——W. Machine

被“清shi留名”硬控了，差一名，学校另一个应该稳进的也没进 ——Ezxr

爬上来还愿擦边进去的虽然我主队踢得一坨吧……——Aaaa

安徽第三，也算是正常发挥啦——局外人

项队～

差一点诶，但是省二也还好啦，算是圆梦了喵，这样我的竞赛生涯大概率就此结束了，明年研究文化课。不过祝后来的生竞学弟学妹们都能实现梦想！——加猫酶 Catting Enzyme 2025.7.1 XYQ

虽然压根就没在上面许愿但既然挺意外地进队了就来还个愿吧 ——[[用户:Distjr|distjr_]]（[[用户讨论:Distjr|留言]]） 2025年7月2日 (三) 09:48 (CST)

= 许愿墙（2025国赛版） =
好耶好耶！我是第一个！项队保我进集（做梦ing）——by菟丝子

一定要国家集训队！！！——CC 2025.8.9

【PS】居然在下面新建一个国赛许愿墙！！！666

许愿前240喵^ ^ ——W. Machine & Aaaa

金牌🥇——野狼君卡共和

许愿进实验，要是拿到金牌就更好了(｡>∀<｡) ——distjr_

国赛加油，不负所愿，只要理论进前150就好了！！！ F&E

= 还愿墙（2025国赛版） =
<blockquote><small>''ですが、経過が二度は戻らないように''</small>

<small>''この物語の存在が''</small>

<small>''良くも、悪くも''</small>

<small>''貴方の生きる課程が一つとして''</small>

<small>''存在したという事実は''</small>

<small>''この先たとえ貴方が忘れたとしても''</small>

<small>''消える事は無いのでしょう''</small>

<small>''（然而，正如时光无法倒流，这个故事的存在，无论好坏，你曾活过的每一段历程，它曾存在过的这一事实，即便未来被你遗忘，也永远不会消失。）''</small>

<small>''——《细胞神曲 -Cell of Empireo-》''</small> </blockquote>

理论坠机了，退役了。生竞再见，我会在生物这个圈子里继续阴魂不散地待下去的（笑） ——distjr_

理论擦线前240，最终银牌；虽然没有达到预期，但已经足够了喵，去学综合了ww——W. Machine

讨论:类人流星闪耀时

2025-08-27T11:49:50Z

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讨论:流星下的许愿墙

2025-08-27T11:49:50Z

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类人流星闪耀时

2025-08-27T11:49:50Z

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流星下的许愿墙

2025-08-27T11:49:50Z

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流星下的许愿墙

2025-08-27T11:47:34Z

Magezeya：/* 祝每个梦想都能实现，今年，国赛见！ */

流星下的许愿墙

2025-08-27T11:47:15Z

Magezeya：

= '''祝每个梦想都能实现，今年，国赛见！''' =
西安铁一中学，我们来啦

= 许愿墙（2025联赛版） =
<blockquote><small>许愿自己和身边的人进队，进必还愿。——2025.5.9氨基甲酰血红蛋白</small></blockquote>希望今年可以进省队，进必还愿。——2025.5.5日luphut

我也想进队😭 ----2025.5.5tftz

调色板别炒9nine冷饭了，感紧出新作。 ----2025.5.5tftz

我明年想进省队----2025.5.5报告基因FJX

希望今年可以进省队——2025.5.5 hukk

希望稳进浙江省队，也祝我们夺得11个省队名额！——2025.5.5晚 C.C.

有点想进队呢——2025.5.6 文弋

望考联赛时阮梅附体，保我进队——2025.5.7yifan

许愿省队(ง •̀_•́)ง——2025.5.6 神秘的炒饭

许愿自己🪳以及同校的💩🌵🌱🌼🍀🪲🍟👽🩵🧠尽量多地进省队！^ ^<small>（以及祝我抽卡顺利（）</small>——2025.5.6 W. Machine

许愿进省队，进国集！朝向梦想进发！王学长保佑！韦学长保佑！球球啦！——2025.5.6 MangoCat

希望今年稳进省队！！！进必还愿。——2025.5.6 Xswl

许愿自己和身边的大家都可以多多进省队^_^———2025.5.6 Okazaki3333

<nowiki>🙏🏼——2025.5.6 --[[用户:Tsusha|Tsusha]]（[[用户讨论:Tsusha|留言]]） 2025年5月6日 (二) 20:29 (CST)

希望今年自己及身边的蒟蒻都进省队！明年开始冲击化学(๑•̀ㅂ•́)و✧🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇🥇 国家集训队50个，我只要一个 —— 磷酸丙糖异构酶 2025.5.6 FYJ

肯定希望进省队啊，也是想给自己一个交代，不负自己的期待，故在此立志，等我一周后来还愿——神秘的偷马头 2025.5.6 YXH

<nowiki>希望今年一定进省队，球球啦--[[用户:羊驼洋子|羊驼洋子]]（[[用户讨论:羊驼洋子|留言]]） 2025年5月6日 (二) 19:50 (CST)

当然是想进省队啦，虽然我不信什么许愿的吧，但还是把目标写下来比较好喵～———Redemption 2025.5.6 20:20

许愿省队~~希望可以向我喜欢的人更靠近一步~~ ————WangBoDe 2025.5.6 20:25<blockquote>希望你最终能骄傲地站在那个人身边！！！</blockquote>许愿捞个省三以上的奖项，这样明年就可以继续和大家一起学生物竞赛(´∀｀)♡ ————竹下。2025.5.6 21:20

稳一（冲省），不辜负。希望zn的大家都考好，灯芯草一定要进省队！！！——曾一航。2025.5.6

陕西省队🙏🏻🙏🏻🙏🏻希望结果配得上我所受痛苦——单位捕捞努力的🐟2025.5.6

晚安。————蛞蝓 2025.5.10<blockquote>晚安。——🐟</blockquote>

希望今年我和身边的朋友能多多进省队，不负这场盛夏！！！——Ywxm 2025.5.7 00:15<blockquote>走过的春夏秋冬毕竟不辜负你们！！！</blockquote>想成为一只优秀的小猫。考省一最好，当然也有省队梦，虽然有点难度，但是只要把过程做好了，一定有个结果等着我！也希望身边优秀的同学们能一起进队，考出自己最好的成绩—— 加猫酶 Catting enzyme 2025.5.7 XYQ<blockquote>猫猫加油！</blockquote>希望雪豹可以今年进省一，明年进省队！（知道雪豹是什么东西的一定认出来这东西的来历了，那么朋友，祝你也祝我！）⊹꙳ ˶˙ᵕ˙˶ ⊹꙳——Gardenia Ai2025/5/7

省一（悲），最后能爆个强运蒙进队（我在讲什么）——沿阶草 2025/5/7

联赛考好点，离未来更进一步。不奢求省队，毕竟来日方长。祝愿我们一起并肩的🐵 🐭 🐰 🦊 🐻 🐼 🐨 🐯 🦁 🐮 🐷 🐽 🦆 🐥 🐣 🐤 🐧 🐔 🐒 🙊 🐙 🐸 🐶 🐱 🐭 🦉 🐍 🦎 🦀 🦑 🦖 🐂 🦕 🦐 ☘ 🍀🐦🐆🐠 🐟 🐡 🐬 🦈 🐳 🐋👻 ，都能取得自己理想的成绩！！！——🍬 2025/5/7

省队，加油。还有🫛—— 🐤 2025/5/7

这里是雪豹，痛斥楼上那个把我们队的全部飞禽走兽都拉进来的犬，但别说还怪好玩的🤓👆——Gardenia Ai 2025/5/7

<small>不奢求什么啦，只希望最后几天能踏踏实实地做好该做的，考场上发挥出自己应有的水平就行啦，别辜负了自己这么久的努力。也希望自己的一些愿望能够实现呢，</small>祝各位都多多圆梦！！<small>——2025/5/7 hd</small>

鸟要挣脱出壳，蛋就是世界。待盛夏，五月息兴，满城且赏黄金之香————Aureatring 2025/5/7<blockquote>待盛夏，八月既半，与尔共襄西安举！！！</blockquote>进省队！！！！！希望我能够回来这里还愿——2025.5.7 微.

希望能够稳住省一的位置，向着省队冲刺，同时也祝段、曾、隆、伍、李等进队！——光追 2025/5/7

也就省二水平，还是暗自希望有个省一用来假装自己很努力。祝愿哈集米，海基参，河基妈，哈基赫，哈基舟都进省队！——shiningstars 2025/5/7

全员省一，最好全省队！——T 2025/5/7<blockquote>托你的福，到时候所有人都来还你的愿！！！</blockquote>愿每份努力都能不被辜负！缘为热爱，莫问前程！原为热爱，莫问前程！愿为热爱，莫问前程！——卡共和 2025/5/7

自己和身边的人都能得偿所愿，一切顺利（国米拿欧冠（在这里夹带私货是不是不太好（算了）——Aaaa 2025/5/7

希望还愿墙也是这么满——恐龙王子 2025/5/7

我们学校这一级第二年就剩三个人了……希望都可以进省队！我们将在没有黑暗的地方相见！——范进 2025/5/7<blockquote>希望你中举！！！</blockquote>希望能有省一，省队......万一呢（？），别辜负自己的努力!也同时祝松狮同学考到山东省前20！！！——Paper moon 2025/5/7

希望所有在这许愿的小伙伴们得偿所愿！考不进省队我瞧不起你—<small>2025/5/7 ling</small>

许愿能进队——新可 2025/5/7

自己进省队，好朋友也是——2610115639 2025/5/8

全省前五，国集前十:

无论如何，她会等我回来的，我们也终将相会秋叶原 ——鹭 5/10<blockquote>
到时候喜帖群里人手一份呐！！</blockquote>
进省队，and be with him不辜负自己和他——HuGo 2025/5/8<blockquote>祝苦心人，天不负；祝有情人，成眷属！！！</blockquote>求你了给我省一吧2025，也另祝同队的大家都能得偿所愿！！！阿水fighting！二总小钟上岸！！！——垂直 2025/5/8

联赛不留遗憾，今年夏天，西安国赛现场见！！！——半月瓣 2025/5/8

希望……能进队（虽然希望不大）——内涵 2025/5/8

希望拿湖南省一🤯🤯 ——爱解剖青蛙的文昌鱼 2025/5/8

强省弱校的我也想要进队呜啊啊啊…我也要去国赛和大家面基……——星南 2025/5/9

我要拿省一，我要进省队，我要拿金牌。———寸阳 2025/5/9

保一冲省！————Odonata 2025/5/9

'''一定要进省队啊，，，，我相信奇迹会发生，请奇迹眷顾一下我吧!!!1!!!!--------河南 26 鹿皮护腿2025/5/9'''<blockquote>眷顾你的从不是奇迹，而是你日复一日的努力！</blockquote>巴蜀前15进不了安徽省队，我不是巴蜀前15，所以我一定能进安徽省队吧🙏🙏🙏——————安徽共生的菟丝子 2025/5/9

希望和他一起进省队！(●'◡'●) ——————安徽一只菜狗 2025/5/9

（不过好像，只是单相思罢了૮(˶ᵔᵕᵔ˶)აqwq，没关系那也要一起进省队！）<blockquote>到时候进了省队发现是双向奔赴别忘了报喜哟！</blockquote>

asdfz全员进省队！都给我进省队！——————还是这只菜狗 2025/5/10

愿我们西安相见——————安徽 N·CHEN·Y 2025/5/10

河北许愿省一！加油！生竞快乐！————乙年 2025/5/10

希望能有广东省队，希望抽卡十连三金，希望明天考试多点简单题！—————广东沃特曼 2025/5/10

高一省队，复刻ch！—煮风<blockquote>生竞快乐！</blockquote><blockquote>bushi这是什么——ch</blockquote>希望可以高一进省队，不负自己的努力！！！！！!———四川 F&E 5.10

不要炸掉，稳稳落地！许愿前三！！！———zzb 5.10

想去做实验好想好想做实验！一切顺利！——Z. 5.10

考的都会蒙的都对——R. 5.10

正常发挥，和dzj都进省队 —— ezxr 5.10

联赛加油，省队再见，西安会师，银河赴约！——cheng 5.10

愿西安见—— Z-Double Tyr

高一省一高二省队一定要进一次队啊——薰戴胜 5.10

希望今年马鞍山②中的每个人都可以得到自己想要的结果——fan5.11 0：00

好运爆炸，进省队！——郭宗乐 5.11

只是希望自己能在得知自己无法取得成绩之后放下压力与包袱，仰望那星辰与大海---愿所有失意之人也可得到心灵的安宁

——一个无名者的挣扎

让我擦边进队吧！！！我愿意十年不看擦边！！！——91二体雄蕊先生2025.5.13

让我进陕西省队吧，要不然就要退竞了😭。——TYZ某🥝先生2025.5.13

只有十名护城河，最终答案千万别把我挤出去！——金益2025.5.13

请让我擦边进队吧！！！拜托了，我不想止步于此！！！我喜欢生物，我还想跟大家一起剖花呢，我不想让看不起我的人得逞！！！——Nectaris2025.5.13

最终稿一定要改的好一点（当然不要删改太多就行）！想冲击浙江省前十！也希望同校同学大部分都进队！——C.C. 2025.5.13

许愿全员省队，至少高二如此。——Herbert West2025.5.19

= 还愿墙（2025联赛版） =
你们还愿就是我还愿——恐龙王子

我提前就开始三年禁飞，能不能遵守约定让我擦边进队。。。。。。

最终稿完蛋了，拜拜。。。———金益

终稿已出，祝愿我的同学们全部保送。

应该是进了，不知道稳不稳。先还半个愿吧 ——Xswl

来还愿了——本人浙江前十，省队5人！虽然没有11个省队有些小遗憾🐶，但是无论是个人还是团队，都算考的很好了。——C.C.

省队！！！苦心人，天不负呀！——卡共和 2025/5/27

我有个同学人称meso，他进了省队!本省高一第一名！真心祝福他今年考走（虽然我被这个“清shi留名”的卷子硬控大概不能进了--[[用户:卡布喜·米糖|卡布喜·米糖]]（[[用户讨论:卡布喜·米糖|留言]]） 2025年5月27日 (二) 15:46 (CST)

最后真心祝福大家：'''Miracle begins!愿望统统实现！'''--[[用户:卡布喜·米糖|卡布喜·米糖]]（[[用户讨论:卡布喜·米糖|留言]]） 2025年5月27日 (二) 15:49 (CST)

Let us march towards our '''Bright New Dawn'''!--[[用户:卡布喜·米糖|卡布喜·米糖]]（[[用户讨论:卡布喜·米糖|留言]]） 2025年5月27日 (二) 15:58 (CST)

进了，希望国赛一切顺利

前来还愿，愿国赛前毫不懈怠，国赛中沉着冷静，不负吾愿。——F&E

25年省队，还愿来了。--[[用户:Hukk|Hukk]]（[[用户讨论:Hukk|留言]]） 2025年6月16日 (一) 13:18 (CST)

好耶！安徽第一！还愿！———共生的菟丝子

省队还愿！（但是抽卡依旧非酋，，——W. Machine

被“清shi留名”硬控了，差一名，学校另一个应该稳进的也没进 ——Ezxr

爬上来还愿擦边进去的虽然我主队踢得一坨吧……——Aaaa

安徽第三，也算是正常发挥啦——局外人

项队～

差一点诶，但是省二也还好啦，算是圆梦了喵，这样我的竞赛生涯大概率就此结束了，明年研究文化课。不过祝后来的生竞学弟学妹们都能实现梦想！——加猫酶 Catting Enzyme 2025.7.1 XYQ

虽然压根就没在上面许愿但既然挺意外地进队了就来还个愿吧 ——[[用户:Distjr|distjr_]]（[[用户讨论:Distjr|留言]]） 2025年7月2日 (三) 09:48 (CST)

= 许愿墙（2025国赛版） =
好耶好耶！我是第一个！项队保我进集（做梦ing）——by菟丝子

一定要国家集训队！！！——CC 2025.8.9

【PS】居然在下面新建一个国赛许愿墙！！！666

许愿前240喵^ ^ ——W. Machine & Aaaa

金牌🥇——野狼君卡共和

许愿进实验，要是拿到金牌就更好了(｡>∀<｡) ——distjr_

国赛加油，不负所愿，只要理论进前150就好了！！！ F&E

= 还愿墙（2025国赛版） =
<blockquote><small>''ですが、経過が二度は戻らないように''</small>

<small>''この物語の存在が''</small>

<small>''良くも、悪くも''</small>

<small>''貴方の生きる課程が一つとして''</small>

<small>''存在したという事実は''</small>

<small>''この先たとえ貴方が忘れたとしても''</small>

<small>''消える事は無いのでしょう''</small>

<small>''（然而，正如时光无法倒流，这个故事的存在，无论好坏，你曾活过的每一段历程，它曾存在过的这一事实，即便未来被你遗忘，也永远不会消失。）''</small>

<small>''——《细胞神曲 -Cell of Empireo-》''</small> </blockquote>

理论坠机了，退役了。生竞再见，我会在生物这个圈子里继续阴魂不散地待下去的（笑） ——distjr_

理论擦线前240，最终银牌；虽然没有达到预期，但已经足够了喵，去学综合了ww——W. Machine

用户讨论:Yzqzss

2025-08-27T11:43:44Z

Magezeya：

呼叫管理！出现大量垃圾广告界面！！

收到收到。

--[[用户:Yzqzss|Yzqzss]]（[[用户讨论:Yzqzss|讨论]]） 2024年3月20日 (三) 11:14 (CST)

请问如何上传大量图片，我转载的几篇文章中还有很多图片没有上传
PS：今天偶然上号发现网站竟然活了，每天都有人，而且出现了管理~hh
——Yunzizhi

网站证书过期了捏。
证书又过期了捏，现在PC端完全用不了，下载不了文件（恼）

请删除[[第三十六章体液的容量和渗透压调节（有待删除或者重定向）]]，[[第三十六章体液的容量和渗透压调节]][[第七章刺胞动物门：海葵，珊瑚，水母及其亲属]]。原因，与已有界面重复并且懒得重定向了（没必要）

还有这两个页面[[GABAA 受体]][[GABA受体]]原因，没有内容

用户讨论:Yzqzss

2025-08-27T11:41:38Z

Magezeya：

Molecular Population Genetics

2025-08-27T11:35:55Z

Magezeya：

一本关于分子群体遗传学的书，内容包括但不限于：Tajima's D，不完全谱系分选，ABBA-AABB等等莫名其妙的考点。

[[第一章进化的模型|第一章演化的模型]]

[[第2章系统学、系统发生与分类]]

[[第三章描述变异]]

[[第五章种群结构]]

[[第六章溯祖]]

[[第八章连锁选择]]

讨论:Bio index

2025-08-27T11:32:23Z

Magezeya：

请问站主为什么很多优秀页面不在首页中展示了呢？

为啥植物分类的地方缺了很多图片？？？（2025.2.14）
因为这是从友网站上搬运的，忘记搬图了

一直都很好奇这个网站的名字为什么叫osm?

关于对如何建新页面的回答的看法：作为一个多为生物竞赛生、生命科学的爱好者使用的网站，用唐氏综合症等疾病开涮似乎不太能体现大家基本的生物学素养与道德素养

倒计时可以通过编辑源码改变目标日期。

Bio index

2025-08-27T11:31:22Z

Magezeya：

距离2026年联赛还有{{Countdown|2026-5-10|text=-天}}

== 问题页面 ==

=== · '''[[提出你的问题]] ''' ===

=== '''· [[幻想乡问题精选]] ''' ===

=== '''• [[愿程二群Q&A整理]]''（未完成）''''' ===

=== '''· 网站使用说明：[[Osm使用手册]]''（欢迎提问，随时可能补充）''''' ===
==任务==

=== 编辑意向的任务 ===
* [[S]]
* [[无纸化学习]]（需要进行长期补充，希望看见的可以进来看看，补充）
* [[植物命名法]]（未完成）
* [[距佬|花距的物种分布和结构来源]]（''未完成''）
* [[生理学毒素和特异性阻断剂]]（''未完成''）
* [[无脊椎动物比较]](''未完成'')
* [[无脊椎动物系统比较]]''（未完成）''
* [[心电图及各种疾病时的变型]]''（未完成）''
* [[被子植物各科介绍]]''（未完成）''

*[[两栖动物的皮肤及其衍生物]]''(未完成）''
*[[2023诺贝尔生理学或医学奖简介]]''(未完成）''
*[[生物信息数据库及工具简介整理]]''（未完成）''
*[[报告基因整理]]''（未完成）''
*[[糖酵解]]''（未完成）''
*[[细胞死亡方式整理]]''（未完成）''
*[[重要的同源器官]]''（未完成）''
*[[RNA的生物合成]] ''(未完成)''
*[[金属酶]] ''（未完成）''
*[[关于Histidine]] ''（未完成）''
*[[组织学与胚胎学]]''（未完成）''
*[[常见序列整理]]（未完成）
* [[类人群星闪耀时——古人类们]]''（基本完成)''
* [[核酸酶整理]]''（未完成）''
* [[模式生物相关知识]]''（未完成）''
* [[关于锥虫二三事]]''（未完成）''
* [[前列腺素]]''（未完成）''
* [[各种脂肪酸的俗称及对应命名总结]]''（未完成）''
* [[常见受体阻断与激动剂]]''（未完成）''
* [[昆虫口器类型总结]]''（接近完成）''
*[[植物的同源器官及变态演化]]''（未完成）''
*[[中文重名的生物学定义]]''(未完成）''
*[[诸子百家-进化论的形成]]''（未完成）''
*[[昆虫激素整理]]''（未完成）''
*[[生态学小汇总（2）]]''（正在加班补充中）''
*[[胎座表格|胎座表格''（未完成）'']]
*[[生理学计算汇总]]''（现有问题：无法引入公式）''
*[[人名疾病整理]]''（待编辑，欢迎大家补充）''
*[[生物统计漫谈]]''（未完成）''
*[[果实]] （未完成）

==现有条目==

*[[特殊:孤立页面|特殊:孤立页面（没有被双向链接的条目）]]

=== 永远<s>填坑</s>更新的页面 ===

* [[教材错误与矛盾]]''（未完成）''
* [[动物中首次出现的结构]]''（未完成，希望大家共同来填～）''
* [[绝对化表述：所有&一切&任何都]]''（未完成）''
* [[常见动物生理学抑制剂整理]] ''(未完成)''
* [[生物缩写]]''（未完成）''
* [[文献阅读分享]]（''怎么没人编辑😢''）文献读的有A佬这么多的还是太少了。
* [[查阅资料|查阅资料的网站]] （未完成）

=== 外文教材翻译 ===
* [[Invertebrates Fourth Edition 译文版]]
* [[Invertebrates（Brusca）Fourth Edition 重制版]]
* [[Vertebrates:Comparative Anatomy,Function,Evolution]]
* [[An Introduction to Behavioural Ecology]]
* [[BERNE & LEVY 生理学第八版]]
* [[Guyton&Hall 生理学第十四版]]
* [[免疫系统工作原理（第七版）]]
* [[Molecular Biology of the Cell]]
* [[Molecular Population Genetics]]
* [[Plant systematics|Plant Systematics]]
* [[Plant Physiology and Development, Seventh Edition (Lincoln Taiz）]]
* [[Taiz的WEB TOPIC]]
* [[Anoxygenic Phototropic Bacteria]]
* [[Animal eyes]]
* [[Esau's Plant Anatomy]]
* [[POPULATION GENETICS 第二版]]
* [[蚯蚓的形态学|蚯蚓的形态学（《Biology and Ecology of Earthworms》）]]

=== 生物学综合 ===

==== 公告栏 ====
*[[OSM生物刊]]

==== 生物学基础 ====
*[[生物之最]]

*[[生物口诀学]]
*[[常见数值]]
*[[十分钟读完基础物理化学]]
*[[模式生物的种名]]
*[[Strange but True]]
*[[中国外来入侵物种名单]]

* [[生物网站]]
* [[生物学英文名词词根词缀整理]]

==== 题目 ====
*[[全国中学生生物学联赛试题|全国中学生生物学联赛试题及答案（2000-2024）]]
*[[共同出题（旨在收集平时散出的题，你要是喜欢也可以泡在这里出题）]]

==== 非正式生物竞赛内容 ====
*[[生竞梗百科是什么梗|生竞梗百科]]
*[[生竞巨佬闪耀时]]
*[[笑话数则]]
*[[西洋笑传之阉鸡、骟马、歌唱巨星]]
*[[全F主义]]
*[[【非正式】deepseek浅谈生竞判断题填涂策略期望得分]]
*[[生竞·警示录]]
*[[类人流星闪耀时|流星下的许愿墙]]
*[[那些你最想做的事]]
*[[联赛题预测]]
*[[联赛分数与排名对应表]]
*[[如何评判大改革后的第一次联考-论2025年联赛]]
*[[生竞回忆墙]]
*[[金厕纸杯试卷大赛]]
*[[吐槽2025年联赛]]
*[[无题]]
*[[无纸化学习]]

==== New Ideas ====

* [[混沌学摘录]]
* [[瓜的小论]]
* [[苟书纠错与存疑]]

=== 第一部分：生物化学、分子生物学、细胞生物学、生物技术 ===

==== 生物化学 ====
*[[氨基酸性质整理]]
*[[磷酸戊糖途径和卡尔文循环之间的联系|磷酸戊糖途径和卡尔文循环的联系]]
*[[生化代谢产能分析]]
*[[生化过程抑制剂整理]]
*[[脂质代谢]]
*[[酶]]
*[[酶动力学作图]]
*[[颜色反应]]
*[[C/D/E-DNA]]
*[[TCA回补反应]]
*[[生物化学中的"20"与"7"|生物化学中的"20"、"7"与“12”]]
*[[Sanger测序]]
*[[维生素与辅酶]]
*[[血红蛋白与Hb相关疾病]]
*[[元素追踪]]
*[[兼职蛋白]]
*[[从PPi学生化|从ppi学生化]]
*[[泛素相关知识]]
*[[糖]]
*[[TCA的C去向]]
*[[所以我们这么辛苦生产NTP是为什么]]

==== 分子生物学 ====
*[[DNA聚合酶]]
*[[调控RNA]]
*[[DNA解链酶]]
*[[RNA的生物合成]]
*[[复制叉反转]]
*[[拓扑异构酶]]
*[[核酸酶整理]]

==== 细胞生物学 ====
*[[癌]]
*[[细胞染色带型整理]]
*[[糖基化区分]]
*[[细胞同步化方法]]
*[[mTOR的性质]]
*[[细胞因子和细胞因子受体|细胞因子]]
*[[G蛋白偶联受体及其信号转导|信号转导I：G蛋白偶联受体]]
*[[酶联受体及其信号转导|信号转导II：酶联受体]]
*[[其他受体及其信号转导|信号转导III：其他受体]]（未完成）
*[[内膜系统运输]]
*[[细胞间连接]]
*[[核受体]]
*[[红细胞的膜骨架]]
*[[溶酶体疾病和过氧化物酶体疾病]]
*[[Hippo信号通路]]
*[[14-3-3蛋白]]
*[[各细胞组分标志酶]](未完成)
*[[凋亡的特征和分子标记]]
*[[减数分裂驱动]]
*[[第四种细胞骨架]]
*[[有关核孔运输的迷思]]
*[[脂质的膜内/膜间转运]]
*[[内质网的细胞生物学]]
*[[关于各种通道/受体]]
*[[阿尔兹海默症]]

==== 生物技术 ====
*[[各种工具酶]]
*[[生物学实验技术手册v1.0]]
*[[生化分子细胞技术列表]]
*[[蛋白质含量测定]]
*[[CRISPR-Cas系统及相关技术]]
*[[离心相关总结]]
*[[快速反应技术]]
*[[western blot条带结果分析整理]]
*[[电泳染色方法]]''（未完成）''

=== 第二部分：植物学、植物生理学、微生物学 ===

==== 植物学 ====
*[[APG IV]]
*[[植物命名法]]
*[[被子植物各科介绍]]
*[[藻类分类整理]]
*[[藻类生活史总结]]
*[[裸子植物]]
*[[苔藓植物]]
*[[花]]
*[[维管植物的结构]]
*[[蔬菜水果的食用部分总结]]
*[[自交不亲和]]
*[[无融合生殖]]
*[[好玩但不考的植物学知识]]
*[[柿树科]]
*[[植物学表格知识]]
*[[种子]]
*[[果实]]
*[[胎座表格]]
*[[苔藓总结]]
*[[距佬|花距的物种分布和结构来源]]
*[[植物演化]]''（未完成）''
*[[图注缩写对照]]

==== 植物生理学 ====
*[[植物生长物质整理]]
*[[植物激素一表览]]
*[[植物矿质元素整理]]
*[[植物抗逆生理整理]]
*[[植物的矿质生理学]]
*[[植物的水生理学]]
*[[植物细胞水势整理]]
*[[植物常见氧化酶总结]]
*[[环境因素对植物发育的影响]]
*[[植物激素演化]]
*[[红光受体]]
*[[蓝光受体]]
*[[C4途径]]
*[[各种特殊的光合作用总结]]
*[[叶黄素循环]]

==== 微生物学 ====
*[[常见抑制剂整理|常见抗生素抑制剂整理]]
*[[与人有关的病毒]]
*[[病毒分类整理]]
*[[病毒的结构]]
*[[低等真核生物]]
*[[衣原体]]
*[[细菌染色法]]
*[[各种染料和染色的总结]]
*[[培养基总结]]
*[[转染菌种特性]]
*[[细菌vs.古菌vs.真核]]
*[[细菌常见贮藏物整理|细菌常见包含体整理]]
*[[污水处理]]
*[[细菌的营养类型]]
*[[酵母的小菌落]]

=== 第三部分：动物学、生理学、生态学、动物行为学 ===

==== 动物学 ====
*[[原生动物门]]''（已基本完成，欢迎大家来补充）''
*[[寄生动物总结]]
*[[总鳍鱼整理]]
*[[论证于脊椎动物到底是怎么个进化路线]]
*[[脊椎动物的中枢神经]]
*[[动物学人名结构整理]]
*[https://life.scnu.edu.cn/biology/jingpin/dwx/course_learn/chapter_20/chapter_2/learn/default.htm 动物地理区系划分]
*[[肺鱼特征整理]]
*[[辅助呼吸器官]]
*[[鸟的趾整理]]
*[[鸟类分目比较]]
*[[无脊椎动物比较]]
*[[脊椎动物的心脏]]
*[[昆虫的外部解剖]]
*[[昆虫的变态整理]]
*[[昆虫特征分类]]
*[[昆虫的标本制作]]''（基本完成）''
*[[脊椎动物的皮肤]]
*[[脊椎动物的骨骼系统]]
*[[脊椎动物的循环系统]]
*[[脊椎动物的呼吸系统]]
*[[脊椎动物的中枢神经]]
*[[丢失的五脏六腑]]
*[[蛇|蛇的重要考点]]
*[[脑神经整理|人脑神经整理]]
*[[百背不记的始祖鸟]]
*[[卵裂]]
*[[昆虫的复眼]]
*[[最非凡的心脏——潘氏孔相关释疑]]
*[[羊膜卵/胚胎概述]]
*[[脊椎动物的牙齿类型]]
*[[脊比笔记：循环系统]]
*[[动物的各种“式”]]''（望补充完善！）''

==== 生理学 ====
*[[器官的神经调控]]
*[[内分泌整理]]
*[[脊椎动物的泌尿和生殖系统]]
*[[关于各种利尿剂的总结]]
*[[止血和凝血]]
*[[血型]]
*[[先天免疫系统]]
*[[哺乳动物的适应性免疫系统]]
*[[神经递质|中枢神经递质]]
*[[特殊呼吸型整理]]
*[[心功能曲线-血管功能曲线]]
*[[肾脏与酸碱平衡]]
*[[载体蛋白和通道蛋白]]
*[[BCR和TCR]]
*[[“小体”s]]
*[[抗抑郁药]]
*[[致幻剂]]
*[[阿片受体与中枢镇痛药]]
*[[麻醉剂大汇总]]
*[[前列腺素]]
*[[昆虫激素整理]]

==== 生态学 ====
*[[生态学人名规律整理]]
*[[生物的地理分区]]
*[[生物多样性]]
*[[种群大小的测定]]
*[[各种生态系统特征]]
*[[Gloger 规则]]
*[[隔离因素的分类]]
*[[生态学小汇总（1）]]

==== 动物行为学 ====
*[[动物行为学术语]]
*[[常用动物行为学实验方法]]
*[[人名拟态的典例整理]]

=== 第四部分：遗传学、演化生物学、生物信息学 ===

==== 遗传学 ====
*[[表观遗传疾病]]
*[[染色体结构与结构变异]]
*[[各种显性隐性常染性连锁遗传疾病总结|各种显性隐性常染性连锁遗传病总结]]
*[[表观遗传学]]
*[[数量性状的遗传效应]]（未完成）

==== 演化生物学 ====
*[[系统发育学]]''（基本完成）''
*[[初级内共生新知]]
*[[构建系统发生树常用方法]]
*[[分类:生物|index]] [[进化生物学与古大陆变迁]]''（未完成）''
*[[类人群星闪耀时——古人类们]]
*[[显生宙演化]]

==== 生物信息学 ====

* [[比对算法]]
* [[生物信息数据库及工具简介整理]]
* [[基因组结构变异的检测方法]]

Bio index

2025-08-27T11:30:52Z

Magezeya：

距离2026年联赛还有{{Countdown|2026-5-10|text=天}}

== 问题页面 ==

=== · '''[[提出你的问题]] ''' ===

=== '''· [[幻想乡问题精选]] ''' ===

=== '''• [[愿程二群Q&A整理]]''（未完成）''''' ===

=== '''· 网站使用说明：[[Osm使用手册]]''（欢迎提问，随时可能补充）''''' ===
==任务==

=== 编辑意向的任务 ===
* [[S]]
* [[无纸化学习]]（需要进行长期补充，希望看见的可以进来看看，补充）
* [[植物命名法]]（未完成）
* [[距佬|花距的物种分布和结构来源]]（''未完成''）
* [[生理学毒素和特异性阻断剂]]（''未完成''）
* [[无脊椎动物比较]](''未完成'')
* [[无脊椎动物系统比较]]''（未完成）''
* [[心电图及各种疾病时的变型]]''（未完成）''
* [[被子植物各科介绍]]''（未完成）''

*[[两栖动物的皮肤及其衍生物]]''(未完成）''
*[[2023诺贝尔生理学或医学奖简介]]''(未完成）''
*[[生物信息数据库及工具简介整理]]''（未完成）''
*[[报告基因整理]]''（未完成）''
*[[糖酵解]]''（未完成）''
*[[细胞死亡方式整理]]''（未完成）''
*[[重要的同源器官]]''（未完成）''
*[[RNA的生物合成]] ''(未完成)''
*[[金属酶]] ''（未完成）''
*[[关于Histidine]] ''（未完成）''
*[[组织学与胚胎学]]''（未完成）''
*[[常见序列整理]]（未完成）
* [[类人群星闪耀时——古人类们]]''（基本完成)''
* [[核酸酶整理]]''（未完成）''
* [[模式生物相关知识]]''（未完成）''
* [[关于锥虫二三事]]''（未完成）''
* [[前列腺素]]''（未完成）''
* [[各种脂肪酸的俗称及对应命名总结]]''（未完成）''
* [[常见受体阻断与激动剂]]''（未完成）''
* [[昆虫口器类型总结]]''（接近完成）''
*[[植物的同源器官及变态演化]]''（未完成）''
*[[中文重名的生物学定义]]''(未完成）''
*[[诸子百家-进化论的形成]]''（未完成）''
*[[昆虫激素整理]]''（未完成）''
*[[生态学小汇总（2）]]''（正在加班补充中）''
*[[胎座表格|胎座表格''（未完成）'']]
*[[生理学计算汇总]]''（现有问题：无法引入公式）''
*[[人名疾病整理]]''（待编辑，欢迎大家补充）''
*[[生物统计漫谈]]''（未完成）''
*[[果实]] （未完成）

==现有条目==

*[[特殊:孤立页面|特殊:孤立页面（没有被双向链接的条目）]]

=== 永远<s>填坑</s>更新的页面 ===

* [[教材错误与矛盾]]''（未完成）''
* [[动物中首次出现的结构]]''（未完成，希望大家共同来填～）''
* [[绝对化表述：所有&一切&任何都]]''（未完成）''
* [[常见动物生理学抑制剂整理]] ''(未完成)''
* [[生物缩写]]''（未完成）''
* [[文献阅读分享]]（''怎么没人编辑😢''）文献读的有A佬这么多的还是太少了。
* [[查阅资料|查阅资料的网站]] （未完成）

=== 外文教材翻译 ===
* [[Invertebrates Fourth Edition 译文版]]
* [[Invertebrates（Brusca）Fourth Edition 重制版]]
* [[Vertebrates:Comparative Anatomy,Function,Evolution]]
* [[An Introduction to Behavioural Ecology]]
* [[BERNE & LEVY 生理学第八版]]
* [[Guyton&Hall 生理学第十四版]]
* [[免疫系统工作原理（第七版）]]
* [[Molecular Biology of the Cell]]
* [[Molecular Population Genetics]]
* [[Plant systematics|Plant Systematics]]
* [[Plant Physiology and Development, Seventh Edition (Lincoln Taiz）]]
* [[Taiz的WEB TOPIC]]
* [[Anoxygenic Phototropic Bacteria]]
* [[Animal eyes]]
* [[Esau's Plant Anatomy]]
* [[POPULATION GENETICS 第二版]]
* [[蚯蚓的形态学|蚯蚓的形态学（《Biology and Ecology of Earthworms》）]]

=== 生物学综合 ===

==== 公告栏 ====
*[[OSM生物刊]]

==== 生物学基础 ====
*[[生物之最]]

*[[生物口诀学]]
*[[常见数值]]
*[[十分钟读完基础物理化学]]
*[[模式生物的种名]]
*[[Strange but True]]
*[[中国外来入侵物种名单]]

* [[生物网站]]
* [[生物学英文名词词根词缀整理]]

==== 题目 ====
*[[全国中学生生物学联赛试题|全国中学生生物学联赛试题及答案（2000-2024）]]
*[[共同出题（旨在收集平时散出的题，你要是喜欢也可以泡在这里出题）]]

==== 非正式生物竞赛内容 ====
*[[生竞梗百科是什么梗|生竞梗百科]]
*[[生竞巨佬闪耀时]]
*[[笑话数则]]
*[[西洋笑传之阉鸡、骟马、歌唱巨星]]
*[[全F主义]]
*[[【非正式】deepseek浅谈生竞判断题填涂策略期望得分]]
*[[生竞·警示录]]
*[[类人流星闪耀时|流星下的许愿墙]]
*[[那些你最想做的事]]
*[[联赛题预测]]
*[[联赛分数与排名对应表]]
*[[如何评判大改革后的第一次联考-论2025年联赛]]
*[[生竞回忆墙]]
*[[金厕纸杯试卷大赛]]
*[[吐槽2025年联赛]]
*[[无题]]
*[[无纸化学习]]

==== New Ideas ====

* [[混沌学摘录]]
* [[瓜的小论]]
* [[苟书纠错与存疑]]

=== 第一部分：生物化学、分子生物学、细胞生物学、生物技术 ===

==== 生物化学 ====
*[[氨基酸性质整理]]
*[[磷酸戊糖途径和卡尔文循环之间的联系|磷酸戊糖途径和卡尔文循环的联系]]
*[[生化代谢产能分析]]
*[[生化过程抑制剂整理]]
*[[脂质代谢]]
*[[酶]]
*[[酶动力学作图]]
*[[颜色反应]]
*[[C/D/E-DNA]]
*[[TCA回补反应]]
*[[生物化学中的"20"与"7"|生物化学中的"20"、"7"与“12”]]
*[[Sanger测序]]
*[[维生素与辅酶]]
*[[血红蛋白与Hb相关疾病]]
*[[元素追踪]]
*[[兼职蛋白]]
*[[从PPi学生化|从ppi学生化]]
*[[泛素相关知识]]
*[[糖]]
*[[TCA的C去向]]
*[[所以我们这么辛苦生产NTP是为什么]]

==== 分子生物学 ====
*[[DNA聚合酶]]
*[[调控RNA]]
*[[DNA解链酶]]
*[[RNA的生物合成]]
*[[复制叉反转]]
*[[拓扑异构酶]]
*[[核酸酶整理]]

==== 细胞生物学 ====
*[[癌]]
*[[细胞染色带型整理]]
*[[糖基化区分]]
*[[细胞同步化方法]]
*[[mTOR的性质]]
*[[细胞因子和细胞因子受体|细胞因子]]
*[[G蛋白偶联受体及其信号转导|信号转导I：G蛋白偶联受体]]
*[[酶联受体及其信号转导|信号转导II：酶联受体]]
*[[其他受体及其信号转导|信号转导III：其他受体]]（未完成）
*[[内膜系统运输]]
*[[细胞间连接]]
*[[核受体]]
*[[红细胞的膜骨架]]
*[[溶酶体疾病和过氧化物酶体疾病]]
*[[Hippo信号通路]]
*[[14-3-3蛋白]]
*[[各细胞组分标志酶]](未完成)
*[[凋亡的特征和分子标记]]
*[[减数分裂驱动]]
*[[第四种细胞骨架]]
*[[有关核孔运输的迷思]]
*[[脂质的膜内/膜间转运]]
*[[内质网的细胞生物学]]
*[[关于各种通道/受体]]
*[[阿尔兹海默症]]

==== 生物技术 ====
*[[各种工具酶]]
*[[生物学实验技术手册v1.0]]
*[[生化分子细胞技术列表]]
*[[蛋白质含量测定]]
*[[CRISPR-Cas系统及相关技术]]
*[[离心相关总结]]
*[[快速反应技术]]
*[[western blot条带结果分析整理]]
*[[电泳染色方法]]''（未完成）''

=== 第二部分：植物学、植物生理学、微生物学 ===

==== 植物学 ====
*[[APG IV]]
*[[植物命名法]]
*[[被子植物各科介绍]]
*[[藻类分类整理]]
*[[藻类生活史总结]]
*[[裸子植物]]
*[[苔藓植物]]
*[[花]]
*[[维管植物的结构]]
*[[蔬菜水果的食用部分总结]]
*[[自交不亲和]]
*[[无融合生殖]]
*[[好玩但不考的植物学知识]]
*[[柿树科]]
*[[植物学表格知识]]
*[[种子]]
*[[果实]]
*[[胎座表格]]
*[[苔藓总结]]
*[[距佬|花距的物种分布和结构来源]]
*[[植物演化]]''（未完成）''
*[[图注缩写对照]]

==== 植物生理学 ====
*[[植物生长物质整理]]
*[[植物激素一表览]]
*[[植物矿质元素整理]]
*[[植物抗逆生理整理]]
*[[植物的矿质生理学]]
*[[植物的水生理学]]
*[[植物细胞水势整理]]
*[[植物常见氧化酶总结]]
*[[环境因素对植物发育的影响]]
*[[植物激素演化]]
*[[红光受体]]
*[[蓝光受体]]
*[[C4途径]]
*[[各种特殊的光合作用总结]]
*[[叶黄素循环]]

==== 微生物学 ====
*[[常见抑制剂整理|常见抗生素抑制剂整理]]
*[[与人有关的病毒]]
*[[病毒分类整理]]
*[[病毒的结构]]
*[[低等真核生物]]
*[[衣原体]]
*[[细菌染色法]]
*[[各种染料和染色的总结]]
*[[培养基总结]]
*[[转染菌种特性]]
*[[细菌vs.古菌vs.真核]]
*[[细菌常见贮藏物整理|细菌常见包含体整理]]
*[[污水处理]]
*[[细菌的营养类型]]
*[[酵母的小菌落]]

=== 第三部分：动物学、生理学、生态学、动物行为学 ===

==== 动物学 ====
*[[原生动物门]]''（已基本完成，欢迎大家来补充）''
*[[寄生动物总结]]
*[[总鳍鱼整理]]
*[[论证于脊椎动物到底是怎么个进化路线]]
*[[脊椎动物的中枢神经]]
*[[动物学人名结构整理]]
*[https://life.scnu.edu.cn/biology/jingpin/dwx/course_learn/chapter_20/chapter_2/learn/default.htm 动物地理区系划分]
*[[肺鱼特征整理]]
*[[辅助呼吸器官]]
*[[鸟的趾整理]]
*[[鸟类分目比较]]
*[[无脊椎动物比较]]
*[[脊椎动物的心脏]]
*[[昆虫的外部解剖]]
*[[昆虫的变态整理]]
*[[昆虫特征分类]]
*[[昆虫的标本制作]]''（基本完成）''
*[[脊椎动物的皮肤]]
*[[脊椎动物的骨骼系统]]
*[[脊椎动物的循环系统]]
*[[脊椎动物的呼吸系统]]
*[[脊椎动物的中枢神经]]
*[[丢失的五脏六腑]]
*[[蛇|蛇的重要考点]]
*[[脑神经整理|人脑神经整理]]
*[[百背不记的始祖鸟]]
*[[卵裂]]
*[[昆虫的复眼]]
*[[最非凡的心脏——潘氏孔相关释疑]]
*[[羊膜卵/胚胎概述]]
*[[脊椎动物的牙齿类型]]
*[[脊比笔记：循环系统]]
*[[动物的各种“式”]]''（望补充完善！）''

==== 生理学 ====
*[[器官的神经调控]]
*[[内分泌整理]]
*[[脊椎动物的泌尿和生殖系统]]
*[[关于各种利尿剂的总结]]
*[[止血和凝血]]
*[[血型]]
*[[先天免疫系统]]
*[[哺乳动物的适应性免疫系统]]
*[[神经递质|中枢神经递质]]
*[[特殊呼吸型整理]]
*[[心功能曲线-血管功能曲线]]
*[[肾脏与酸碱平衡]]
*[[载体蛋白和通道蛋白]]
*[[BCR和TCR]]
*[[“小体”s]]
*[[抗抑郁药]]
*[[致幻剂]]
*[[阿片受体与中枢镇痛药]]
*[[麻醉剂大汇总]]
*[[前列腺素]]
*[[昆虫激素整理]]

==== 生态学 ====
*[[生态学人名规律整理]]
*[[生物的地理分区]]
*[[生物多样性]]
*[[种群大小的测定]]
*[[各种生态系统特征]]
*[[Gloger 规则]]
*[[隔离因素的分类]]
*[[生态学小汇总（1）]]

==== 动物行为学 ====
*[[动物行为学术语]]
*[[常用动物行为学实验方法]]
*[[人名拟态的典例整理]]

=== 第四部分：遗传学、演化生物学、生物信息学 ===

==== 遗传学 ====
*[[表观遗传疾病]]
*[[染色体结构与结构变异]]
*[[各种显性隐性常染性连锁遗传疾病总结|各种显性隐性常染性连锁遗传病总结]]
*[[表观遗传学]]
*[[数量性状的遗传效应]]（未完成）

==== 演化生物学 ====
*[[系统发育学]]''（基本完成）''
*[[初级内共生新知]]
*[[构建系统发生树常用方法]]
*[[分类:生物|index]] [[进化生物学与古大陆变迁]]''（未完成）''
*[[类人群星闪耀时——古人类们]]
*[[显生宙演化]]

==== 生物信息学 ====

* [[比对算法]]
* [[生物信息数据库及工具简介整理]]
* [[基因组结构变异的检测方法]]

讨论:Osm使用手册

2025-08-26T09:25:47Z

Magezeya：

这是签名的效果示例
--这个是一个签名 2025年8月26日 (二) 17:25 (CST) 2025年8月26日 (二) 17:24 (CST)
<br>值得注意的是，这个签名不想模板一样，会随着你在个人的页面进行的修改而改变，一旦保存则替换成你此时的签名，并且变成可供编辑的状态。也是我这个示例的原理。

讨论:Osm使用手册

2025-08-26T09:24:00Z

Magezeya：

这是签名的效果示例
--magezeya留言 2025年8月26日 (二) 17:24 (CST)

Osm使用手册

2025-08-26T09:23:34Z

Magezeya：/* 签名 */

出于新用户越来越多，我想大家可能需要一个''使用手册''来更快地融入环境。本手册目前仅涉及页面编辑的技术操作相关，关于纪律规范等需更多用户共同协定以及由站长/管理员公示。

相关使用经验，欢迎补充/参与讨论！

== 页面概述 ==

=== 内容页 ===
此类页面无前缀（前缀包含“用户：”“特殊：”“文件：”等，可在网址中看到）。目前允许任何用户编辑。可可视化编辑或源代码编辑。

内容上包括生竞知识/提问/题目/梗/人物志等。其中在首页上分生物（[[Bio index]]）、化学（[[Chem index]]）两栏，在Bio index中未完成的页面大多置于“编辑意向的任务”，已完成的页面大多以联赛四部分-具体学科分类放置。

=== 用户页 ===
此类页面有前缀“用户:”，相当于个人空间。

实际上编辑用户页面是给别人留言的方式。只不过留言会被公开。被留言的人是会收到通知的。

=== 特殊页 ===
此类页面有前缀“特殊:”，无法编辑。见下文“特殊页面”。

将孤立页面链接到已有页面是整理工作之一。

''提示：在[[特殊:孤立页面|孤立页面]]中经常能淘到很多好货！（''

=== 文件页 ===
此类页面有前缀“文件:”，为用户上传的文件。可在[[特殊:新建文件]]中浏览。

=== 讨论页 ===
此类页面只能使用源代码编辑。每个页面附有其相应的讨论页（需创建），用于讨论页面内容而不修改页面正文。

讨论经常有大佬出没。

== 页面编辑 ==

=== 修改页面 ===
需先登录，在整个网页的右上角（若未创建账号，也在那处）。点击页面右上角的“编辑”或“编辑源代码”即进入编辑页面；有标题的文章可点击标题右侧的“[编辑 | 编辑源代码]”进入编辑页面（能快速定位到标题，对于文章较长、编辑的内容仅涉及一两个标题内容较适用）。

电脑端与手机端内容一致，但电脑端操作更方便。

==== 可视化编辑 ====
点击页面右上角“编辑”进入。

“段落”：左侧第三个按键。进入可选择格式，如标题、段落等。'''使用标题会在页面开头自动生成一个目录'''，更方便定位，且在正文中标题右侧生成“[编辑 | 编辑源代码]”按键，便于编辑。

以下是特殊格式示例：
预排格式示例。
<blockquote>引用块示例。</blockquote>“''<u>A</u>''”：左侧第四个按键。进入可选择样式，如'''粗体；'''''斜体''；<sup>上标</sup>、<sub>下标</sub>；<code>代码</code>；<s>删除线</s>；<u>下划线</u>；字号<big>大</big>、正常、<small>小</small>（在同一分号内的不能同时应用）
“链接”：可添加osm内部链接或外部链接。
操作方法：
osm内部链接：在适当位置写入你想链接的页面的名字（或你想让它显示的文字）并选中，点击“链接”符号，在“osm&bio”中搜索并选择，若字符颜色变蓝就链接成功了。点击过的内部链接呈蓝紫色。
外部链接：在适当位置写入你想让链接页面显示的文字并选中，点击“链接”符号，在“外部链接”中输入链接页面的网址，若字符颜色变蓝且右侧有“类似于分享的小图标”就链接成功了。点击过的外部链接呈偏灰的紫红色。
“引证”：用于引用资料，示例<ref name=":0">参考资料内部可'''''<code><s><u><big><sup>修改</sup><sub>格式</sub></big></u></s></code>'''''、[https://osm.bio 链接网址]、插入其他内容等</ref>。当已有参考资料时便可“复用<ref name=":0" />”，即再使用已有的参考资料<ref name=":0" /><ref name=":0" /><ref name=":0" />。

“列表”：有无序列表与有序列表：

* 无序列表示例
* 示例
* 示例

# 有序列表示例
## 有序列表示例
## 有序列表示例
## 有序列表示例
# 有序列表示例
# 有序列表示例
“插入”：
“图像与媒体”：
法①：先在随便哪个页面，点击网页左侧“工具”下“[[特殊:上传文件|上传文件]]”，点进去后选择文件、改名并上传（适用于一切文件类型）；在你想插入文件的页面点击“插入-图像与媒体”在“您近期的上传”中选择该文件（仅适用于图像或媒体文件）。
法②：点击“插入-图像与媒体-上传”，直接上传文件（仅适用于图像或媒体文件）。
其他格式（如pdf）需按法①前半句上传文件后，以链接页面的方式链入（注意前缀为“文件:”）
“模版”''不常用但是非常强大，可以通过这个单独的条目进行学习 [[模板使用教程|链接]]''

“表格”：选中一格，在“属性”中可选择“可排序”、“可折叠”等（默认不排序不折叠；此处是一个不可排序、可折叠且初始时折叠的表格）

{| class="wikitable mw-collapsible mw-collapsed"
|+标题
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【续】
“注释”：示例
“图库”：''（个人不是很清楚，况且不常用）''
“代码块”：<s>正确用法是画画与搓公式</s>示例：
<syntaxhighlight lang="abap">
只是一个示例罢了……
/\___/\ ~
| ^ ^ |
（很不像的猫猫头（
</syntaxhighlight>

【续】
“参考资料列表”：所有参考资料，示例：
<references />

==== 源代码编辑 ====
点击页面右上角“编辑源代码”进入。需了解一些wiki格式（有关内容详见[[Editor|源代码编辑器简单介绍]]）。

=== 签名 ===
如果没有设置签名，则签名默认为灰色，请前往[[特殊:参数设置]]最下面，填写个人签名并保存。

然后在讨论页可以进行签名。请进入本页讨论页查看效果。

=== 自动化分类 ===
在源代码页面输入<syntaxhighlight lang="wikitext">
[[Category:具体分类]]
</syntaxhighlight>可以创建一个索引页面这样可以非常简单的分类一些相似的内容

=== 创建新页面 ===
[[文件:添加新页面.png|缩略图]]
可直接搜索想添加的页面的名称，点击红字，即进入创建页面（见右图）。可直接[[创建]]或[[创建源代码]]。

创建好后，'''不要忘记把它链接到它的父级页面'''（如[[首页]]、[[Bio index]]等），否则他人很难找到你创建的页面！

链接方法：编辑父级页面，在适当位置写入子级页面的名字（或你想让它显示的文字）并选中，点击“链接”符号，在“osm&bio”中搜索并选择，若字符颜色变蓝就链接成功了。

== 特殊页面 ==
此列举的是常用的特殊页面，全部特殊页面见[[特殊:特殊页面]]。<small>这里也能淘到很多好玩的东西（</small>

=== 最近更改 ===
网页左侧“[[特殊:最近更改|最近更改]]”。此处可以'''视监'''别人最近在改些什么页面（

=== 参数设置 ===
网页右上角“[[特殊:参数设置|参数设置]]”。有关你的账号。可更改密码、签名、邮件地址等。

=== 监视列表 ===
除特殊页面外的页面右上角有一个星星，点击后变蓝色即可监视该页面。点击进入网页右上角“[[特殊:监视列表|监视列表]]”可查看自己监视的页面是否更新。点击页面标题右侧“差异/n次更改”可查看你上一次看此页面距离现在的改动；点击右侧“历史”可以看每位用户的逐条改动以及所有历史版本。

=== 活跃用户列表 ===
[[特殊:活跃用户|活跃用户]]，你可以在此处查看哪些佬最近在活跃更新<s>（又是一个用来视监的好页面</s>

Osm使用手册

2025-08-26T09:22:38Z

Magezeya：

出于新用户越来越多，我想大家可能需要一个''使用手册''来更快地融入环境。本手册目前仅涉及页面编辑的技术操作相关，关于纪律规范等需更多用户共同协定以及由站长/管理员公示。

相关使用经验，欢迎补充/参与讨论！

== 页面概述 ==

=== 内容页 ===
此类页面无前缀（前缀包含“用户：”“特殊：”“文件：”等，可在网址中看到）。目前允许任何用户编辑。可可视化编辑或源代码编辑。

内容上包括生竞知识/提问/题目/梗/人物志等。其中在首页上分生物（[[Bio index]]）、化学（[[Chem index]]）两栏，在Bio index中未完成的页面大多置于“编辑意向的任务”，已完成的页面大多以联赛四部分-具体学科分类放置。

=== 用户页 ===
此类页面有前缀“用户:”，相当于个人空间。

实际上编辑用户页面是给别人留言的方式。只不过留言会被公开。被留言的人是会收到通知的。

=== 特殊页 ===
此类页面有前缀“特殊:”，无法编辑。见下文“特殊页面”。

将孤立页面链接到已有页面是整理工作之一。

''提示：在[[特殊:孤立页面|孤立页面]]中经常能淘到很多好货！（''

=== 文件页 ===
此类页面有前缀“文件:”，为用户上传的文件。可在[[特殊:新建文件]]中浏览。

=== 讨论页 ===
此类页面只能使用源代码编辑。每个页面附有其相应的讨论页（需创建），用于讨论页面内容而不修改页面正文。

讨论经常有大佬出没。

== 页面编辑 ==

=== 修改页面 ===
需先登录，在整个网页的右上角（若未创建账号，也在那处）。点击页面右上角的“编辑”或“编辑源代码”即进入编辑页面；有标题的文章可点击标题右侧的“[编辑 | 编辑源代码]”进入编辑页面（能快速定位到标题，对于文章较长、编辑的内容仅涉及一两个标题内容较适用）。

电脑端与手机端内容一致，但电脑端操作更方便。

==== 可视化编辑 ====
点击页面右上角“编辑”进入。

“段落”：左侧第三个按键。进入可选择格式，如标题、段落等。'''使用标题会在页面开头自动生成一个目录'''，更方便定位，且在正文中标题右侧生成“[编辑 | 编辑源代码]”按键，便于编辑。

以下是特殊格式示例：
预排格式示例。
<blockquote>引用块示例。</blockquote>“''<u>A</u>''”：左侧第四个按键。进入可选择样式，如'''粗体；'''''斜体''；<sup>上标</sup>、<sub>下标</sub>；<code>代码</code>；<s>删除线</s>；<u>下划线</u>；字号<big>大</big>、正常、<small>小</small>（在同一分号内的不能同时应用）
“链接”：可添加osm内部链接或外部链接。
操作方法：
osm内部链接：在适当位置写入你想链接的页面的名字（或你想让它显示的文字）并选中，点击“链接”符号，在“osm&bio”中搜索并选择，若字符颜色变蓝就链接成功了。点击过的内部链接呈蓝紫色。
外部链接：在适当位置写入你想让链接页面显示的文字并选中，点击“链接”符号，在“外部链接”中输入链接页面的网址，若字符颜色变蓝且右侧有“类似于分享的小图标”就链接成功了。点击过的外部链接呈偏灰的紫红色。
“引证”：用于引用资料，示例<ref name=":0">参考资料内部可'''''<code><s><u><big><sup>修改</sup><sub>格式</sub></big></u></s></code>'''''、[https://osm.bio 链接网址]、插入其他内容等</ref>。当已有参考资料时便可“复用<ref name=":0" />”，即再使用已有的参考资料<ref name=":0" /><ref name=":0" /><ref name=":0" />。

“列表”：有无序列表与有序列表：

* 无序列表示例
* 示例
* 示例

# 有序列表示例
## 有序列表示例
## 有序列表示例
## 有序列表示例
# 有序列表示例
# 有序列表示例
“插入”：
“图像与媒体”：
法①：先在随便哪个页面，点击网页左侧“工具”下“[[特殊:上传文件|上传文件]]”，点进去后选择文件、改名并上传（适用于一切文件类型）；在你想插入文件的页面点击“插入-图像与媒体”在“您近期的上传”中选择该文件（仅适用于图像或媒体文件）。
法②：点击“插入-图像与媒体-上传”，直接上传文件（仅适用于图像或媒体文件）。
其他格式（如pdf）需按法①前半句上传文件后，以链接页面的方式链入（注意前缀为“文件:”）
“模版”''不常用但是非常强大，可以通过这个单独的条目进行学习 [[模板使用教程|链接]]''

“表格”：选中一格，在“属性”中可选择“可排序”、“可折叠”等（默认不排序不折叠；此处是一个不可排序、可折叠且初始时折叠的表格）

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【续】
“注释”：示例
“图库”：''（个人不是很清楚，况且不常用）''
“代码块”：<s>正确用法是画画与搓公式</s>示例：
<syntaxhighlight lang="abap">
只是一个示例罢了……
/\___/\ ~
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（很不像的猫猫头（
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【续】
“参考资料列表”：所有参考资料，示例：
<references />

==== 源代码编辑 ====
点击页面右上角“编辑源代码”进入。需了解一些wiki格式（有关内容详见[[Editor|源代码编辑器简单介绍]]）。

=== 签名 ===
如果没有设置签名，则签名默认为灰色，请前往[[特殊:参数设置]]最下面，填写个人签名并保存。

=== 自动化分类 ===
在源代码页面输入<syntaxhighlight lang="wikitext">
[[Category:具体分类]]
</syntaxhighlight>可以创建一个索引页面这样可以非常简单的分类一些相似的内容

=== 创建新页面 ===
[[文件:添加新页面.png|缩略图]]
可直接搜索想添加的页面的名称，点击红字，即进入创建页面（见右图）。可直接[[创建]]或[[创建源代码]]。

创建好后，'''不要忘记把它链接到它的父级页面'''（如[[首页]]、[[Bio index]]等），否则他人很难找到你创建的页面！

链接方法：编辑父级页面，在适当位置写入子级页面的名字（或你想让它显示的文字）并选中，点击“链接”符号，在“osm&bio”中搜索并选择，若字符颜色变蓝就链接成功了。

== 特殊页面 ==
此列举的是常用的特殊页面，全部特殊页面见[[特殊:特殊页面]]。<small>这里也能淘到很多好玩的东西（</small>

=== 最近更改 ===
网页左侧“[[特殊:最近更改|最近更改]]”。此处可以'''视监'''别人最近在改些什么页面（

=== 参数设置 ===
网页右上角“[[特殊:参数设置|参数设置]]”。有关你的账号。可更改密码、签名、邮件地址等。

=== 监视列表 ===
除特殊页面外的页面右上角有一个星星，点击后变蓝色即可监视该页面。点击进入网页右上角“[[特殊:监视列表|监视列表]]”可查看自己监视的页面是否更新。点击页面标题右侧“差异/n次更改”可查看你上一次看此页面距离现在的改动；点击右侧“历史”可以看每位用户的逐条改动以及所有历史版本。

=== 活跃用户列表 ===
[[特殊:活跃用户|活跃用户]]，你可以在此处查看哪些佬最近在活跃更新<s>（又是一个用来视监的好页面</s>

用户讨论:Sofia

2025-08-26T09:19:30Z

Magezeya：

是新佬捏（喜）
自动索引机器，所以应该叫Index（

第十九章线虫动物：线虫动物门和线形动物门

2025-08-26T09:15:41Z

Magezeya：

第五章多孔动物门：海绵

2025-08-26T09:14:50Z

Magezeya：

[[文件:海绵的卵裂.jpg|缩略图|从上往下：Trichimella、Calciblastula、Amphiblastula、Cinctoblastula、Disphaerula、直接发育、Parenchymella；从左往右：卵裂阶段、囊胚阶段、形态发生阶段、幼虫阶段。]]

=== 繁殖与个体发育 ===
多数研究者认为海绵的原始卵裂形式是辐射卵裂，这种卵裂方式存在于许多寻常海绵中，即是其他的三个纲中都未见到辐射卵裂。还有三种全裂方式：混乱卵裂(chaotic)，又叫安那其(anarchic)卵裂[我超，安！]。混乱卵裂没有特定·的图式，看起来是随机的，是许多寻常海绵的特点。Table palintomy[暂未找到译名]，卵裂沟斜斜地穿过动物-植物轴，这存在于一些钙质海绵中（石灰海绵亚纲Calcaronea）。这种卵裂方式令人想起团藻[对，那个绿藻]和几种群体原生动物。然而，钙质海绵亚纲也有及其独特的翻转过程，使得一些研究者认为palintomy是一种异常的卵裂。多极卵裂Polyaxial cleavage是''Halisarca''属的特点，可能也是Calcinea (Calcarea)的特点。其以8细胞期至16细胞期之间形成垂直于表面的卵裂沟为特征，对称轴从中心以一定角度辐射出去。然而，16细胞期后，卵裂变为混乱的。

已经识别了七种幼虫：

Trichimella（六放海绵Hexactinellida）

Calciblastula（钙质海绵: 钙质海绵亚纲Calcinea）

两囊幼虫amphiblastula (钙质海绵: 石灰海绵亚纲Calcaronea)

cinctoblastula (同骨海绵纲Homoscleromorpha),

disphaerula (寻常海绵纲: Halisarcidae),

直接发育(寻常海绵纲、四射海绵目的Tetilla)

实胚幼虫parenchymella (大多数寻常海绵纲).

游泳的海绵幼虫（例如，两囊幼虫、cinctoblastula、实胚幼虫）前端具纤毛的一极推测对应于其他后生动物幼虫的动物极，正是这个幼虫区域产生了内部领细胞层，而后端的阿米巴样细胞产生了成体海绵的外层（扁细胞层）。

==== 钙质海绵纲 ====
据了解，所有钙质海绵都是胎生的。在钙质海绵亚纲中，卵母细胞在中胶层内发育并增大（通过吞噬邻近的变形细胞）。胚胎也在中胶层中发育，完全等裂产生腔囊胚。某些物种的腔囊胚有两种类型的细胞：具纤毛外部细胞和一两个后部颗粒细胞。在幼虫释放后，幼虫附着在基质之前，在某些物种中，一些细胞会失去纤毛并通过内移（ingression）进入囊胚腔。

在石灰海绵亚纲中，卵母细胞从领细胞分化并进入中胶层。经过一段时间的生长后，它们会迁移到海绵的外围。完全等裂，前三次分裂是经向的。第四次（至少在 ''Leucosolenia'' 中）是倾斜的，几乎与群体绿藻团藻''Volvox'' 中的卵裂完全相同——一种被称为table palintomy的卵裂（见上文）。由此产生的胚胎是一个杯状的囊胚，在最靠近领细胞层的一侧有一个小开口。虽然大多数细胞继续在同一方式分裂，形成单层上皮，但少数直接位于领细胞层下的细胞则不会;这些细胞仍然比其他细胞大得多，它们的细胞质充满了大卵黄颗粒。石灰海绵亚纲的胚胎最不寻常的特征是纤毛，它发生于小卵裂球上，伸入囊胚腔内部（其他海绵都伸向外部），这被称为 stomoblastula。为了抵达最终的取向，胚胎从内而外翻转过来。最后形成前部有纤毛细胞、后部有颗粒细胞、内部有富含营养的变形细胞的两囊幼虫。

==== 六放海绵纲 ====
32细胞期前是不同步的完全等裂，第一次经裂，第二次要么是赤道面卵裂equatorial，要么是旋转的rotational。16-32细胞期时，形成空心的囊胚。接下来的卵裂时不等的，形成小细胞排列在外部，大细胞富含卵黄排列在内部。大细胞不等卵裂，渐渐填充了囊胚腔，最后包被了外部的小细胞。很独特的，大细胞会互相融合，形成一个多核体，即新生的trabecular syncytium。小细胞保持分离，形成最后的领细胞；领细胞是多纤毛的，也和其他海绵不同。

==== 寻常海绵纲 ====
完全卵裂，相等或不等，往往是混乱卵裂，某些物种的卵裂球有大有小。小卵裂球产生纤毛，最终大小卵裂球分层，具纤毛的小细胞覆盖整个胚胎表面。这被称为多极分层multipolar delamination。这时可能是空心的或者实心的。

''Halisarca''属十分独特。完全缺乏骨针，有混合的发育途径。全部雌雄异体，胎生。完全等裂，空心囊胚。细胞通过单极和多极内移进入囊胚腔。外部细胞产生纤毛，内部细胞成为原细胞archaeocytes。此时的胚胎可以产生三种不同的幼虫（即使是同一个个体的子代）：第一个是个腔囊胚，单层细胞围绕着一个小腔。第二个是实胚幼虫，外部一层细胞，包裹着内部一团变形细胞。第三种具有两层上皮细胞，围绕着一个小腔，这种幼虫称为disphaerula。三种幼虫在外部有纤毛表示极性，以 left-handed方向旋转。

==== 同骨海绵纲 ====
同骨海绵是均黄卵isolecithal，rich in yolk inclusions，被一层来自亲本的内扁细胞和共生细菌包裹。全裂等裂，第三次后变得不规则，不同步，形成一个桑椹胚。64细胞期，外层分化。接近表面的卵裂球分裂变快，而内部的细胞迁移到表层，最后胚胎变成单层细胞，内部包裹着亲本细胞和共生细菌。细胞由内而外的迁移，不仅是海绵中独一份，在整个后生动物中也是独一份。这被称为multipolar egression多极外移。

同骨海绵的幼虫曾被称为两囊幼虫，因为他看起来一部分有纤毛，而另一部分没有，与真正的两囊幼虫类似；然而它们的形态发生完全不同，并且实际上是完全覆盖纤毛的。这种幼虫被称为cinctoblastula，描述了其细胞核内的类结晶体。这种类结晶体形成了围绕后端的一个环。观察过的幼虫都以left-handed方式旋转。

'''水沟系'''

* 单沟型：表层扁细胞直接特化为孔细胞，水经孔细胞直接进入中央腔，因为扁细胞内部有肌丝可以轻微的活动，所以孔细胞可以对水孔大小进行调节。
* 双沟型：单沟型海绵向外突出，于是外界凹进去的部分形成流入管，内部凹进去的部分形成辐射管（还有鞭毛室，鞭毛管等名）。进入辐射管的孔叫做前幽门孔，离开辐射管的孔叫做后幽门孔，双沟型后幽门孔直通中央腔。部分种群的中胶层发达，扁细胞增殖，导致整个海绵更肿大，最终形成一个更小的中央腔和更多的皮层孔，这有利于增大水流量。
* 复沟型：两个幽门孔变深形成前后幽门管，并具有中央细胞可以控制后幽门管的开闭，调节水量。皮层孔进一步发展，进而产生皮下腔。鞭毛室的总截面积更大，导致水流经鞭毛室的流速更低，便于领鞭毛细胞进食。中央腔挤压成管状，不唯一。

{{:Invertebrates Fourth Edition 译文版}}

{{学科分类}}

[[Category:动物学]]

第六章溯祖

2025-08-26T09:11:16Z

Magezeya：

== 模拟 DNA 序列样本 ==
为了准确推断影响分子变异的进化力量，我们必须能够准确模拟 DNA 序列。理想情况下，我们希望能够在各种模型、不同的人口历史、选择形式和强度以及任何其他感兴趣的参数下模拟种群。此类模拟的结果应该是 DNA 序列样本，相当于我们从自然种群中收集的样本。这个过程重复了数千次，然后可以用来找到最适合我们观察到的数据的模型，或者作为零分布，我们可以用它来测试特定的假设。

我们如何模拟这样的种群？最直接的方法是，从大量二倍体个体（相当于我们想要模拟的种群规模）开始，这些个体根据我们选择的种群模型进化。我们将对适当长度的序列（可能等于我们希望与模拟进行比较的 DNA 序列的长度）应用突变和重组，同时进行交配和任何可能的自然选择。然后，该系统必须运行多代，至少直到种群达到平衡，最后需要从种群中抽取少量染色体以创建一个模拟数据集。为了生成数千个独立模拟的样本，这个过程必须运行数千次。这个过程通常被称为正向模拟，因为它从最初相同的种群开始向前进行。

从上面的描述中可以明显看出，这种方法非常低效：我们只想知道样本的属性，但我们正在跟踪整个种群。为了解决这种低效率问题，几位数学遗传学家独立提出了后来被称为合并过程的方法（Kingman 1982a、1982b、1982c；Hudson 1983a；Tajima 1983）。合并过程的核心是，我们可以根据生成谱系间关系集（系谱）的简单规则来生成 DNA 序列样本。这些规则使我们能够生成具有几乎任何人口历史的样本，而无需模拟整个种群。由于该过程从现在开始并向后运行，因此被称为向后模拟。如今，有许多软件包可用于执行合并模拟（表 6.1）。

由于合并过程仅考虑样本而不是整个种群，因此它可以成为生成大量模拟数据集的一种非常有效的方法，但它也存在自身的局限性，无论是生物学还是计算上的。从生物学上讲，合并是模型的模型：也就是说，它是 Wright-Fisher 或 Moran 种群（尽管非常好）的近似值，而 Wright-Fisher 或 Moran 种群本身是自然种群的近似值。合并的一个关键假设是样本大小 n 比有效种群大小 Ne 小得多。违反这一假设可能会导致对种群过程的误导性推断（例如，Wakeley 和 Takahashi，2003)。虽然可以修改标准合并器以更精确地匹配 Wright-Fisher 模型并放宽 n << Ne 假设，但这种修改会导致算法速度降低 (Fu 2006)。从生物学角度来看，更重要的是，合并器仅从没有自然选择的种群中生成少量随机染色体样本。它不是对整个种群的模拟，因此无法提供除样本属性之外的任何结果。尽管模拟合并器的方法 w尽管选择方法一直在改进（例如，Spencer 和 Coop 2004；Teshima 和 Innan 2009；Ewing 和 Hermisson 2010；Kern 和 Schrider 2016），但可以建模的选择形式仍然有限。

从计算角度来看，当计算机处理器速度和内存资源有限时，合并器提供的优势更为重要，而这已不再是一个问题。技术发展使得合并器的效率变得不那么重要，除非在使用贝叶斯采样方法的应用中（参见第 9 章）。然而，最重要的是，当模拟基因组的非常大的区域或具有非常高重组率的区域时，合并器会变得非常低效，以至于无法使用它来建模当前正在收集的数据集。解决这个问题的一个办法是发明近似合并方法，该方法基于在沿着 DNA 片段移动时生成相关谱系，而不是为整个区域生成一个大谱系（Wiuf 和 Hein 1999）；因此，它们是横向模拟。这些方法更正式地称为顺序马尔可夫合并 (SMC) 模型（McVean 和 Cardin 2005；Marjoram 和 Wall 2006），并且有多个程序可以执行它们（表 6.1）。SMC 模型已经变得非常有用，但它们与自然种群的距离甚至更大：它们是模型的模型的模型！

在未来，正向模拟可能会成为此类方法中最广泛使用的方法。越来越多的快速灵活的正向模拟器可以在许多不同的自然选择形式和许多不同的人口历史下对非常大的基因组区域进行建模（表 6.1）。计算技术的进步使这些方法更加可行，而 DNA 测序技术的进步可能使它们成为必要。

虽然到目前为止，我只介绍了合并算法作为生成样本的算法，但这种方法有许多重要用途（请参阅 Hein、Schierup 和 Wiuf 2005 和 Wakeley 2009 以获得良好的概述）。合并算法为我们提供了一种概率建模谱系的方法，因此为分子群体遗传学中的各种结果提供了预期。这些预期中的许多都用于本书的后面章节。合并算法还为我们提供了一个从谱系角度思考的框架，因此可以让我们深入了解我们采样的 DNA 序列之间的潜在关系。这个框架对于直观地了解种群遗传过程非常有帮助，因此在本章的其余部分，我将讨论中性联合谱系的基础知识，并解释联合谱系的一些最重要的方面。在后面的章节中，我们将研究自然选择和非平衡人口历史对某个基因座谱系的影响。

== 模拟溯祖 ==

=== 溯祖谱系 ===
来自一个种群的任何同源染色体样本都以某种方式相关：也就是说，它们在最近的过去都有共同的祖先。一些序列可能比其他序列更紧密相关，但随着时间的推移，它们最终都拥有共同的祖先。如果我们将上述向前时间模拟想象为 Wright-Fisher 种群模型，那么在最近一代中采样的任何染色体集合都将在某个基因座处具有一组特定的关系，我们称之为谱系（图 6.1；有时这些被称为基因谱系，即使该基因座不是基因）。回溯到过去，两个在特定世代中拥有共同祖先的序列被称为融合成一个谱系；向前看，这个融合事件代表一个染色体产生两个子染色体。目前，我们只考虑单个种群中没有重组和选择的单倍体个体，Hudson（1990）称之为“典型的普通单倍体物种”。个体中的 N 个二倍体可以通过随机连接 2N 对单倍体形成。最终，所有谱系合并为一个序列 — 即我们样本最近的共同祖先的染色体。

合并是一种生成与我们的样本染色体相关的谱系的方法。通过反复运行向前时间的 Wright-Fisher 模拟形成的谱系可以用一组非常简单的规则来近似，这些规则将概率放在合并事件之间的时间长度上，然后可以将其转换为一组由谱系表示的关系。我们可以在生成的谱系树上随机放置突变，并在底部读取相当于 DNA 序列的内容。这两个步骤（生成树、添加突变）实际上就是为我们提供一组近似于从 Wright-Fisher 群体中采样的序列所需的全部步骤。接下来我将更详细地描述这些步骤。生成合并谱系的一种直接方法基于一个简单的近似值。如果我们用连续近似值替换 Wright-Fisher 模型中使用的离散代，那么距离下一个合并事件的时间就是从指数分布中抽取的随机变量。该指数分布仅由可能合并的剩余谱系数量参数化，这意味着当谱系数量较多时（例如，朝向树的尖端），合并事件之间的时间较短，而当仅剩下最后两个谱系时，合并事件之间的时间最长。使用指数分布，我们现在可以写下五个简单的步骤来为样本生成谱系

1. 从 i = n 条染色体开始。

2. 从参数为 x = i(i − 1)/2 的指数分布中选择下一次合并的时间。

3. 随机选择两条染色体

4. 合并所选的两个谱系

并设置 i → i − 1。

5. 如果 i > 1，则转到步骤 2；如果不是，则停止。

例如，图 6.2 显示了按照上述步骤生成的一个可能的谱系，其中 n = 5。从 i = n = 5 开始，该过程选择两个谱系进行合并，此时 i = 4，发生另一个合并事件，i = 3，依此类推。每次运行此过程时，都会创建一个略有不同的谱系，如图 6.3 所示。要生成具有非平衡种群历史的树，我们需要调整合并事件之间的时间，但这些转换相对简单（参见第 9 章），并且生成的树可以以相同的方式解释。这棵树中的时间以 N 代为单位（单倍体模型）、2N 代为单位（二倍体模型），有时甚至以 4N 代为单位（为方便起见）。
[[文件:MPG-6.3.png|居中|缩略图|图 6.3 大小为 n = 5 的合并谱系的高度和拓扑变化。每棵树都是从完全相同的种群中独立生成的谱系。模拟是在 discoal 中进行的（Kern 和 Schrider 2016）。]]
图 6.2 样本大小为 n = 5 的合并谱系示例。合并事件之间的时间 Ti 相当于谱系中有 i 个谱系的时间量。

合并谱系的构建<u>完全独立于突变的存在与否</u>。无论是否存在区分它们的突变，染色体之间都存在一组关系。这意味着我们可以在第二步将突变应用于我们的谱系，而这不依赖于我们的谱系构建方式的细节，尽管突变的数量和位置可能取决于树。这种独立性还使我们能够在任何突变模型（无限位点、无限等位基因等）下使用任何类型的突变（SNP、indel、转座因子等）。

有两种方法可用于将突变置于谱系中。第一种方法称为'''固定 S 法 fixed-S method'''（Hudson 1993），通过在树上放置预定数量S的突变来进行。此方法可用于直接比较具有一定数量分离位点的样本和具有相同数量变体的模拟谱系。当研究除多态性水平以外的某些变异方面（例如等位基因频谱）时，这些类型的比较最为常见。由于分离位点的数量是预先指定的，<u>我们只需将 S 突变随机放置在树的分支上，概率与分支长度成比例。</u>

当最初未指定 S 时，使用第二种方法：在这种情况下，我们需要使用种群突变参数θ（二倍体中常染色体基因座 =4Nμ）生成要放置在树上的突变数。使用 t 表示谱系中任何特定分支上的时间，每个分支的突变数呈泊松分布，平均值为 t * θ/2。在这里，我们将突变的生成与它们在树上的位置结合起来：使用这种方法，较长的分支将再次具有更多的突变，因为更多的突变将在较长的时间段内出现。为了计算简单，我们还可以对树中的所有时间 Ttotal 求和，首先从泊松分布中绘制突变ution，其平均值为 Ttotal<nowiki>*</nowiki> θ/2 ，然后像在固定 S 方法中所做的那样，将它们全部随机“扔”到树上。

图 6.4 显示了具有四条染色体和六个突变的联合谱系。如前所述，这些突变可以代表任何突变模型下的任何事件；然而，为了简化讨论，让我们将它们视为无限位点模型下产生的单核苷酸多态性。为了将这些突变变成类似于 DNA 序列的东西，我们从四条染色体中每条染色体的长度 L = 6 的序列开始，最初将每个位置设置为 0（祖先状态）。然后，我们将每个突变沿树向下传播，这样，如果所有后代谱系继承了等位基因的突变版本，它们都会收到 1。图 6.4 中每个样本下方的字符串显示了结果序列，位置对应于树中从左到右、从上到下编号的突变的字符串。请记住，我们仍在处理非重组位点，请注意，比对中的突变顺序没有任何暗示，尽管在本章后面我们将考虑重组的影响，此时顺序很重要。可以看出，发生在谱系外部分支上的突变会导致单例突变，而靠近根部的突变通常会在样本中更多的个体中发生。然后可以像任何 DNA 或蛋白质序列一样处理此过程产生的“序列”，每个 0/1 位点代表祖先/衍生的等位基因。

图 6.4 将突变置于合并谱系中。六个突变被随机放置在左侧的合并谱系中。从由序列 [0, 0, 0, 0, 0, 0] 表示的祖先开始，衍生的等位基因由从 0 → 1 的变化表示。底部的序列代表结果单倍型，也显示在右侧的比对中。比对中突变的顺序没有意义。

=== 谱系和系统发育 ===
虽然合并谱系在许多方面类似于典型的系统发育树，但这两种类型的树之间存在非常重要的区别。从一个种群中采集的样本彼此之间通过一些未知的谱系相关。事实上，描述样本间关系的树通常是未知的，几乎不可知：即使没有突变区分我们的样本，仍然有一个谱系树。我们绝不会试图从等位基因的身份推断出树，就像在系统发育学中所做的那样，或者在为物种内的线粒体 DNA 或 Y 染色体单倍型构建“基因树”时所做的那样。此外，正如下面将更详细讨论的那样，在重组的情况下，基因座中的每个核苷酸位置实际上可能存在不同的谱系，甚至排除了推断单个树的可能性。相反，上面提出的合并算法会生成这些染色体之间的一组可能的关系，这些关系可能与我们的样本完全匹配，也可能不完全匹配。合并的明确目的之一是生成许多不同的谱系，有效地将树视为必须平均的干扰参数。染色体间的关系集本身就是数据集中变异的原因，这一观点突出了合并过程中以及任何分子数据集中的两个随机性来源：由关系集（即谱系）采样引入的方差和由具有任何给定关系集的染色体组采样突变引入的方差。回顾我们用于进行合并模拟的两个步骤（生成树、添加突变），这些变异来源显而易见，每个步骤都具有重要的随机性元素。通常，这两个随机性来源分别称为进化方差和抽样方差。使用显式假设检验时，了解我们必须考虑哪些变异来源以及哪些可以忽略非常重要（参见第 7 章和第 8 章）。

== 理解合并 ==

=== 重要的谱系数量 ===
到目前为止，讨论还没有触及合并的数学基础，也没有触及合并谱系的不同方面究竟如何影响分子多样性的测量。虽然对合并的深入理论理解超出了本书的范围，但下面我将讨论四种数学谱系描述，这些描述至少应该能阐明合并和种群遗传过程之间的联系。

'''合并事件的概率''' 在任何给定的一代中，显然要求每条染色体在前一代中都有一个祖先（图 6.1）。如果没有自然选择，当前代的每个染色体都可以随机选择一个祖先；或者，我们可以说，上一代的每个染色体都有相同的概率成为当前代中给定染色体的父代。在 Wright-Fisher 群体中，大小恒定为 2N，这意味着有 2N 个可能的祖先可供选择，每个祖先被选中的概率为 1/2N。回想一下，当两个个体选择同一个祖先时，就会发生合并事件，对于任何特定的一对染色体，其概率为 1/2N：也就是说，以一对染色体中的一个选择祖先序列为条件，第二个染色体有 1/2N 的概率选择相同的序列。如果我们有一个大小为 n 的样本，那么就有 n(n − 1)/2 对可能的序列可以选择上一代中的同一个祖先。一般而言，在过去的任何一代中，对于 i 个谱系，有 i(i − 1)/2 个可能的配对可以以 1/2N 的概率选择相同的祖先。因此，在一代中发生任何合并事件的概率（即从 i 到 i − 1 个谱系的概率）是这两个项的乘积：

[[文件:MPG--6.1.png|无框]]

<u>此概率假设在任何一代中最多有两个染色体可以选择相同的祖先，这一假设与 n << N 的要求密切相关。</u>我们将在下一节中看到单个合并事件的概率如何导致进一步的洞察，但现在请注意，公式 6.1 意味着在给定的一代中，样本谱系的数量越多，发生合并事件的可能性就越大。

'''合并事件之间的时间''' i 个谱系之间发生合并事件的概率可以直接告诉我们 i 个谱系的预期持续时间。任何特定代中，在剩余 i 个谱系的情况下，均不会发生合并事件的概率为 1 – P(i → i − 1)。如果没有发生合并事件，则前一代中发生合并事件的概率为 P(i → i − 1)，不发生合并事件的概率为 1 − P(i → i − 1)，依此类推。因此，合并发生的预期平均等待时间（即从 i 到 i − 1 个谱系所需的时间）——此处称为 Ti（图 6.2）——由指数分布近似，其平均值是公式 6.1 的倒数：

[[文件:MPG--6.2.png|无框|231x231像素]]

正如谱系数量越多，发生合并事件的概率越高一样，公式 6.2 表明合并事件之间的时间越短。这意味着，例如，<u>从 10 个谱系到 9 个谱系的时间将比从 5 个谱系到 4 个谱系的时间要小得多</u>（例如，图 6.3）。平均而言，合并事件之间的时间在树的尖端最短，而在等待最后两个谱系合并为整个样本的最近共同祖先 (MRCA) 时最长。

'''合并谱系的高度''' 我们可能对样本中每个谱系合并为单个谱系（MRCA）之前的预期时间感兴趣。因为我们知道从i → i − 1、i − 1 → i − 2、i − 2 → i − 3、…、2 → 1 的预期等待时间为 Ti，Ti-1，Ti-2，Ti-3，……，T2。通过将这些时间相加来确定平均树高：

[[文件:MPG--6.3.png|无框]]

对于两个染色体的样本，公式 6.3 表示树高（到最近共同祖先的时间）平均为 2N 代。随着样本量变大，树的高度接近 4N。

'''树的总长度''' 树的总长度是树中所有分支的总和，因此该值将决定在样本中观察到多少突变。我们可以得出预期的总树长 Ttotal，通过注意到公式 6.2 给出了预期存在 i 个谱系的时间量，因此在此期间所有谱系之间的总分支长度为 i * E(Ti)（见图 6.2）。将存在i 个谱系、i – 1 个谱系、i – 2 个谱系等的总时间量相加，可得出：

[[文件:MPG--6.4.png|无框|320x320像素]]

对于 n = 2，预期的总树长为 4N（是 TMRCA 值的两倍，因为只有两个分支），并且随着样本量变大，树会变大。但请注意，样本中每增加一条新染色体，树的平均长度增加量会越来越短：n = 5 时，预期长度为 4N * 2.08，n = 10 时为 4N * 2.83，n = 20 时仅为 4N * 3.55。树的长度（和高度）<u>大部分仅由两条染色体贡献，而增加更多个体可能只会增加更多在树的尖端发生的融合。</u>

=== 融合和多态性测量 ===
我们现在可以将上述谱系测量与从染色体样本中收集的实际数量联系起来。我们还可以非正式地证明，用于测量样本多样性的几个统计数据（第 3 章）实际上是 Wright-Fisher 平衡种群下种群突变参数 θ 的估计量。

回想一下，我们之前将统计量 Π 定义为任意两个序列之间核苷酸差异的平均数。从公式 6.3 可以看出，<u>任意两个随机采样序列的 MRCA 平均时间为 2N 代。假设突变以每代 μ 的概率发生，并且种群以有效大小 (Ne) 来衡量，则预计两个序列之间会有 '''2 * 2Ne * μ = 4Neμ''' 个差异</u>。这表明在我们的中性平衡假设下，Π 有望成为 θ 的估计量。

虽然统计量 Π 基于序列之间成对差异的平均数量，但我们根据分离位点的数量 S 定义统计量 θ<sub>W</sub>，因此：

[[文件:MPG--6.5.png|无框|106x106像素]]

其中 a 等于：

[[文件:MPG--6.6.png|无框|121x121像素]]

公式 6.6 中的术语应该很熟悉 - 它用于定义合并树的总长度 T<sub>total</sub>（公式 6.4）。很明显，收集更多序列将使我们能够找到更多分离位点，但 θW 对我们每个额外样本的惩罚越来越少。如上所示，每个额外的序列也会越来越少地增加树总长度，这当然会导致添加的新多态性更少。我们可以通过重新排列公式 6.5 来明确地看到这种模式，得到 S = θWa。再次假设 (1) 突变以每代 m 的概率发生，并且在整个树中均匀随机地发生，以及 (2) 无限位点模型，则样本中分离位点的预期数量为：

[[文件:MPG--6.7.png|无框|321x321像素]]

使用公式 6.4 和 6.6 中给出的关系。这有助于我们看到在我们的中性平衡假设下，预计是 q 的估计量。

合并谱系的结构为我们提供了一种图形表示等位基因频率和等位基因频谱的方法。我们之前定义了 i 条染色体中存在衍生等位基因、n-i 条染色体中存在祖先等位基因的分离位点数，即 Si。从树的结构中我们可以看出，对于 i 个序列上存在的任何特定衍生等位基因，突变必定发生在具有恰好 i 个后代的分支上（图 6.4）。例如，在样本中出现三次的等位基因必定出现在具有恰好三个后代的分支上。

这里我们假设一个无限位点模型，因为在有限位点模型下，同一位点可能在后代谱系中恢复到祖先状态，或者在树的完全不同的分支上突变为相同状态。此类事件将使单个突变与其频率之间的对应关系复杂化。

单例突变（仅存在于单个染色体上的突变）发生在直接导致当今样本的分支上。这些有时被称为外部分支，与所有导致两个或更多后代的分支相对，这些分支被称为内部分支（Fu 和 Li 1993a）。并非所有等位基因频率都可能出现在每个家谱中，因为每棵树中不一定都有 2、3、... n - 1 个后代的内部分支（总是有 n 个分支有一个后代）。家谱的确切拓扑结构将决定哪些等位基因频率是可能的，从而决定可能的等位基因频谱。但是，对所有家谱进行平均，我们可以通过以下公式预测任何频率（即等位基因频谱）的预期分离位点数：其中 i 从 1 变为 n - 1（Fu 1995；Griffiths 和 Tavaré 1998）。这意味着

有 q 个单重态位点、q/2 个双重态位点、q/3 个三重态位点等等，并且

单重态位点将是最常见的位点类型。公式 6.8 还说明了为什么统计量 qe

；第 3 章）是 Wright-Fisher 平衡种群中 q 的估计量，并且一般来说，iSi

是

1 和 n – 1 之间所有 i 的 q 估计量。作为 q 的估计量，对于任何样本，我们可以将每个频率的中性等位基因的预期数量写为：

其中 S 表示样本中分离位点的总数，a

定义如公式 6.6 所示。图 6.5A 显示了 S = 28 和 n = 11 的基因座上预期的中性等位基因频谱的示例。

以上所有讨论都涉及我们所谓的展开频谱，我们能够为其分配祖先和派生等位基因（第 3 章）。对于折叠等位基因频谱，我们不知道 i 条染色体上存在的等位基因是由于在具有 i 个后代的分支上发生的新突变还是在具有 n - i 个后代的分支上发生突变后残留的祖先等位基因。无论如何，我们

也可以写下频率为 1

到 n/2 的分离位点的预期数量（对于奇数大小的样本向下舍入）：

我们可以再次用 θW

代替 q 的估计量，得到：

图 6.5B 显示了 S = 28 和 n = 11 的基因座的预期折叠等位基因频率谱，与图 6.5A 相同，但具有h 没有分配衍生和祖先等位基因。

确定偏差对等位基因频谱的影响

等位基因频谱的形状是分子群体遗传学中的一个重要指标。在没有选择影响的情况下，了解其在平衡群体中的预期形状意味着我们能够检测到

合并的

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

具有衍生等位基因的个体数 (i)

具有次要等位基因的个体数 (i)

图 6.5 根据样本中的频率预期分离位点数。给定一个 S = 28 和 n = 11 的基因座，频率 i [=E(Si

)] 处的多态性预期数量显示为 (A) 展开谱和 (B) 折叠谱。展开谱显示衍生等位基因的预期频率，而折叠谱显示次要等位基因的预期频率。与此预期的偏差，无论是由于非平衡人口历史（参见第 9 章）还是连锁选择（参见第 8 章）。然而，如第 2 章所述，如果我们对先前从较小样本中确定的大样本中的一组变异进行基因分型，我们会在等位基因频率谱中引入偏差。初始发现样本规模小的一个重要结果是，我们更有可能发现中频变异，而不太可能发现任何特定的低频变异（即次要等位基因频率较低的变异）。这种趋势意味着从预先确定的多态性推断出的等位基因频率谱与理论预期相比可能存在很大偏差（图 6.6）。正如关于预先确定的多态性和连锁不平衡（第 4 章）和 FST（第 5 章）的测量所讨论的那样，各个分离位点的样本频率没有任何不准确之处。这些估计值预计是正确的频率，并且可能

图 6.6 确定偏差对等位基因频谱的影响。给定一个大小为 k 的发现样本，显示了第二个独立样本大小为 n = 41 的预期折叠等位基因频率谱。无偏样本代表没有先前发现过程时的预期频谱。

（基于 Marth 等人，2004 年。）

1 3 5 7 9 1113

具有

次要等位基因（i）的个体数

频率 i 处的 SNP 的预期比例

甚至在发现样本和第二个（通常更大）样本之间相同（如果它们来自同一人群）。但是，如果没有预先确定，基因分型样本中每个频率的多态性预期比例将与预期值不匹配。事实上，即使发现样本大于基因分型样本，也会产生轻微的偏差，主要是因为第二个样本独有的低频等位基因将不会出现。如果确定方案已知，我们可以对其进行校正以恢复底层（无偏）等位基因频谱（例如，Nielsen 和 Signorovitch 2003；Nielsen、Hubisz 和 Clark 2004；Clark 等人 2005）。但是，没有完美的校正，在解释这些更新的光谱时必须谨慎（Clark 等人 2005）。

扩展合并

具有重组的合并

上面的讨论集中在足够大（或突变率足够低）的基因座的属性上，以满足无限位点模型的假设，但足够小以至于不会发生基因座内重组。这些假设对于大多数数据集来说显然是不现实的，所以我们现在必须考虑重组对合并谱系的影响。如前所述，序列中的每个核苷酸都有自己的谱系，描述样本中染色体之间的关系。如果一个核苷酸和它紧邻的核苷酸之间没有重组，那么它们都具有相同的谱系（图 6.7A）。如果有自由重组——如不同染色体上的两个核苷酸之间——那么这两个位点将有完全独立的谱系。更有趣的情况发生在位点部分链接时：当存在有限的重组时，合并重组重组位置 1 位置 240 位置 241 位置 327 位置 328 祖先重组图图 6.7 重组对合并谱系的影响。（A）假设基因座上的谱系。从位置 1 到 240 没有重组事件，因此只有一个谱系。位置 240 和 241 之间发生重组事件，从而产生一棵新树。同样，位置 241 和 327 之间没有重组。位置 327 和 328 之间发生第二次重组事件，并创建一个向右移动的新树。（B）祖先重组图总结了三个独特的谱系s 表示在 (A) 中的位置。相对于位置 1 的树，重组引入的新合并事件用虚线表示。它们之间的重组事件数。就合并谱系而言，两个位点之间的每个重组事件都会导致树中的重新排列，从而导致合并事件的位置在重组事件之前发生变化（图 6.7A）。请注意，这两棵树仍然保留了上述单个树的所有属性 - 重组不会改变树的平均拓扑结构（Kaplan 和 Hudson 1985）。由单个重组事件产生的两个相邻谱系将不再相同，但将高度相似；许多属性，例如它们的高度和总长度，将高度相关（Griffiths 1981；Hudson 1983b；Kaplan 和 Hudson 1985）。这意味着许多变异度量（例如 p 和 θW）也将在关联的基因座之间相关联。越来越多的重组事件将导致谱系发生越来越多的变化，直到最终两个被许多重组事件分隔开的谱系看起来完全不同，实际上完全独立。

考虑具有有限重组事件数 R 的单个基因座，我们现在可以将其想象为一组 R + 1 个非重组片段，每个片段都有自己的谱系（如图 6.7A 所示）。我们将每个片段的单个谱系称为该基因座的边缘谱系。给定所有边缘谱系，我们可以构建一个祖先重组图 (ARG)，它表示所有单独非重组片段的组合历史（图 6.7B）。合并事件在 ARG 中再次表示为分叉的谱系，而重组事件导致谱系结合在一起（向前看）。尽管这种对 ARG 的描述使它们似乎仅限于一组边缘树的简单图形表示，但这些图在群体遗传学中有许多重要应用（例如，Song 和 Hein 2005）。对 ARG 的讨论还应该清楚地表明，对于具有重组的常染色体基因座，没有单一的树来描述样本之间的关系。相反，有一系列树，每个片段在其历史上没有重组事件。这意味着不可能推断出重组区域的单一、分叉的基因树，尽管使用 Y 染色体或 mtDNA 基因座仍然可以进行这种推断。正如上一节中介绍的联合谱系与核苷酸变异摘要之间的关系一样，考虑重组对谱系的影响可以更深入地理解总结样本中重组事件历史的统计数据，以及与核苷酸多态性的多个测量值相关的方差。在第 4 章中，我们考虑了配子连锁不平衡的两个测量值，D′ 和 r2。回想一下，“完整” LD 意味着 D′ = 1，“完美” LD 意味着 r2 = 1，联合谱系让我们直观地以图形方式了解这两个值的含义。因为两个多态性只要它们之间没有（可检测的）重组就可以有 D′ = 1，所以在联合上下文中，这个值只是意味着两个分离位点共享相同的谱系。突变不一定发生在谱系的同一分支上，因此样本中可能存在三种单倍型。相反，只有当两个多态性完全相关时，r2 = 1，因此样本中只有两种单倍型。这意味着位点必须具有相同的拓扑结构，并且突变必须发生在同一分支上或根节点的任一侧。我们还在第 4 章中看到了群体重组参数 r = 4Ne 的几个估计量。正如群体突变参数 q 与样本中的多态性位点数量成正比一样，r 与样本中的重组事件数量 R 成正比。如第 4 章所述，估计样本中重组事件的真实数量可能很困难，因为大多数此类事件是无法检测到的。然而，

合并谱系的结构仍然允许我们看出 r 和 R 之间的关系。使用 c 表示每代每个核苷酸的重组率，我们可以再次想象重组事件在空间和时间上均匀随机地发生——也就是说，重组可以在基因座的任何地方以相等的概率发生，我们可以像处理突变一样将重组事件“抛”到我们的合并谱系上（尽管重组改变了谱系的基本形状）。给定公式 6.4 中树的总长度的期望，因此，我们样本中重组事件的预期数量为（Hudson 和 Kaplan 1985）：

（）*4 1 4 *

ER c N i Nc a a

这与公式 6.7 中给出的分离位点数量的预期完全类似，其中 q 替换为 r。但是，公式 6.7 和 6.12 中给出的关系有三个重要区别。首先，正如多次提到的，大多数重组事件是不可检测的，因此使用可检测事件的数量（例如）不会得到 r 的良好估计量。因为大多数突变事件在无限位点模型下都是可检测到的——并且可以针对有限位点场景进行调整（第 3 章）——S 是 q 的良好估计量，至少在 Wright-Fisher 模型的均衡假设下是如此。其次，与单独模拟突变的情况不同，我们现在必须明确选择序列中发生单个重组事件和突变的位置。重组事件的顺序是生成某个基因位点边缘谱系的关键。第三，我们将重组事件放到哪个确切的树上可能并不明确，因为将重组事件放到树上必然会改变拓扑结构。考虑这种情况的一种方法是考虑研究区域左侧第一个核苷酸处的固定谱系。然后，我们可以想象样本中的每个重组事件都被放到这个固定的树上，新的谱系会在这个位点的右侧，也就是我们感兴趣的区域内生成。这种方法不是标准后向合并算法模拟重组事件的方式（参见 Hudson 1983b、1990），但它可能有助于更直观地理解该过程。

最后，回想一下，随着重组率的上升，种群突变参数估计量的方差（例如 p 和 θW）会下降（公式 3.4 和 3.7）。合并算法提供了这种关联的谱系视角。在没有重组的基因座内，有一个单一的谱系描述染色体之间的关系。这个谱系的高度和总长度本身是从方差较大的分布中提取的，而我们只有一棵树这一事实意味着实际上从这些分布中只提取了一个。在发生重组的位点中，更高的重组率意味着有越来越多的边缘谱系，而这些个体谱系彼此之间的独立性越来越强。实际上，这意味着我们从间接决定多态性水平（树高和树长）的分布中抽取了大量的独立样本；因此方差大大降低。在大量位点之间发生自由重组的极端情况下，进化方差基本上没有影响，因为我们对大量独立树进行了平均。唯一的方差是通过在树上抽样突变而引入的，因此对于 θW，它相当于我们选择突变数量的泊松过程的方差（对于泊松分布，平均值等于方差）。这些结果的要点是，准确估计重组是产生有关感兴趣统计数据的准确置信区间的关键。

合并基因组和参考基因组

一个物种的参考基因组通常来自对单个个体的测序，无论是近交还是杂交（第 2 章）。因为这个个体没有什么特别之处——它不代表该物种的祖先状态，也不是“共识”个体——参考基因组将包含祖先和衍生状态，以独立分离多态性，就像从自然界采集的任何染色体一样。在短读测序的背景下，参考基因组被用作所有读数映射的主干，因此在种群样本中，它往往发挥着比它应得的更重要的作用。例如，当对替代等位基因的置信度不高时，从短读数据集调用多态性的保守方法有时会默认使用参考碱基。这可能对估计衍生等位基因频谱产生重要影响（请注意，因此默认为 N 更好）。因此，合并谱系的一个有趣（且有用）的用途是问：样本中分离位点的比例是多少，参考基因组中会有衍生等位基因？如果样本大小为 n = 2，答案应该是显而易见的：预计任何两条染色体之间平均有 q 个差异，突变在祖先的每个染色体的谱系中均等发生。因此，两个分支中任一个（任意指定一个作为参考）的衍生等位基因比例将是1/2。

对于大于 2 的样本，需要稍微复杂一些的论证。

实际上有两种方法可以回答这个问题，每种方法都只是对核心问题的重新陈述。为了找到任意选择的染色体上具有衍生等位基因的分离位点的比例，我们可以找到 (1) 样本中衍生等位基因的预期平均频率，

或 (2) 单个染色体相对于整个样本的历史中发生的突变的预期比例。

样本中衍生等位基因的平均频率给出了任何染色体上衍生等位基因的预期比例，平均所有分离位点。为了看到这一点，想象一下从自然界中随机选择一条染色体。对于任何给定的具有衍生等位基因频率 p 的多态性，选择包含衍生等位基因的染色体的概率也将是 p，因此以频率 p = 0.8 采样衍生等位基因的概率将是 0.8，以频率 p = 0.01 采样等位基因的概率将是 0.01，依此类推。因此，对许多分离位点进行平均，采样衍生等位基因的概率将只是平均衍生等位基因频率；该度量将相当于采样衍生等位基因的位点比例。从公式 6.9 中，我们得到了在 i 条染色体上发现的具有衍生等位基因的分离位点的预期数量 Si。现在我们想知道——在所有分离位点中——大小为 n 的样本中每个位点包含衍生等位基因的平均染色体数量，我们将其表示为 m。设 q(m) 为样本中 m 的分布（即衍生等位基因频谱），Griffiths 和 Tavaré (1998) 表明，在平衡状态下，Wright-Fisher 群体中 m 的预期值为：∑ = = − = −Em i i a a n n，使得样本中衍生等位基因的平均频率为 m/n。对于 n = 2 的情况，公式 6.13 再次得出 m = 1，平均衍生等位基因频率为 1/2。对于大小为 n = 11 的样本（如图 6.5 所示），m = 3.59，平均衍生等位基因频率为 0.326。

为了从谱系角度直观地了解这一结果，请考虑另一种表述问题的方式：在整个样本中，单个染色体历史中发生的突变的预期比例是多少？因为我们以看到分离位点为条件，所以我们只需要将染色体的历史追溯到样本的 MRCA；根据定义，在此点之前发生的所有突变都是固定的。

认识到任何单个染色体上的衍生突变都必须在 MRCA 之后发生，我们需要知道追溯到这个祖先的时间。

幸运的是，公式 6.3 给出了从谱系的任何尖端追溯到 MRCA 的预期时间。为了得到只发生在这个分支上的所有突变的比例，我们将公式 6.3 除以公式 6.4，即树中的总时间（图 6.8）。如果突变再次随机地分布在各个分支上，并且我们假设无限位点突变模型，则此关系给出在任何单个染色体上具有衍生等位基因的位点的预期比例 b：等于 m/n，即衍生等位基因的平均频率，如上文公式 6.13 所定义。这些关系表明，平均衍生等位基因的频率较低，对于中小样本，频率范围约为 0.20 到 0.50。从预期的衍生等位基因频率分布（图 6.5）一眼就可以猜到，分离位点的次要等位基因通常是衍生等位基因。事实上，Watterson 和 Guess (1977) 已经证明，等位基因代表祖先状态的概率等于其种群频率 p；样本中等位基因的频率也是如此（Griffiths 和 Tavaré 1998）。

对于参考基因组，上述结果表明，样本中相当一部分多态性位点（0.20–0.50）将具有参考基因组中的衍生等位基因。如上所述，在第 2 章中，这

图 6.8 样本中所有突变的比例发生在单个染色体的历史中。如果突变在树上均匀随机发生，则该比例等于单个染色体自 MRCA 以来的时间量除以树中的总时间。

对于用 * 表示的任意采样染色体，较粗的黑线表示其祖先谱系。该谱系在树中占总时间的比例由公式 6.14 给出。这一发现意味着，在个体样本中，碱基调用可能经常默认为衍生和祖先参考等位基因。如果碱基调用过于保守，则该过程将导致衍生等位基因频谱倾斜，因为多态性ms 与参考中的派生状态将被推向更高的表观采样频率。因此，当碱基调用默认为参考等位基因时，识别变异位点的保守标准可能会更糟。幸运的是，我们可以纠正这种偏差，方法是降低用于调用多态性位点的质量阈值，考虑参考基因组中固有的采样偏差，将低质量碱基分配为 Ns 而不是参考等位基因，或者迭代地识别变化的位点并根据位点与参考不同的更新概率重新调用基因型（例如，DePristo 等人，2011 年）。

选择 7

可以通过分别考虑选择对本身有利、有害或中性的突变的影响（直接选择）以及对与选择密切相关的突变的影响（连锁选择）来有效地划分自然选择对分子变异的影响。在这两种情况下，对多态性模式的期望通常不同，因此不同的方法最适合检测一种或另一种选择。

更深入地理解这些方法至少需要对其背后的理论和假设有一定的了解；因此，在本章中，我将考虑这些假设及其对推断直接选择的影响的影响。这里讨论的方法已成功用于大量研究，以检查自然选择的影响，是理解 DNA 序列进化的关键工具。

序列分歧的积累

核苷酸替换率

约翰·梅纳德·史密斯 (John Maynard Smith) 称 k = m 是整个进化遗传学中最重要的方程之一 (Maynard Smith 2002)。我完全同意：它既是一个令人惊叹的优雅结果（由 Kimura 1968 年首次应用于分子数据，但也出现在 Wright 1938 年），也是中性理论的典范（在第 1 章中讨论过）。但它不仅是一个优雅的结果——它也是本书其余部分涵盖的许多自然选择测试的基石之一。下面我们开始探索它在分子进化中的作用。变量 k 定义为新等位基因的替换率——即等位基因在长期内固定的速率（有时也表示为 r）。替换率通常以每代或每百万年为单位进行测量。k 的值决定了两个序列预计会随着时间的推移而发散的速度。定义 d 为

两个直系同源序列之间的遗传距离，替换率对预期分歧量的贡献可以用以下公式看出：

E(d) = k2t + qAnc

其中 t 是物种分裂以来的时间（Gillespie 和 Langley 1979；另见 Li 1977）。为简单起见，假设我们计算每个位点的所有值，这样我们就可以忽略序列的长度。因此，在一个基因座内，k

表示跨位点的平均替换率。回想一下，我们使用 2t

是因为替换可以发生在系统发育树的两个分支上，并且我们只考虑序列之间的成对分歧。

我们添加了祖先中两个序列之间预期的核苷酸变异的平均量（qAnc

），因为在物种形成时，这些差异已经沿着两个谱系积累（图 7.1）。这个预期距离与用于统计量 dXY 的预期距离相同（第 5 章）；但是，我们只需从每个物种中抽取一个序列来计算 d。在发散水平远高于祖先物种的预期多态性水平的情况下，我们可以简单地写出：

E（d）≈k2t

这个方程表明了一种明显的关系：物种的不同是因为新的等位基因出现并固定，这个过程发生的速率和自谱系分裂以来经过的时间都对总发散量有贡献。然而，这个方程并没有告诉我们什么影响了替换率。有两个量决定了替换率。第一个是任何突变固定的概率，我们将其表示为 u。这个概率是突变频率 p 的函数，但现在我们只对新突变固定的概率感兴趣。

基因分裂时间

物种分裂时间

图 7.1 物种分裂以来的时间与被比较的基因分裂以来的时间之间的区别。单个祖先物种分裂成两个后代物种的历史由较暗的线条界定。在两个后代物种（A 和 B）中分别采样的单个直系同源序列的历史由较细的蓝线表示。在物种分裂之前，祖先种群中的两个序列预计平均具有 qAnc

d差异。如果祖先种群符合 Wright-Fisher 模型的假设，则基因分裂的时间预计在物种分裂时间 t 之前 2Ne 代。直接选择突变，对于常染色体基因座，其频率始终为 1/2N。当突变对适应度没有影响时（当它相对于替代等位基因为中性时），其固定的概率等于其当前频率。因此，对于 p = 0.4 的突变，u = 0.4，有 40% 的机会它最终会变成频率 1（相反，有 60% 的机会它会丢失）。对于频率为 1/2N 的新的中性突变，其固定概率因此仅为 u0

对于新的有利突变 (s > 0) 和较大的有效种群规模，固定概率为 (Haldane 1927; Fisher 1930; Wright 1931)：

（为了在这些论文中表示选择优势，Haldane 使用符号 k，Fisher 使用符号 a，Wright 使用现在标准的 s。）

是杂合子中新等位基因的选择优势，2sa

是纯合子中的优势。对于没有大影响的新的有害突变 (s < 0)，固定概率为 (Kimura 1957)：

是杂合子中新等位基因的选择劣势，

是纯合子中的劣势。图 7.2 显示了新选定突变相对于中性突变固定的概率，这些概率在 Ns = 0 时相等（即它们的比率为 1）。可以看出，略微有利的突变固定的可能性并不比中性突变高多少，而且即使是略微有害的突变也有一定的固定概率。即使这些略微有害的突变（通常称为近中性）必须具有极小的选择效应才能使 Ns 接近 0，但它们预计会对较小群体中的序列发散做出贡献（见下文）。影响替换率的第二个量是出现并可能被固定的突变总数。如果每一代核苷酸发生突变的概率为 n，那么在 N 个二倍体个体的群体中，在常染色体位点上，总群体中每代将有 2Nn 个新突变（在单个位点）。在这些突变中，2Nnf0（=2Nm）将是中性的，其中 f0 代表中性突变的比例。其余突变由

有利的部分 fa

有害的部分 fd

组成（因此

图 7.2 相对于中性等位基因的固定概率，新的选定突变。中性突变的固定概率为

1/2N，有利（Ns > 0）和有害（Ns < 0）突变分别具有增加和减少的固定概率。

值是根据公式 7.4 计算得出的，可用于正向或负向选择系数。

134 第 7 章

= 1）。因此，每代也有 2Nnfa

个新的有利突变

个新的有害突变。

我们现在可以将替代率的两个决定因素放在一起考虑。如果没有有利突变，并且有害突变

未在可察觉的水平上固定，则替换率仅取决于

发生的中性突变总数以及每个突变固定的概率。我们可以将此关系写为：

ν ν ( ) = 

  = k N f N f 2 1

2 0 0 (7.5)

或者，用符号 m 代替中性突变发生的总速率

nf0

，中性突变的替换率为：

k = m (7.6)

换句话说，此关系表示，当仅考虑中性突变时，

替换率等于突变率，无论种群大小如何。这种与种群规模无关的情况乍一看似乎不直观，但可以通过考虑以下事实来理解：虽然在大群体中会出现更多突变，但每个突变最终固定下来的可能性较小。同样，任何单个新突变在小群体中固定下来的可能性更大，但总体而言，突变较少。因此，在考虑中性突变时，种群规模完全抵消了这一影响。在我们探索自然选择发挥作用的案例的过程中，我们将一次又一次地使用这一结果。最后，让我们考虑非中性等位基因的替换率。在总突变率 n 中，我们已经将 fa 定义为所有有利和有害突变的比例，将 ua 定义为每种类型新突变的固定概率。现在，我们可以将有利突变的替换率写为：

k = (2Nn fa

) = 4Nn fa

为了获得有害突变的替换率，我们使用公式 7.4 来查找：

=

−()()−−

从公式 7.7 和 7.8 中，我们可以看到一个关键的区别中性突变和选择性突变之间的区别：N，即种群规模，在选择性突变的替换率中起着重要作用。在其他条件相同的情况下，更有利的突变将在较大的种群中固定，而不是在较小的种群中，而更有害的突变将在较小的种群中固定，而不是在较大的种群中。接下来，我们考虑如何确定每种类型的突变对物种间分化的贡献。

估计序列分化

量化自然选择影响的最直接方法之一根本不使用种群水平的数据。虽然这种直接选择特性似乎不适合用于种群遗传学文本，但它是每个种群遗传学家工具箱中的标准测试。

而且由于物种间的替换是物种内多态性的长期结果（Kimura 和 Ohta 1971），这些方法是理解使用多态性数据的更强大方法的良好起点。

之前我们将 d 定义为两个直系同源序列之间的遗传距离。具体来说，我们通常通过从每个物种中取出一个序列并计算它们之间不同的位置数，然后除以对齐的核苷酸总数来计算 d。与计算同一物种中个体之间的 p（第 3 章）一样，我们只计算没有间隙的位置上的核苷酸差异数。如果我们考虑多序列比对，这个过程通常会导致比对中任何序列中有间隙的位置在所有物种中都被忽略。因此，从为每对物种生成的比对计算出的成对发散值可能与从包括所有物种的单个多序列比对计算出的发散值略有不同。例如，图 7.3 显示了来自不同物种的 15 个核苷酸长的序列比对。使用整个多物种比对，我们将计算出序列 1 和 2 之间的发散为 0.273（3 个差异/11 个无间隙位点）；但是，如果我们只重新比对序列 1 和 2 并重新计算发散，我们将得到 d = 0.23。显然，如果在同一比对中同时包含近亲和远亲序列，则这种差异可能导致发散估计有偏差，因为只有那些不易插入和删除的区域才会被纳入分析。计算 d 时还有两个重要问题需要考虑。

首先，由于它是根据每个物种（或每个基因座，因为 d 也可以在旁系同源物之间计算）的单个序列计算得出的，因此该统计数据本身并不代表固定的差异。也就是说，在用于计算 d 的序列中存在的任何衍生的多态性等位基因都将被计入种间差异。之前我们还考虑了祖先多态性等位基因的贡献，但这些基因实际上在当前物种之间是固定的，因此不会混淆多态性和差异。这种差异度量包括多态性位点，因为从自然界采样的任何染色体预计平均包含 q 个在种群中仍然具有多态性的衍生等位基因。您可以通过考虑种群最近共同祖先的预计时间为 4N 代（公式 6.3）来了解这种预期来自何处。

这意味着在导致任何序列的谱系中发生了 4Nm 个突变（并且仍然是多态性的）（图 7.4）。假设被比较的两个物种的多样性水平相同，这意味着直系同源序列之间大约 2p 的差异实际上不是物种之间的固定差异。这些 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

T T ACA A T CCGA TCGT

图 7.3 四个序列的示例比对，每个序列来自不同的物种

物种间基因分裂时间

物种分裂时间

物种内基因分裂时间

图 7.4 来自两个不同物种的单个序列的比较包括固定和多态性差异。单个祖先物种分裂成两个后代物种的历史由较暗的线条界定。在两个后代物种中分别采样的单个直系同源序列的历史用较细的蓝线表示；假设序列 A 是从物种 1 中采样的，而序列 C 是从物种 2 中采样的。为清楚起见，显示了每个物种中两个最大发散样本的谱系（物种 1 中的 A 和 B；物种 2 中的 C 和 D）。每个物种内样本的最近共同祖先的时间不一定相同，但为简单起见假设相同。从物种间基因分裂时间到物种内基因分裂时间发生的所有变化都是固定的差异。自物种内基因分裂以来，导致 A 和 C 的单个分支上发生的突变是多态性的。单个序列中此类差异的数量预计为 A 和 C 的 p，因此 A 和 C 之间的差异总数 d 包括 2p ) 个多态性位点。计算意味着我们可以正确地将两个物种之间的固定差异量计算为 d* = d − 2p。这种方法类似于第 5 章中用于计算统计 da 的逻辑，但在这种情况下，我们试图消除当前的多态性而不是祖先的多态性。如果多样性水平不相等，我们可以从每个物种中减去不同的 p 值，这样 d* = d − (p1

大多数情况下，这种校正被忽略，因为分歧水平远大于多态性水平（即 d >> p）。

第二个问题出现在被比较的物种距离太远的情况下。早期的分子进化实践者认识到，当多个突变出现并固定在同一位点时，简单地计算两个物种之间不同位点的比例会低估真正的差异数量。在最极端的情况下，当每个位点都发生了多次变化时，我们仍然会有 25% 的碱基随机匹配（假设没有间隙）并且 d = 0.75。解释多次替换影响的最简单方法是进行 Jukes-Cantor 校正（Jukes 和 Cantor 1969）。将 a 定义为观察到的两个序列之间不同的位点比例（也称为 p 或 p 距离），Jukes

Cantor 校正的 d 值为：

   d a 3

Kimura (1980) 进行了调整，以解释转换突变（嘌呤之间或嘧啶之间）比颠换突变（嘌呤和嘧啶之间）更频繁发生的事实。 Kimura 双参数校正为：

( ) ( ) =− − − − − − d a b b 1

2 ln 1 2 1

4 ln 1 2 (7.10)

其中 a 现在是因转换而不同的位点比例，b 是因颠换而不同的位点比例。可以进行许多进一步的阐述，例如允许嘌呤与嘧啶的转换使用不同的参数（例如，Hasegawa、Kishino 和 Yano 1985；Tamura 和 Nei 1993）。当距离非常大时，这些方法都不能确保准确测量发散度，因为在这种情况下，即使是修正后的估计值也存在很大的方差。大于 0.75 的 a 值在公式 7.9 和 7.10 中均未定义，并且通常，大于 0.50 的 d 值将不如理想值准确。远大于 1 的 d 值基本上是对真实发散水平的猜测。利用分歧检测选择

除了测量两个序列之间的整体分歧之外，

在编码区域中，我们还可以分别测量由于

非同义和同义变化而导致的分歧。具体来说，我们定义 dN 为每个非同义位点的非同义差异数（也称为 dR ），每个同义位点的同义差异数（也称为 KS ）。计算两个序列之间非同义和同义差异数的方法在 BOX 7.1 和 BOX 7.2 中有详细描述。这里我们重点介绍如何使用量化来推断自然选择。计算 dn 的最简单方法首先找到比对中序列之间的非同义和同义差异数（分别表示为 Nd ），然后计算每个序列中的非同义和同义位点数（分别表示为）。最后，我们将每个序列的非同义差异数（继续）■ BOX 7.1（续）

非同义位点数 dn

每个同义位点的同义差异数 dS

。由于

的值对于比对中的每个序列都会略有不同，因此我们通常在计算 dn 时使用它们的平均值。有许多不同的方法可以计算非同义和同义位点，并且使用不同的方法通常会得到不同的答案。一种简单的方法假设转换和颠换的速率相等，并且没有密码子使用偏差（nei 和 Gojobori 1986）。例如，密码子 TTA 编码氨基酸亮氨酸。如果我们只考虑第三个位置的突变，TTG 亮氨酸 TTA 亮氨酸 → TTC 苯丙氨酸 TTT 苯丙氨酸使用 nei 和 Gojobori 方法计算位点，第三个位置将是 1/3 同义和 2/3 非同义，因为三个可能的突变中只有一个是同义密码子，两个是非同义密码子；我们将此类密码子称为双重退化。密码子中的前两个位置都是 3/3 非同义的nd

0/3 同义，因为这两个位置上的所有突变都是非同义的。因此，该密码子的总计数为

= 8/3 和 Sc

其他方法在计算有效位点数时会考虑转换/颠换偏差（li 1993；Pamilo 和 Bianchi

1993；Comeron 1995；Ina 1995）。这种偏差可能对位点计数产生重要影响。例如，强烈的转换/颠换偏差将导致双重简并密码子在第三个位置上的同义性超过 1/3，因为遗传密码允许双重简并密码子在第三个位置上的所有转换都是同义的。从上面的例子可以看出，如果 A → G 的突变比 A → C 或 A → T 的突变更频繁，那么从某种意义上说，第三个位置的同义性超过 1/3。适当地加权这些位点（使用已知或估计的转换与颠换的比率）可以纠正这种偏差。还有其他方法考虑了序列内不平等的密码子使用情况，有效地纠正了一些同义密码子很少使用的事实（Yang and nielsen 2000）。还有许多不同的方法来计算序列之间的非同义和同义差异。当密码子仅在一个核苷酸处不同时，所有这些方法都会给出相同的结果。例如，在以下两个物种之间单个密码子的比对中：只有一个差异，并且它是同义的；因此 Nd

= 0 和 Sd

只有当两个序列之间单个密码子存在多个差异时，情况才会变得复杂；我们将这种情况称为复杂密码子。这些情况之所以更加复杂，是因为现在进化可能采取了两种可能的途径，具体取决于两种突变中的哪一种先出现。在某些情况下，核苷酸差异可能是同义的，也可能是非同义的，如下所示

两种可能的途径是：

途径 1 TTT (Phe) ↔ GTT (Val) ↔ GTA (Val)

途径 2 TTT (Phe) ↔ TTA (leu) ↔ GTA (Val)

在途径 1 中，第三位置的 T → A 变化是同义变化，总共有一个非同义差异和一个同义差异 (Nd

= 1)。在途径 2 中，T → A 变化是非同义的，总共有两个非同义替换 (Nd

= 0)。nei 和 Gojobori (1986) 方法

只是对不同的进化路径进行平均，并赋予每个路径等效权重；这样做会得到

= 1.5 和 Sd

= 0.5。其他方法会给予包含同义

直接选择 139 的路径更多权重作为框 7.1 中概述的计算 dn 的“计数”方法的替代方法，已提出了几种可能性方法（并且通常用于此目的）（Goldman 和 Yang 1994；Muse

和 Gaut 1994）。这些方法基于密码子之间替换的马尔可夫链模型，指定 61 个非终止密码子之间独立转换的瞬时速率矩阵 Q。对于最流行的似然模型之一（Yang 1998），速率矩阵由每对密码子 i 和 j（i ≠ j）之间的单独转换速率 qij 组成，其中：这里，密码子 j 的平衡频率表示为 pj ，转换/颠换偏差表示为 k ，非同义替换相对于同义替换的相对概率表示为 w 。在这种情况下，我们可以将 w 视为非同义替换与同义替换的比率，或 dn ，该方法明确不是单独估计。事实上，虽然实现该模型的方法可以允许 w 在密码子之间变化，但它们假设同义替换率在整个基因中是恒定的 - 因此，推断密码子之间的差异仅仅是由于对非同义变化的选择差异。但是，可以放宽简单模型的许多假设：可以允许密码子之间有多个变化（例如，Whelan 和 Goldman 2004），可以允许密码子之间的相关变化率（例如，Siepel 和 Haussler 2004a），并且可以允许密码子之间的同义替换率变化（例如，Pond 和 Muse 2005）。当与多序列比对和预先指定的系统发育拓扑一起使用时，可以通过最大似然法估计上述模型的参数。

最常用的软件包是 PAML (Yang 2007) 和 HyPhy

          

         

i 0，如果和相差不止一个位置

，对于同义颠换

，对于同义转换

，对于非同义颠换

，对于非同义转换

替换 (li, Wu, and luo 1985) 或包含常见非同义变化的途径 (Miyata and Yasunaga 1980)，然后对途径取加权平均值

。除非序列高度分化，否则所有这些计算非同义和同义差异的方法应该会给出相似的结果。

最后，在对比对中的所有密码子的 Nc 求和后，建议对单个位点的多个可能的核苷酸替换的两个 dn 进行校正。

公式 7.9 和 7.10 描述了执行此类校正的两种常用方法。有关所有这些方法的更多详细信息，请参阅 nei 和 Kumar (2000) 和 Yang (2006)。

（续）

140 第 7 章

（Pond、Frost 和 Muse 2005）；在这里我描述了 PAML 中可用的方法。要计算所有密码子的平均自然选择强度 w，最简单的模型表示为 M0。

该模型对 w 的取值没有任何限制，如果需要，可以为树的每个分支估计单独的 w 参数。但是，除非正向选择作用于整个基因的许多位点，否则 M0 不太可能有 w > 1。相反，允许 w 在密码子之间变化的模型（称为位点模型）对于检测正向选择最有效。要检验比对中是否存在有证据显示存在正向选择的密码子，最直接的方法是进行两个嵌套位点模型之间的似然比检验，一个模型带有一个允许 w > 1 的参数，另一个模型不带有。模型 M1a 有两个 w 参数：一个用于 w < 1 的密码子 (w0

一个用于 w = 1 的密码子 (w1

；还有用于分配给每个 w 参数的位点比例的参数，p0

）。模型 M2a 有三个 w 参数：一个用于 w 的密码子

），一个用于 w = 1 的密码子 (w1

一个用于 w > 1 的密码子 (w2

)，以及用于分配给每个 w 的位点比例的相应参数 (p0

因为模型 M1a 有两个自由参数，而模型 M2a 有四个自由参数——并且模型 M1a 是嵌套的在 M2a 内——可以使用具有两个自由度的似然比检验来测试允许位点在正向选择下进化的模型 (M2a) 是否能更好地拟合数据。此检验只能用于两个分类单元（即两个序列），但添加更多分类单元时功效会提高（Anisimova、Bielawski 和 Yang 2001）。但请注意，该方法假设底层系统发育树来自不同物种的序列，而不是物种内的序列；PAML 要求比对中的所有位点都有一棵树，而从物种内采样重组序列会违反这一假设，并可能导致错误的正向选择推断（Anisimova、nielsen 和 Yang 2003）。对位点模型的进一步细化允许对系统发育树特定分支上的一组密码子进行正向选择测试（称为分支位点模型），这反过来又允许识别在一组位点上经历适应性进化的特定谱系（Zhang、nielsen 和 Yang 2005）。有关这些方法及其用途的更多详细信息，请参阅 Yang（2006；2007）。从替代率的讨论中应该可以明显看出，自然选择对固定的非同义突变的数量有着深远的影响。如果我们使用中性、有利和有害突变的替换率期望（分别在公式 7.6、7.7 和 7.8 中给出），并将所有替换率乘以 2t 以将其转换为距离，那么我们可以写下总预期非同义突变

ν ν ν ( ) ( ) ( )( ) ( ) = 

     ( ) −

E d N f N t N f s t N f s

2 2 2 2 2 2 2

2 Ns N 0 a a d

简化为：

ν ( )= + +

     ( ) −

E d t f f Ns f Ns

1 Ns N 0 a a d

因为一个区域的总非同义变异是由所有三种类型的突变引起的，所以我们对 dN

的表达式包括所有三个项。这个等式

■ 框 7.2（续）

直接选择

表明，更高的潜在突变率 n 和更长的变异时间 t 将增加变异量；固定的有利突变的比例将取决于它们出现的频率和它们的平均选择效果；如果选择足够弱，有害突变也会导致变异。

虽然并非所有同义突变都是选择性等价的，但我们现在将做出这一假设，稍后再讨论选择对同义突变的影响。假设所有同义变化

都是中性的，即这些位点的 f0

= 1 和 fa

= 0，那么两个序列之间预期的同义差异总量为：

该表达式反映了公式 7.2，因为对于中性突变，替换率等于突变率。

为了询问自然选择对序列进化的影响，

我们不能只比较基因之间的 dN

值，即使它们都来自

同一对物种。这是因为整个基因组中潜在的突变率各不相同e 和染色体上的差异导致在选择可能以完全相同的方式起作用的基因座上产生不同的值。Kimura (1977) 非正式地建议比较基因上非同义和同义分歧的比率 dN ，以控制基因座间突变率的差异（另见 Miyata 和 Yasunaga 1980）。因为 n 和 t 对于同一基因中的非同义和同义位点都大致相同，所以将公式 7.12 除以 7.13 可得出：

E d f f Ns f Ns

这个表达式向我们表明，相对于同义分歧，非同义分歧的水平再次归因于中性、有利和有害突变的比例。请注意，为了避免下标，我没有使用不同的符号来表示同义和非同义位点的中性突变比例；公式 7.14 中的 f0 仅代表非同义突变。

解释 dN

虽然 dN

由中性、有利和有害突变的综合影响决定，但它可以告诉我们很多有关自然选择对序列进化的一般影响的信息。图 7.5 给出了自然界中观察到的范围值的示例，其中显示了拟南芥和 A. lyrata 之间的 11,492 个直系同源物的值（Yang 和 Gaut 2011）。作为对许多分类群的一般观察，物种间计算的

平均值为 0.15 到 0.25，尽管单个基因的值从 0 到 >2 不等（大鼠基因组测序计划联盟

2004；Mikkelsen 等人 2005；果蝇 12 基因组联盟 2007；Yang

和 Gaut 2011）。该范围表明至少 75% 到 85% 的非同义突变是有害的并且不会固定。这代表了对强烈有害突变比例的最低估计，原因是

图 7.5 拟南芥和 A. lyrata 之间 11,492 个直系同源物的 dn 值分布。（根据 Yang 和 Gaut 2011 年的研究。）即使少量的有利突变也会对分化产生不成比例的贡献（见公式 7.14）。即使有利突变的比例 fa 低至 1%，并且没有中性突变，足够强的选择和较大的种群规模也可能使 dN 远远超过 0.01。例如，如果 99% 的非同义突变是强烈有害的，而 1% 是有利的，平均 Ns = 10，则等于 0.4。对有害突变比例的简单估计 1 − dN 会低估该比例约 50%（0.6 对 0.99）。仅当不存在有利突变且有害突变不会以可观的速率固定时，dN 才会固定（因此为 1 − dN ）。虽然基于此假设的选择性约束估计值被广泛使用，但它们几乎肯定低估了所有有害突变的比例。单个基因的 dN 值并不能告诉我们固定的非同义突变中有多少比例是中性的、有利的或略有害的。每种突变频率、其平均选择效应和种群大小的多种值组合可以给出该统计数据的相同值。一种用于估计轻微有害突变比例的方法是比较已知种群规模不同的分类群之间的 dN 平均值：预测种群规模较小的物种的 dN 将增加，与轻微有害突变的比例成正比。

对多个物种的比较表明，所有突变中有 15% 到 30% 是轻微有害的 (Eyre-Walker 等人，2002 年)。例如，小鼠和大鼠之间的平均值为 0.14，人类和黑猩猩之间的平均值为 0.20 (Mikkelsen 等人，2005 年)。虽然没有先验理由相信灵长类动物总体上存在更多和/或更强的有利突变，但众所周知，该进化枝中的种群规模要小得多，这将导致更高的 dN 值

直接选择

只有一种普遍接受的方法可以证明 - 使用 - 基因历史上存在有利突变（即正向选择）：该统计量的值必须大于 1（Hill 和 Hastie 1987；Hughes 和 Nei 1988）。要了解原因，请考虑一个没有有利突变的基因。在这种情况下，dN 的最大值为 1，只有当所有可能的非同义突变都是选择性等价时才会发生这种情况。获得 dN

> 1（具有统计意义）的唯一方法是存在一定比例的有利突变（公式 7.14）。我们还可以看到，这是一个非常严格的要求，因为需要越来越多的有利突变才能获得 dN

，有害突变的比例也在增加。事实上，只有那些存在重复的氨基酸替换适应性固定的基因才有机会提高取 dN

的值除以 1。这些基因通常是与免疫和生殖功能相关的蛋白质，因为它们经常参与宿主和病原体之间或雄性和雌性之间的“军备竞赛”动态。

dN

> 1 的显著性检验已通过多种不同的方式完成。框 7.2 中概述的似然法允许在有和没有正向选择的模型之间进行似然比检验。框 7.1 中概述的更简单的计数方法不基于任何模型，因此不允许进行如此简单的测试程序。

然而，后一种方法已经产生了许多不同的方法。Hughes 和 Nei (1988) 仅比较序列对，计算了 dN

的标准误差，并使用 t 检验来检验 dN

> 0 的假设是否显著。 Messier 和 Stewart (1997) 对灵长类动物溶菌酶基因进化树的各个分支进行了类似的分析，重建了每个节点的祖先状态，并计算了父节点和子节点之间非同义和同义差异以及非同义和同义位点的数量；同样，测试通过 t 检验进行。这两种方法都存在问题。首先，t 检验假设 dN 近似呈正态分布，除非两种类型的替换都存在大量替换，否则这种情况不太可能发生。其次，使用重建祖先状态的方法未能考虑这些重建中的不确定性，从而导致不确定性。第一个问题的一个解决方案是使用小样本测试来比较非同义和同义替换的数量。 Zhang、Kumar 和 Nei (1997) 通过使用 2 × 2 独立性检验得出了这一解决方案，该检验对非同义和同义替换的计数与非同义和同义位点的数量（即框 7.1 中的 Nd）进行了独立性检验；通过 Fisher 精确检验进行测试。这种方法优于大样本近似法，尽管计数非同义和同义位点的方法的选择可能会对结果产生很大影响（见框 7.1）。似然法（框 7.2）可用于对重建的祖先状态进行平均，从而有效地考虑到不确定性。另一个复杂因素是蛋白质的不同部分可能受到不同的选择力——一些可能受到强烈的正选择，而一些则受到强烈的负选择。虽然所有区域的平均值可能具有 dN < 1，但在 Hill 和 Hastie [1987] 和 Hughes 和 Nei [1988] 的原始论文中，功能域的子集可能具有 dN。因此，如果提前确定了这些域，则在不同的域中检查此统计数据会很有用；事后滑动窗口分析可能会产生很大的误导性（Schmid 和 Yang 2008）。只要满足测试假设，似然法也可用于以统计上合理的方式查找具有 dN > 1 的单个密码子（框 7.2）。许多或大多数具有 dN < 1 的蛋白质很可能具有一些正向选择的历史，但这个统计数据不允许我们确定这是否属实。任何数量的氨基酸变化都可能是由于有利突变引起的，因此任何 0 < dN ≤ 1 的基因都可能具有中性、有利和轻微有害突变的贡献。由于每种突变类型的贡献未知，我们对选择的推断必须同样谨慎。以下是解释 dN 的一些一般准则

<< 1 绝大多数非同义突变都是有害的，并且负向（净化）选择占主导地位。

< 1 大多数非同义突变是有害的，但可能存在一些未知的有利突变部分。

= 1 这种情况可能发生在两种情况下：首先，没有选择，所有非同义突变都是中性的。其次，存在大量中性和有利突变（以及有害突变）。

> 1 有许多有利的非同义突变，并且正向选择占主导地位，但仍有许多有害突变。

尽管第 1 章已经进行了区分，但应在此重申，观察到基因的 dN

= 1 并不表示该基因正在“中性”进化。如上所述，有多种选择力的组合会导致 dN

= 1，其中只有一种是没有选择。更重要的是，没有选择约束与中性进化不同。许多 dN

< 1 的基因可能正在中性进化 - 也就是说，它们可能没有固定任何适应性替代。

还必须提到有关解释 dN

的几个注意事项。

首先，较小的 dS

值可能会使 dN

的估计值向上偏差。虽然这种偏差绝不会导致 dN

的值明显大于大于 1，由于 dS 的差异，对具有非常不同分化时间的物种对进行比较可能会产生误导（Wolf 等人，2009 年）。其次，我们假设所有同义突变都是中性的。显然，并非每个物种都是如此：虽然非随机使用同义密码子的原因有很多，但自然选择是一个重要因素（Ikemura，1981 年；Akashi，1994 年；Chamary、Parmley 和 Hurst，2006 年；Lawrie 等人，2013 年）。如果所有中性的同义突变的比例不等于 1，则 dS 的值应由公式 7.12 而不是 7.13 中给出的表达式确定。目前尚不清楚这将如何影响：如果负选择占主导地位，那么 dS

将小于没有约束的情况下的预期，因此 dN

将更高。这是否会导致在没有有利突变的情况下 dN

> 1 的情况（这实际上不需要对非同义突变进行约束，但需要对同义突变进行严格约束）尚不清楚（但可能性不大）。另一方面，如果存在许多有利的同义替换（例如，Resch 等人，2007 年），那么 dN

的值将低于预期，因此将推断负选择的强度大于实际强度。一般而言，dN

是一个相对稳健的统计数据，几乎没有关于样本收集方式、人口人口历史或真正群体遗传方法引入的任何其他问题的假设。另一方面，只有反复的正向选择才能提供有利突变的证据，因此只有更强大的方法才能为适应性进化提供大量信息。

使用多态性检测选择

选择对多态性频率的影响

在上一节中，我们考虑了选择如何反对或支持所选等位基因的最终固定，以及我们如何从物种间分化数据推断进化过程。我们现在将讨论选择对种群内多态性频率的影响，最初不考虑固定差异。许多不同的方法可以利用这种数据，尽管它们通常不如结合多态性和分化的方法那么强大。在本章后面，我们将看到一种这样的方法，即 McDonald-Kreitman 检验。在比突变固定所需时间更短的时间尺度上，选择将改变种群中等位基因的平均频率。正如从上面讨论的不同固定概率所预期的那样，有利等位基因的平均频率将高于中性等位基因，而有害等位基因的频率则相对较低。对于新的突变，在频率 q 处发现的多态性密度由以下公式给出（Wright 1969，第 381 页）：

ν ( ) ( ) = −

其中 n 再次是突变的总速率。有利突变的 s > 0，而有害突变的 s < 0。

有利、中性和有害等位基因的频谱示例如图 7.6 所示。从分布中可以看出，有利的等位基因向更高的频率移动，而有害的等位基因向更低的频率移动。平衡选择将使等位基因保持在中间频率，平衡选择的确切形式极大地影响等位基因频率的特定概率密度。分布

多态性位点数

衍生等位基因的频率

图 7.6 有利（Ns > 0）、中性（Ns = 0）和有害（Ns < 0）突变的等位基因频谱。（Fay、Wyckoff 和 Wu 2001 年）

非同义

同义

图 7.7 弱有害非同义多态性存在的检验（P = 0.001；Fisher 精确检验）。多态性是指样本中出现不止一次的多态性；单态是仅出现一次的多态性。数据来自大肠杆菌中的 gnd 基因。（根据 Sawyer、Dykhuizen 和 Hartl 1987）。对于具有相对较强选择的变体（例如，|Ns| > 1），有害和有利等位基因的偏差将非常大。最强的有害突变会立即从种群中移除，而最强的有利突变会非常迅速地固定（或遭受快速的随机损失）；两者都很少处于多态状态。这些趋势意味着，在只有非常有害的突变和中性突变的位点，在中等大小的样本中观察到的等位基因频谱将更接近中性频谱。 Sawyer、

Dykhuizen 和 Hartl (1987) 提出了一种非同义多态性的中性简单测试方法，该方法基于

轻微有害和轻微有害之间的等位基因频谱差异。d 中性变异。

Sawyer 及其同事统计了单态非同义多态性的数量（即仅存在于一条染色体上的多态性）和存在于多条染色体上的多态性的数量（“多态性”）。

他们的样本（大肠杆菌中的基因 gnd）中的所有 12 个非同义多态性都是单态。然后，他们将这两个数字（12 个单态 vs. 0 个多态性）与同义多态性的配置进行了比较：34 个同义多态性是单态的，32 个是多态的（图 7.7）。在 2×2 列联表中比较这些值具有高度显著性，表明单态非同义变异过多。如果非同义多态性平均而言略有危害，这一发现正是人们所期望的。

除了简单地表明等位基因频率因选择作用于多态性而不同之外，人们还可以使用公式 7.15 并仅做一些假设（例如位点之间的自由重组）来找到与一组多态性相关的平均选择系数（例如，Sawyer 和 Hartl 1992）。也就是说，我们可以采用观察到的大量多态性的等位基因频率谱来估计公式 7.15（或类似方程）的选择参数。将选择参数本身视为分布也很有用，这样不仅可以估计选择的平均效应，还可以估计有利和有害突变的相对贡献。直接选择的等位基因频率谱的预期假设了一个平衡种群，因此任何非平衡种群人口统计甚至连锁选择都会混淆推论，因为两者都会影响频率谱（见第 8 章和第 10 章）。由于这些混杂因素，推断非同义位点选择参数的常用方法也使用同义位点或内含子位点来同时控制非平衡过程（例如，Loewe 等人 2006 年；Keightley 和 Eyre-Walker 2007 年；Boyko 等人 2008 年）。图 7.8 显示了 40 条人类染色体上 301 个基因的非编码、同义和非同义多态性的展开等位基因频谱。低频非同义多态性大量过剩。所有类型的高频多态性略有过剩，这归因于祖先状态的错误指定。（Williamson 等人，2005 年；版权所有 2005，美国国家科学院。）基因（Williamson 等人，2005 年）。在这种情况下，所有三类突变都与中性平衡预期不同，但可以通过对类别进行比较推断出过多的有害非同义多态性。

使用这些方法准确推断选择参数需要来自大量位点和较少染色体（大约 n = 10）的数据（Keightley 和 Eyre-Walker 2010）。有些方法利用固定差异（即 p = 1.0 的频率类别），有些则不利用，但并非所有使用固定差异的方法都利用了多态性的全频谱（例如，Bustamante 等人 2002）。使用固定差异可以提高检测出非常有利的等位基因的能力，否则这些等位基因不会被检测为多态性。然而，一些使用固定差异的方法容易得出高度偏斜的 Ns 值，这可能是因为必须对选择强度分布的形状做出假设。尽管如此，在介绍 McDonald-Kreitman 检验之后，我们将在本章末尾讨论几种此类方法。直接选择对多态性的平均频率有着深远的影响。虽然估计平均选择系数（或更准确地说，选择系数和种群大小的乘积）通常需要来自多个基因座的数据，但可以测试这些值是否不同于 0，或者选择系数在多态性类别之间是否不同（例如，非同义与同义）。虽然这些信息并没有告诉我们某个特定基因的历史，但它确实提供了选择影响的全局视图。在下一节中，我将介绍基于此处描述的期望的附加统计测试，这些测试将使我们能够了解特定基因座的历史。

通过类比本章前面列出的 dN 比较逻辑，我们可以在一个物种内比较每个非同义位点的非同义差异的平均数量（称为 pN）与每个同义位点的同义差异的平均数量(pS

pN

的计算很简单，结合了计算 p 的方法（第 3 章）和框 7.1 中描述的计算非同义和同义变化和位点的方法。只需要来自单个种群或物种内的序列。在大多数情况下，计算通常比物种间比较更容易，因为有限的多态性数量也会限制必须考虑的复杂密码子的数量。

pN

比率的解释也与 dN 大致相同，但有一个重要的例外。低于 1 的 pN

值再次证明了净化选择占主导地位，绝大多数编码位点都小于 1。可以对一些稍微有害的多态性进行采样，但由于它们的频率较低，因此对平均杂合性的贡献相对较小。当值大于 1 时，解释 pN

的主要区别是：因为正向选择会迅速固定有利突变，但在多态性研究中很少发现这些适应性变化。即使在直接选择固定的过程中采样了一两个这样的突变，pN 的增加也不太可能导致 pN 的值远高于 1。相反，我们发现在多等位基因平衡选择下的基因中 pN > 1——也就是说，在大量氨基酸多态性由某种形式的平衡选择维持的情况下，例如杂合子优势或负频率依赖选择。很少有基因似乎受到这种选择，主要组织相容性复合体 (MHC) 基因和其他免疫系统相关或性别和生殖相关基因是最突出的例外。Hughes 和 Nei (1988) 首次计算了人类和小鼠 MHC 基因座并发现值大于 1；令人困惑的是，他们将其统计数据称为 dN

正如要求 dN

大于 1 才能证明正向选择具有强有力的证据一样，pN

> 1 是检测平衡选择的一个非常严格的标准。在非常强的选择下，单个位点永远不会对 pN

的值做出足够的贡献，使 pN

大于 1，因此使用这种方法只能检测到极少数多等位基因选择的情况。即使在这些情况下，平衡选择的证据也可能仅限于已知的功能区域（如 Hughes 和 Nei 1988 年所述）。尽管如此，pN

的比较是种群遗传学家工具箱中的标准方法，接下来我们将看到如何将这些统计数据的细微修改与物种间差异相结合，以创建真正强大的自然选择测试。使用多态性和发散性检测选择

McDonald-Kreitman 检验

我们已经看到，通过比较 dN，我们可以从理论和统计上严谨的角度检测出正向选择的作用。但是，由于大约三分之二的可能编码突变会导致氨基酸发生变化，因此，只有当物种间所有差异中有三分之二以上是非同义的时，dN 才会大于 1。发生这种情况的选择性条件可能仅限于存在大量非同义差异的反复适应性固定的条件。在本节中，我将介绍由 McDonald 和 Kreitman (1991) 首次提出的一种检验方法，它类似于 dN，但可以原则性地绕过检测正向选择的非常严格的条件。该测试结合了多态性和发散性，以测试中性模型的预测。无论选择的强度如何，新的测试仍然无法仅通过一个或几个固定的差异来检测适应性进化——要做到这一点，我们将不得不等待下一章介绍的方法。但 McDonald-Kreitman (MK) 测试提供了我们拥有的最强大、最可靠的检测自然选择作用的方法之一。我首先解释测试是如何进行的，然后是其背后的推理和结果的解释。 McDonald-Kreitman 检验的实验设计

对单个基因进行 MK 检验所需的四个量是

非同义多态性的数量（PN

）、同义多态性的数量（PS

）、非同义固定差异的数量（DN

多态性

非同义

同义

图 7.9 McDonald-Kreitman 检验。

所需的四个计数是

非同义固定差异的数量（Dn

同义固定差异的数量（DS

非同义多态性的数量

）和同义多态性的数量（PS

和同义固定差异的数量

）。这些值放在 2 × 2 列联表中（图 7.9），以及标准独立性检验——当计数较低时通常是 Fisher 精确检验，但 c2 或

大样本近似的 G 检验——可用于计算显著性。

用于计算显著性的一般实验设计确定这四个量需要从单个物种中取样多个染色体，以及从第二个物种中取样单个染色体或多个染色体。当从多个物种中取样多个染色体时，可以合并多态性计数（如 McDonald 和 Kreitman 对果蝇、拟果蝇和果蝇的 Adh 基因的原始研究），或者可以对每个物种分别进行单独的测试，特别是当物种之间的 PN 比率存在显着差异时。一般来说，MK 测试对于从真正的“种群”中取样染色体相当稳健：从一个物种中的多个亚种群中取样一个染色体不会导致错误的正向选择推断，尽管它可能导致其他错误的结论（见下文）。 MK 测试中使用的所有值都是计数——无需计算非同义或同义位点的数量。虽然当同一密码子中同时发生非同义和同义变化时，仍可能存在一些涉及复杂密码子的问题，但可以使用框 7.1 中概述的相同方法解决这些问题（尽管 MK 测试中仅使用整数值）。使用标准 MK 测试时，与样本量有关的确定偏差问题很少，因为不使用等位基因频率，但显然必须确定所有突变，而不管它们是非同义的还是同义的（基因分型平台通常会丰富非同义变体）。事实上，只要样本中存在足够的多态性和固定差异，人们实际上只需要从一个物种中取两条染色体和一个外群中取一条染色体就可以进行测试。多少才足够？除非行计数总和和列计数总和均为 4 或更大（即，无论突变类型如何，至少存在四个多态性和四个固定差异），否则在 2 × 2 测试中不可能获得小于 0.05 的 P 值。因此，应继续进行采样——根据需要从种群中或更远的外群中收集更多染色体——以增加统计能力。否则，将无法获得具有统计意义的结果。 MK 检验中散度计算的一个重要区别是，在 McDonald-Kreitman 检验中，我们明确计算样本中 DN 值的直接选择固定差异。在这种情况下，固定差异意味着在种群样本中发现的等位基因的身份与在外群中发现的核苷酸不同。这与计算 dN 时使用的术语散度含义略有不同。如果种群样本中某个位置有两个不同的等位基因，并且它们都与外群不同，那么我们将它们算作一个多态性和一个固定差异。虽然在少数染色体中发现的固定差异可能不是物种范围内的固定差异，但只要使用相同的标准来调用非同义和同义固定差异，这个定义就没有问题。事实上，MK 检验中的固定差异不一定来自仅两个物种的比较。在从三个物种中取样染色体的情况下，无论是否从所有物种中收集了多态性数据，我们都可以极化单个谱系的变化以用作固定差异。最好将谱系上的极化变化与从同一谱系的尖端收集的多态性数据进行比较，因为我们预计中性突变率在这种比较中最为相似。此外，可以通过比较基因重复之间的固定差异来进行 MK 检验，即使它们属于同一物种。然而，这种类型的比较有额外的注意事项，应仔细考虑（见下文）。对多态性和发散程度的期望 McDonald-Kreitman 检验明确依赖于基于分子进化中性理论的期望。上面列出的 2 × 2 表测试了多态性和发散性中非同义和同义变化的比例是否相同。测试中使用的四个值的中性期望为：

N e nonsyn nonsyn

其中 mnonsyn

是非同义位点的中性突变率，msyn

是同义位点的中性突变率，a 是 Watterson 对样本大小的校正（公式 3.6），Lnonsyn

分别表示非同义和同义位点的数量。回想一下，我们需要两个不同的中性突变率，因为对于任何特定基因的非同义和同义位点，所有中性突变的比例都会有所不同。之前我们假设 mnonsyn

等于某个 f比例，f0

总突变率，n，并且 msyn

等于总突变率，因为所有同义突变都是中性的。不管这些

分数是多少，也不管所有同义突变是否真正具有选择性

等效性，如果我们假设两种类型的位点内随时间推移的中性突变率相同，则两个 PN

的比率等于 mnonsyn

。或者，我们可以将 MK 检验视为非同义和同义突变的多态性与发散性比率的比较，解释没有变化。在这种情况下，两个 PN

等于 4Ne

/2t，至少在单个基因座内。

在任一比较中，2×2 表中的内置期望是比率应该相等。这一预期是在假设所有观察到的多态性和固定差异都是中性的前提下得出的：没有有利突变的固定，样本中也没有发现平衡的多态性或有害的多态性。如果满足这一假设（通常不满足），McDonald-Kreitman 检验将不显著。因此，该方法明确测试是否存在正向选择的固定，或者是否存在平衡和/或轻微有害的多态性。当存在强烈的净化选择时，MK 检验将不显著——在强烈的净化选择下比率的期望与没有选择时完全相同。与 dN 的比较不同，检测净化选择不是该方法的目的。如果我们将非同义和同义位点的数量作为两个附加单元格，并将表格变成 3 × 2 表格，我们将能够推断是否存在任何净化选择的特征，但这种方法通常不使用。此外，当多态性和固定非同义差异过多时（即 pN > 1 和 dN > 1），MK 检验将不显著。在这些情况下，表中的比率将相同，而且，同样，由于我们在测试中不使用位点数，我们将无法检测到这种偏离中立性的情况。解释 McDonald-Kreitman 检验

图 7.10 显示了原始

非同义

多态性

同义

图 7.10 带有正向选择证据的 McDonald-Kreitman 表，其中有

P = 0.007；Fisher 精确检验。数据来自果蝇、拟果蝇和 D. yakuba 的 Adh 基因的多态性和固定差异。（根据 McDonald 和 Kreitman 1991 年的研究。）

McDonald 和 Kreitman (1991) 对 Adh 基因的研究。非同义多态性与同义多态性的比例为 2:42，而发散的比例为 7:17。这些数据的 McDonald-Kreitman 检验得出 P = 0.007，通常被解释为显示适应性自然选择的证据。这种解释来自比较中非同义固定差异的明显过量。当然，这是一个 2×2 独立性检验，因此显著结果可能是由于任何细胞中计数过量或不足造成的。然而，正向选择的解释是生物学动机的，因为同义变体数量不会发生大的变化（而非同义变体数量不会随之发生变化）。在下一节中，我们将讨论几种由于违反了方法的假设而导致这种解释可能不正确的情况。直接选择

当氨基酸替换反复固定时，基因中非同义固定差异会显著增加，例如 dN

> 1。但请注意，MK 测试所需的固定次数比 dN 比较要低得多（事实上，对于同三种果蝇之间的 Adh，为 0.114）。无论选择有多强，MK 测试仍然无法检测到仅对一个或几个替换的正向选择，但其效力大大增加。此外，与 dN

和 MK 测试一样，我们不知道选择了哪些特定的氨基酸。

MK 检验的真正威力在于，它使用多态性数据 (PN) 作为非同义中性突变与同义中性突变比率的代理，而没有正向选择变异的贡献。虽然很明显，正向选择将如何影响固定差异的数量，但有利突变在群体中传播时作为多态性所花的时间太短，因此预计它们对 PN 的贡献不大。Smith 和 Eyre-Walker (2002) 提供了一个显著的例子，说明适应性突变对多态性和发散的贡献存在二分法：如果平均优势为 Nes = 25 的突变以中性突变率的 1% 发生，它们将控制占所有固定差异的 50%，但仅占所有多态性的 2%。因此，假设非同义和同义位点的中性突变率随时间保持不变，任何由于正向选择而产生的过量非同义固定差异都将在 2×2 表中显示为 DN 比率增加，并且 MK 检验将显著（假设采样了足够多的变异位点）。除了由于非同义固定差异过多而显著之外，当非同义多态性过多时，MK 检验也可能显著。样本中所有非同义多态性都是中性的假设经常被违反。事实上，即使是 McDonald 和 Kreitman 的原始 Adh 数据也包括众所周知的平衡氨基酸多态性（Hudson、Kreitman 和 Aguadé 1987）。虽然单个位点上的平衡选择预计会提高链接位点的多态性水平（见下一章），但这种增加应该同样影响链接的中性非同义和同义多态性；只有单一的平衡多态性才会导致 PN 比率的过度变化。一般来说，平衡选择似乎是非同义多态性显著过剩的有限解释。只有当存在强大的多等位基因平衡选择时，才会出现多种氨基酸多态性的过剩，在这些情况下，也可能存在非同义固定差异的过剩，导致不显著的氨基酸多态性显著过剩的更常见解释是这些变体略有有害。图 7.11 显示了 McDonald-Kreitman 表的一个示例，其中非同义多态性显著过量（Nachman、Boyer 和 Aquadro 1994）。如果这些变异有轻微的有害性，它们将增加非同义多态性的水平，但不会被固定。请注意，这仅适用于弱有害变异——强有害突变不会增加

非同义

多态性

同义

图 7.11 有弱有害多态性证据的 McDonald-Kreitman 表（P = 0.004；Fisher 精确检验）。数据来自 ND3 基因，多态性数据来自 Mus domesticus，并且相对于 M. spretus 有固定差异。（nachman、

Boyer 和 Aquadro 1994 年）

频率可观，因此不太可能被采样；在这些情况下，MK 检验将不显著（Akashi 1999）。

但是，任何关于样本中存在轻微有害多态性的推断都可能受到染色体采样方式的强烈影响。尽管我之前说过，物种内染色体的非随机采样不太可能导致 MK 框架中非同义固定差异明显过剩，但非同义多态性过剩的情况并非如此。异常高数量的氨基酸多态性是由弱有害多态性引起的结论基于样本来自单一种群的假设。例如，如果从不同的亚种群中抽取单个个体，则每个亚种群中的局部适应可能会导致许多氨基酸的差异。这些差异可能会被误解为弱有害非同义多态性过多，而不是局部适应性多态性过多。虽然这种采样方案似乎不寻常，但它在亚种群内变异程度较低的物种中很常见，例如自交植物拟南芥。这些轻微有害的多态性预计在种群中出现的频率较低（见公式 7.15），这一事实无助于区分有害和局部适应性变体：因为每个地区只抽取一个种质，在这两种情况下，非同义变体在样本中的频率可能较低，但在亚种群中的频率可能较高。 MK 检验的方法扩展

非中性多态性（尤其是轻微有害的多态性）的存在可以掩盖正向选择模式。要了解为什么会出现这种情况，请考虑一个假设的位点，该位点既具有过多的固定适应性非同义替换，又具有过多的轻微有害的非同义多态性（图 7.12A）。如果只比较多态性和固定位点的数量，MK 检验就不会很显著（图 7.12B；P = 0.093）。这是因为 MK 检验假设所有多态性都是中性的：过多的有害非同义多态性会增加非同义与同义分离位点的比例，使得看起来在中性进化的情况下，大量非同义固定差异是可以预料的。

我们该如何处理令人困惑的存在轻微有害等位基因？ Templeton (1996) 建议扩展 MK 检验，将

单一多态性（两种类型）与所有其他多态性区分开来。由此产生的 3 × 2 表（图 7.12C）试图解开轻微有害等位基因的影响

直接选择

分离位点数

非同义

同义

非同义

同义

1 2 3 4 5 6 7 8 9固定

具有衍生等位基因的个体数

多态性

单一

非同义

非同义

同义

多态性

同义

图 7.12 一个假设的基因例子，其中低频和固定非同义差异过多。 (A) 假设某个基因的非同义和同义变化的等位基因频率谱，样本染色体数为 n = 10。固定等位基因被包含在频率区间中。

(B) 该基因的标准 McDonald-Kreitman 表 (P = 0.09；Fisher 精确检验)。(C) Templeton (1996) 提出的 3 × 2 表，将单一多态性与所有其他多态性区分开来 (P = 0.07；Fisher 精确检验)。(D) Fay、Wyckoff 和 Wu (2001) 提出的 2 × 2 表，仅包括在一条以上染色体上发现的多态性 (P = 0.04；Fisher 精确检验)。

有害多态性（预计在低频下过度表达）与中性多态性（在较高频率下存在）之间的差异。虽然低频下存在中性非同义多态性，但在中性下也应该有一定比例的同义多态性（频率相同）。该表本质上是 Sawyer、Dykhuizen 和 Hartl（1987；图 7.7）提出的检验和 McDonald-Kreitman 检验（图 7.9）的组合。Akashi（1999）提出了对这种方法的进一步扩展，比较了非同义和同义等位基因（而不仅仅是单例和多例）的全频谱，并将固定差异作为频率类别之一（如图 7.12A 所示）。他表明，这种方法比标准 MK 检验和 Templeton 对该检验的扩展都更有效，尽管可能需要大量的多态性才能充分填充每个频率类别。在 3×2 表中或使用全频谱进行显著性检验可以提供更大的能力来检测过多的适应性固定差异，但当不同频率类别中非同义差异与同义差异的比率不同时，结果也可能难以解释。Fay、Wyckoff 和 Wu (2001) 进行了一项更为简单的比较，他们只是简单地删除了样本中频率 <15% 的所有多态性。他们表明，通过删除低频多态性 - 并使用常见多态性和固定差异简单地进行 2×2 检验（图 7.12D；P = 0.045） - 他们能够更轻松地检测出适应性自然选择的模式。尽管 Fay、Wyckoff 和 Wu 使用的 15% 截止值似乎有些武断，但事实证明，这个值是解决有害氨基酸分离问题的近乎最优的解决方案，尽管仍会错过许多正向选择的情况（Charlesworth 和 Eyre-Walker 2008）。在大多数中等大小的样本中，只需从 MK 检验的多态性计数中去除单个样本，就会产生类似的效果。

MK 检验的假设

在考虑进一步使用 McDonald-Kreitman 检验之前，值得回顾一下从该检验中得出推论时所做的主要假设。总体而言，我们可以相当有信心地说，使用 MK 检验得出的正向选择推论对大多数假设都是稳健的，包括染色体的采样方式、样本的近期种群历史、非中性多态性的存在、位点之间的重组，甚至所有同义突变的选择性等效性。最重要的假设可能只是在检测非同义与同义差异时没有偏差。然而，有几种情况下，检验的假设可能会被违反，从而导致拒绝零假设，特别是对于下一节中讨论的 MK 检验的几种新用途。MK 检验最不切实际的假设可能是，无论是非同义变化还是同义变化，中性突变率都会随时间保持不变。对于非同义变化，这意味着所有中性突变的比例不会随时间而变化（即选择性约束是恒定的），即使该值可能对有效种群大小 Ne 的变化非常敏感。明确地说，这个假设来自于这样一个事实：在 2×2 独立性检验中，对 PN 的期望等于 mnonsyn；如果这些速率随时间而变化，那么这个假设就不再成立。在大多数情况下，我们预计，即使约束确实在单个基因上随时间而变化，这种变化也不具有方向性，因此对 MK 检验的影响很小（Fay 和 Wu 2001；图 7.13）。

然而，在整个种群层面，有效种群规模随时间持续变化可能会导致约束水平出现全面差异。例如，如果一个感兴趣的物种的种群规模在遥远的过去（大多数固定差异积累时）平均小于样本的近期历史（大多数多态性积累时），那么我们预计固定差异的中性突变率会高于多态性，因为目前有一定比例的轻微有害突变实际上是中性的。这种直接选择发散µ非同义/µ同义多态性图 7.13 非同义突变与同义突变比率的假设变化，这些突变会固定或多态。对于单拷贝基因（红线），选择强度可能随时间而变化，箭头表示在多态性数据中发现的比率。对于新复制的基因（黑线），选择强度最初是放松的，然后在获得新功能时发生变化（用星号表示）。在这些情况下，将多态性与发散进行比较可能会产生误导。（根据 Fay 和 Wu 2001 修改。）这种情况可能导致拒绝不是由于正向选择的零假设。相反，种群规模可能在最近崩溃，增加了中性突变的比例，并使其看起来好像存在大量有害的分离多态性。最近的种群规模较小也可能导致分离多态性的数量较少，从而降低测试的整体统计能力（例如，Parsch、Zhang 和 Baines 2009）。一般而言，种群规模变化的幅度必须非常大才能对大多数正向选择推论产生影响（Eyre-Walker 2002）。为了排除最近种群规模增加是导致他们在果蝇中观察到的适应性自然选择模式的原因的可能性，Fay、Wyckoff 和 Wu (2002) 测试了增加种群规模模型的几个辅助预测。他们比较了非洲果蝇和非非洲果蝇的 PN 比率，以查看非洲以外（该物种的本土范围）的比率是否较低，结果没有发现差异。他们还询问非非洲样本中是否存在更多罕见的非同义变体（如果对有害多态性的平均选择效应增加，则可能出现这种情况），结果没有发现差异。最后，他们推断，总体人口规模的增加将影响基因组中的所有基因，导致 DN 比率全面增加；相反，他们发现基因之间存在异质性影响，一组中性进化基因和一组适应性进化基因之间存在显着差异。总之，这些结果表明，人口规模变化不是产生误导性正向选择模式的原因。有一种情况是，MK 测试（以及恒定中性突变率假设）将不断被违反，以至于在没有发生任何正向选择时会推断出正向选择。这种情况是最近的基因重复（如 Jones 和 Begun 2005；Thornton 和 Long 2005；Arguello 等人 2006 中所述）。基因重复进化的一个常见模式是，对新复制的基因的选择较为宽松（详见 Conant 和 Wolfe 2008；Hahn 2009）。如果在重复历史的早期几乎没有约束，那么许多非同义固定差异将会积累，因为它们是中性的。如果选择在最近变得更强——例如当重复发现新功能时——那么非同义多态性与同义多态性的比率将提供与发散截然不同的图景。这一结果可能导致拒绝中性假设，并解释基因重复历史中的正向选择，仅仅是因为相对于非同义多态性而言，固定的非同义差异过多。但编码序列上的正向选择并不一定发生，因为环境变化——甚至是一个有利的调节变化——可能是新功能和随之而来的选择压力变化的原因。MK 检验的第二个主要假设是样本中非同义和同义差异的平均谱系历史是相同的。在非重组区域中，这显然是正确的：只有一个（可能是未知的）谱系与所有样本相关，因此与所有位点相关。然而，在重组中，序列的不同部分具有不同的谱系，因此它们最近的共同祖先的时间可能更长或更短（因此分离位点更多或更少）。如果距离最近的共同祖先的时间与某个区域中的非同义或同义变化之间存在关联，则每种类型的分离位点数量可能会有所不同，这仅仅是因为各个区域之间的进化差异（有关进化差异的讨论，请参阅第 6 章）。明确地说，这个假设来自于这样一个事实：在 2×2 独立性检验中，对两个 PN 的期望都等于 4Ne /2t。如果样本的 MRCA 的预期时间（此处用 Ne 的值表示）在不同区域之间不同，则此假设不成立。但由于基因座内的非同义和同义变化通常相互交错，因此预计平均谱系相同。对于单个基因，即使非同义和同义变化在空间上是分开的，相邻区域的谱系中也不太可能存在较大的差异。在这两种情况下，2×2 表中需要考虑的唯一方差来源是染色体和突变之间的抽样方差。然而，越来越多的情况是，被比较的突变类别（例如，非同义和同义）在基因组中是空间分离的（见下一节）。在这些情况下，应用 2×2 独立性检验不再合适，因为相对于非重组位点，区域间分离位点预期数量的方差被夸大了。这种夸大的方差导致中性模型的错误拒绝增加（Andolfatto 2008）。尽管此类应用确实违反了 MK 检验的假设，但仍有几种解决方案。Andolfatto (2008) 建议进行重组合并模拟，以建立更准确的假设检验显著性水平。此类模拟可用于模拟基因座之间的任何重组量，因此可用于各种情况。或者，测试可以明确考虑进化和抽样方差。HKA 检验（见第 8 章）在概念上与 MK 检验相似，但旨在用于多个不相关的基因座；因此，该检验的统计框架纳入了预期的方差增加。下一章将详细阐述该检验方法，但现在只需说明，如果不同类别的位点没有相似的谱系，则必须使用考虑基因座间进化差异的检验方法。

MK 检验方法的生物学扩展

MK 检验方法的关键见解是，通过比较不同类别的位点（受选择的位点与假定不受选择的位点），我们可以在很大程度上控制这样一个事实：种群不太可能满足 Wright-Fisher 模型的所有平衡假设。换句话说，与假定无功能的多态性类别进行比较，可以为由于人口统计学或连锁选择而导致的非平衡历史提供内部控制。鉴于这一见解，我们自然会问，是否可以在其他类型的多态性之间进行这种比较，特别是如果它们可以自然地分为选定类别和非选定类别。事实上，已经对 MK 测试进行了几种不同的扩展，以测试不同类型突变中的选择。Akashi (1995) 比较了果蝇中优选和非优选同义替换的多态性和差异。在这种生物和其他生物中，经常发现编码相同氨基酸的多个同义密码子中的一个比其他密码子更受青睐，无论是在翻译准确性方面还是在翻译效率方面（参见 Plotkin 和 Kudla 2011 的评论）。在这些情况下，优选密码子被称为优选密码子，而非优选密码子被称为非优选密码子。Akashi 没有比较 MK 表中的非同义和同义变化，而是使用了优选和非优选同义变化，并能够证明许多非优选多态性具有弱有害性。由于同义变化再次在单个基因中相互交叉，因此 MK 检验的这种扩展不会出现与进化方差增加相关的问题。MK 检验的进一步扩展检查了调控序列的多态性和分歧。该应用最初由 Ludwig 和 Kreitman (1995) 以及 Jenkins、Ortori 和 Brookfield (1995) 提出，但此后已应用于越来越多的数据集（例如，Crawford、Segal 和 Barnett 1999；Kohn、Fang 和 Wu 2004；Andolfatto 2005；MacDonald 和 Long 2005；Holloway 等人 2007；Jeong 等人 2008）；类似于 dN 的测试也可用于调控区域（例如 Hahn 等人，2004 年）。这些测试比较非编码区域中的结合位点以及散布在不结合转录因子的位点或附近区域的同义位点。在比较多态性和不相连（或仅松散相连）区域的固定差异的情况下，必须再次谨慎考虑基因座之间的不同历史（Andolfatto 2008）。与解释进化方差几乎同样重要的是编码区非同义变化和非编码区调控变化的进化之间的几个重要差异（Hahn 2007）。首先，因为功能性调控序列通常仅在单个物种中表征，所以在物种间比较中将功能同源性分配给一组同源核苷酸并不总是必要的。实验验证的结合位点存在于一个研究充分的焦点物种中，而其他物种中可能不存在；相反，在焦点物种中没有已知功能的序列实际上可能是用于比较的其他物种的结合位点。这两种类型的错误都会导致核苷酸分类错误、选择强度和方向估计错误以及违反中性突变率恒定的假设。第二个警告是结合位点的遗传密码目前未知。我们几乎没有关于结合位点变化对结合亲和力的影响的信息。尽管将结合位点内的任何变化归类为选择在很大程度上是一种假设，但它可能与将蛋白质中的任何氨基酸变化视为功能相关一样好。将 MK 测试应用于调控序列的第三个主要警告涉及正向选择的作用方式。虽然蛋白质中氨基酸的重复替换似乎是正向选择的良好证据，但很难想象这在调控区域中究竟如何起作用。这种怀疑源于调控序列的一些重要特征：结合位点通常不限于特定位置，结合位点经常通过点突变出现，结合位点的多次变化通常会导致结合亲和力的完全丧失（Wray 等人 2003 年综述）。这些原因都不排除自然选择以这种方式发挥作用；相反，它们只是表明，由于定向选择而可检测到重复替换的情况很少见。考虑到所有这些警告，实际上有一些通过使用非编码区域上的 MK 测试检测到正向选择的例子。Crawford、Segal 和 Barnett（1999）研究了两种鳉鱼亚种 Fundulus heteroclitus 之间 Ldh-B 基因座调控区域的变异。他们发现，与散布位点的替换相比，负责转录因子结合的核苷酸存在过多的固定差异，并且物种间 Ldh-B 调节序列驱动的表达存在差异。这些结果与导致调节突变固定的重复正向选择一致。

总结整个基因组的选择

鉴于 McDonald-Kreitman 测试对多个基因的结果，我们希望能够比较基因之间的结果或总结单个基因组的结果。从 2×2 列联表测试中获取的 P 值并不适用于基因之间的比较。这种情况的一个原因是，具有正向选择证据的基因和具有分离有害多态性证据的基因可以具有相同的 P 值。第二个原因是 P 值高度依赖于每个细胞中的计数 — 因此，无论选择强度如何，更长或进化更快的基因将具有更极端的 P 值。简单地将基因间的列联表相加以增加计数也不是一个好的解决方案，因为它会导致误导性的结果（Shapiro 等人，2007 年；Stoletzki 和 Eyre-Walker，2011 年）。为了提供一个简单的汇总统计数据，为 MK 检验的 2 × 2 列联表提供可解释的值，Rand 和 Kann（1996 年）提出了中立指数 (NI)：在中立的情况下，中立指数的预期值为 1，因为的比率应该相等。大于 1 的值表示非同义多态性过量，小于 1 的值表示非同义固定差异过量。中性指数或其变体（见下文）已被广泛用于比较生物体和基因之间的分子进化模式。如原始论文所述，“该指数旨在提供偏离中性的方向和程度的定性指标”（Rand and Kann 1996，第 737 页）。仍然必须计算 P 值才能推断出与 NI = 1 的统计显着偏差，但该指数允许快速比较基因之间的进化力量。

除了一般的偏差问题和作为比率的比率的统计数据中的方差增加问题之外，在解释 NI 时还存在几个问题。当 DN 的值为 0 时会出现一个问题。在这些情况下，NI 未定义，无法为此类基因计算任何值。此问题的常见解决方案是在 2×2 表中的每个单元格中添加一个“伪计数”1，这确保 NI 被定义，尽管假设检验应该在没有伪计数的情况下进行。第二个问题是因为 NI 值不围绕 1 对称，因为 NI = 2 和 NI = 0.5 代表与中性预期的等效偏差，但幅度却有很大差异（Stoletzki 和 Eyre-Walker 2011）。解决这个问题的方法是取 NI 值的对数（或负对数），这会产生对称偏差（例如，Tachida 2000；Presgraves 2005）。负对数还具有令人愉悦的美学副作用，即对显示具有正选择系数的替换证据的基因赋予正值，对显示具有负选择系数的多态性证据的基因赋予负值（Li、Costello 等人，2008 年）。

图 7.14 显示了酵母、苍蝇和人类中数千个基因的负对数（NI）值，并立即证明了苍蝇中显示正选择证据的大量基因。

一个相关的统计数据是 a，旨在表示由正选择固定的非同义替换的比例（Smith 和 Eyre-Walker，2002 年）。

a 的值由以下公式给出：

H. sapiens

D. simulans

−log10[中性指数]

S. cerevisiae

图 7.14 人类、苍蝇和酵母的中性指数。每个点代表特定基因的中性指数 (nI) 以及与该基因的 McDonald-Kreitman 检验相关的 P 值。为了绘图目的，nI 定义为 + 1)，并显示这些值的负 log10。每个图中的下部水平线代表 P = 0.05；上部水平线代表 Bonferroni 校正的 P = 0.05/n，其中 n 是进行的测试次数。（来自 li, Costello, et al. 2008.）这与 1 − NI 相同（Smith and Eyre-Walker 2002）。事实上，a 不是一个比例，因为它可以取负值。最好将 a 视为一个汇总统计数据，因为不清楚当 a 为负值时（即当存在过多的非同义多态性时）如何解释 a。然而，正值确实代表了由于适应性自然选择而导致的氨基酸替代过量。与为基因组中的每个基因计算单独的值相比，a 最常用于汇总基因间的数据。这可以通过以无偏的方式对基因间的 DN 计数进行平均来实现。不幸的是，概述此汇总方法的原始论文描述了违反辛普森悖论（即组合两个数据集可能导致两个数据集中均不存在的结果）或詹森不等式（即比率的平均值不等于平均值的比率）的程序。虽然存在用于计算 a 的最大似然法（Bierne 和 Eyre-Walker 2004；Welch 2006），但最近的研究提供了一种简单的无偏方法来计算大量基因的平均 a（Stoletzki 和 Eyre-Walker 2011）：

其中下标表示总共 m 个基因集合中的第 i 个基因。

计算果蝇和果蝇基因组中非同义差异的 a 发现 a = 0.54，这是正向选择替换的很大一部分（54%；Begun 等人 2007）。

最后，通过将等位基因频率谱数据与固定差异数据相结合，有几种方法能够更好地估计由正向选择固定的非同义替换的比例（例如，Boyko 等人，2008 年；Eyre-Walker 和 Keightley，2009 年）。这些方法使用 Templeton（1996 年）和 Fay、Wyckoff 和 Wu（2001 年）提出的推理，首先考虑轻微有害的非同义多态性的存在，然后再估计这一比例。虽然方法略有不同——Eyre-Walker 和 Keightley 使用折叠等位基因频率谱，而 Boyko 等人使用展开谱——两者都试图首先通过与同义多态性谱进行比较来估计非同义多态性的比例和频率。通过将人口统计学模型拟合到同义数据集并假设所有非同义多态性都是中性的或有害的，这些方法可以估计由于适应性自然选择而导致的非同义固定差异的比例。这种方法和类似的方法也可用于计算联合参数 g = 2Ne s 的值（也容易混淆地表示为 a），该值表示选择对非同义变体的平均影响（Keightley 和 Eyre-Walker 2010）。Si模拟结果表明，如果收集大量基因的数据，即使样本量很小，这些方法也可以提供平均值的准确估计；准确估计单个基因座的参数需要更大的样本量（Keightley 和 Eyre-Walker 2010）。随着测序变得越来越便宜，甚至对有害和有利突变频率的单基因座研究也将成为可能。

选择 8

在上一章中，我们讨论了自然选择对影响生物体适应性的个体突变的影响。如果单一类型的突变足够多（例如有利的非同义突变），那么我们通常可以对主要的选择模式做出有力的推断。然而，前面描述的方法都不能用于检测对单个有利突变的选择，无论它有多大的影响，也不能用于检测对单个平衡多态性的选择。为了识别这种选择性变异，我们必须考虑它们对连锁中性变异的影响：多态性本身对适应性没有影响，但会受到附近发生的选择的影响。虽然使用连锁中性变异的方法通常仍然局限于检测强烈的近期选择，但它们或许是了解基因组近期选择历史的最佳窗口。我研究了连锁选择对变异的三个不同方面的影响，并针对每个方面讨论了旨在检测选择对这种变异特定方面的作用的测试。

使用多态性的数量检测选择

选择对连锁中性多样性的水平有相对直接的影响：它可以提高或降低它们。了解中性变异水平上升或下降的一般条件将有助于我们直观地了解选择测试如何工作以及可以检测到哪些选择模式。

正向选择对连锁中性水平的影响

... (A) 有利突变（以星号表示）出现在中性谱系中。(B) 有利等位基因的频率增加，但尚未在种群中固定。(C) 有利等位基因已固定，所有染色体在其出现后不久就合并。为清晰起见，显示了从样本根部延伸的分支。

所有完全连锁的变异都被扫除，唯一剩余的变异发生在过渡到固定期间。短语搭便车（或 Maynard Smith 和 Haigh 的原始拼写为“搭便车”）强调了这样一个事实：恰好位于有利突变发生的幸运染色体上的中性多态性的频率也会增加（图 8.1）。

这些搭便车者也将在种群中固定，除非距离选定基因座更远的重组将它们与有利等位基因分开。

为了更定量地了解选择性清除如何减少基因位点的多态性，请考虑突变在群体中固定所需的时间。这段时间决定了会有多少变异：在最极端的例子中，所有染色体都来自一个包含上一代发生的高度有利突变的单一谱系。在这样的群体中几乎没有变异，因为所有多态性都必须在一代中发生。突变固定所需的时间越长，相关多态性积累的时间就越长。例如，在固定的条件下，中性突变大约需要 4Ne 代才能固定（Kimura 和 Ohta 1969），尽管与这一预期相关的方差很大（Kimura 1970）。中性突变的固定时间与中性谱系中所有谱系融合到其最近的共同祖先所需的时间之间存在明显的联系，这也接近 4Ne（公式 6.3）。因此，中性基因座的变异量（以及谱系的形状和高度）与中性变体固定所需的时间密切相关。现在想象一下，一旦在二倍体种群。这种突变的修复时间是

（Nei 1973，第 383 页）：

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[[Category:遗传学]]

第三章描述变异

2025-08-26T09:10:43Z

Magezeya：

一旦我们从感兴趣的种群中获得序列样本，我们就必须描述观察到的变异。有很多方法可以总结单个核苷酸、微卫星和完整序列的分子变异，因此有很多不同的统计数据来描述数据。统计数据只是观察样本（序列）的总结。<u>在分子群体遗传学中，我们倾向于关注那些作为理论参数 θ (≡4Neμ) 估计量的统计数据，它表示在假设种群中常染色体基因座处发现的变异量</u>，其中所有变异都是中性的，并且处于突变漂移平衡状态。这种关注的动机是希望将我们的经验观察与中性模型的理论预测联系起来，该模型既包括自然界中发现的多样性数量，也包括具有不同 θ 值的种群中选定突变的预期动态。然而，值得注意的是，下面讨论的统计数据只是在相对严格的假设下对 θ 的估计——即理想化的无选择种群和人口平衡，以及每个突变模型特有的额外限制。还有其他方法可以理解这些统计数据，在本章后面，我将讨论对变异摘要的几种不同解释。

还有越来越多的最大似然 (ML) 和贝叶斯方法可用于从数据中估计参数 θ（例如，Kuhner、Yamato 和 Felsenstein 1995；Nielsen 2000；Beerli 2006）。一些基于似然的方法甚至可以从预先确定的 SNP 面板而不是完整序列数据中估计 θ，只要确定方案是精确已知的（例如，Kuhner 等人 2000）。虽然这些方法越来越受欢迎，并且比基于矩的估计器具有一些优势，但它们也有一些重要的局限性。这些限制大多是计算上的：可以分析的数据集的大小（就样本数量和序列长度而言）是有限的。这些方法不能扩展到全基因组（甚至整个染色体）数据集。此外，许多基于可能性的方法（ML 和贝叶斯）在处理缺失数据时效果不佳，这一限制尤其适用于可能对核苷酸具有可变覆盖范围的全基因组重测序项目。随着计算工具和资源的改进，许多这些问题将被克服，但在这里我将仅讨论一些最常用的从简单数据摘要中总结序列多样性的方法。

== 序列多样性测量 ==

=== 无限位点模型下 SNP 的 θ 的常用估计量 ===
对于单个核苷酸多态性，某个位点的第 i 个等位基因的样本频率为 pi，因此所有等位基因频率之和等于 1。如果我们只考虑双等位基因位点，那么显然 p1+p2 = 1。总结单个多态性位点变异的一个有用方法是计算样本杂合性，其公式如下：

[[文件:MPG--11.png|无框]]

其中 n 是样本中的序列数。虽然这个值可以根据从杂交个体、近交系或单倍体染色体获得的数据计算出来，但它被称为<u>'''杂合性heterozygosity'''</u>（或更确切地说，<u>预期杂合性 expected heterozygosity</u>），因为它是如果配子随机结合（即，如果染色体随机配对以产生二倍体个体），则所有个体中杂合子的比例的估计值。事实上，无论数据来源如何，通常将许多核苷酸多样性测量称为杂合性测量。

鉴于单个位点的多样性测量，我们现在考虑整个序列的多样性测量。有两种方法最常用于总结核苷酸多样性，因为它们不需要分配衍生和祖先等位基因（使用此信息的其他测量如下所述）。根据我们上面对单个位点杂合性的定义，我们可以将'''位点杂合性的总和'''定义为：
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其中 S 是分离位点的数量，hj是第 j 个分离位点的杂合性，如公式 3.1 中定义的那样（Nei 和 Li 1979；Nei 和 Tajima 1981a；Tajima 1983）。<u>在平衡状态下的二倍体 Wright-Fisher 种群的无限位点模型下，'''E(π) = θ'''，这就是为</u>什么这个统计数据有时被称为 '''θ<sub>π</sub>'''。作为参数估计量的统计数据通常用<u>上面的插入符号表示，</u>但我不会在这里使用这种符号。因为单态位点的杂合性为 0，所以我们也可以对比对中的所有位点求和，而结果没有变化。计算图 1.1 中所示的比对的 π，我们发现六个多态性的位点杂合度分别为 0.5、0.667、0.5、0.667、0.5 和 0.5，得出 π = 3.33。我们经常给出的是每个位点的平均值，在这种情况下π = 3.33/15 = 0.222。

这个多样性度量给出了任意两个序列之间成对核苷酸差异的平均数量，因此也可以计算为：

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kij是样本中第i个和第j个序列之间的核苷酸差异数量，分母表示n个序列之间进行的唯一比较的数量。如果我们要计算图1.1中四个序列的六个可能的成对比较中的每一个的差异数量，我们会再次发现平均差异数量为3.33。如果序列数量很大，使用公式3.2计算π比使用公式3.3计算π要有效得多。

正如本书前面所讨论的，<u>我们在计算序列之间的差异时经常忽略插入/缺失变异。当应用公式 3.2 时，具有插入/缺失的单个序列被视为缺失数据，因此在计算位点杂合性时，n 的值在不同位置会有所不同。</u>在对具有不同覆盖范围（因此有大量缺失数据）的数据集进行重新测序时，情况也是如此。当应用公式 3.3 时，通常只是忽略 n 个序列中任何具有间隙字符的比对位置。这种方法将对公式 3.2 和 3.3 产生的 π 计算产生影响，正如我们可以使用图 3.1 中所示的修改后的比对所证明的那样。

<u>在这种情况下，使用公式 3.2 可得出 π = 3.49（第一个分离位点的 h = 0.66 而不是 0.5），但使用公式 3.3 可得出 π = 2.83，因为我们已将位置 1、2、9 和 10 完全排除在所有成对比较之外。即使在有间隙的位置内没有分离位点（如图 3.1 中的第二个位点所示），不同的方法在按每个碱基对计算时也会得出不同的结果。这是因为第一次计算包括了所有 15 个位点，但第二次计算仅包括了 11 个位点。</u>尤其是对于基因组规模的数据集，应用可以轻松处理大量缺失数据的方法（例如基于公式 3.2 的方法）会更加有用（例如，Begun 等人，2007 年；Ferretti、Raineri 和 Ramos-Onsins，2012 年）。

我们还可以将 π 中的预期方差量表示为参数 θ 的函数。我们根据理论模型来表示方差，因为我们知道样本中的变异结构有很大的历史成分——即与采样染色体相关的谱系结构。尽管中性平衡模型下 π 的理论方差并不总是理想的（例如，在种群不符合我们的假设的情况下），但另一种方法是使用非常不准确的预期，这些预期不考虑底层谱系的层次结构，并且远低于大多数数据集中观察到的值。对于无重组的情况，此理想模型下π的预期方差为：

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如公式 3.4 所示，π 存在大量方差，即使有大量样本，方差也不会接近于零（Tajima 1983）。Pluzhnikov 和 Donnelly (1996) 给出了位点内重组水平增加时的预期方差。

π 的另一种总结核苷酸变异的方法是使用样本中分离位点的总数 S。但是，由于样本量越大，S 的值也越大，因此我们必须将统计量调整为（Ewens 1974；Watterson 1975）：

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其中 a 等于：

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统计量通常称为 Watterson 的 theta，因为它也是假设 Wright-Fisher 群体处于平衡状态和无限位点突变模型时参数 θ 的估计量。我们还可以重写上述方程，以将预期的分离位点数表示为 θ 的函数：E(S) = θa。给定图 1.1 中的序列比对，θW = 6/(1/1 + 1/2 + 1/3) = 3.28。我们可以看到，这个值与 π 给出的值非常相似。再次，θW 的确切值可能会在有间隙的比对中出现差异，这取决于我们是否包括或排除有间隙的位置。如果我们包括有间隙的位置，我们需要为具有不同序列数的区域计算单独的 θW 值，因此对于具有四个序列的位置，θW = 5/(1/1 + 1/2 + 1/3) = 2.73，对于图 3.1 中具有三个序列的位置，θW = 1/(1/1 + 1/2) = 0.667。统计量的总值是这两个的总和，θW = 3.40，并且每个站点的测量必须相应地对具有不同样本数的位置数进行加权。

我们可以再次给出 S 的预期方差s θ，假设 Wright-Fisher 种群处于平衡状态，无限位点突变模型没有重组：

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当存在自由重组时，方差减少到公式 3.7 中的第一个项，因为不再存在任何进化方差（参见第 6 章）。Pluzhnikov 和 Donnelly (1996) 给出了中等水平重组的 S 方差。公式 3.7 还可用于查找预期方差，该方差由 Var (θW) = Var(S)/a2 给出，其中 a 的定义如公式 3.6 所示。

比较我们两个 θ 估计量的预期方差，我们发现 θW 的方差低于 π 的方差，并且随着样本量增大而趋近于零（尽管非常缓慢）。这似乎表明 θW 是两个估计量中“更好”的。然而，它对轻微有害等位基因的存在和测序错误也更为敏感，即使在平衡种群中也是如此（见下文）。因此，通常会同时使用这两个统计数据，以及对两者进行比较（即 Tajima's D 统计量；见第 8 章）。

=== 等位基因的频谱 ===
到目前为止，我们只考虑了使用单个汇总统计量（如 π 或 θW）来描述变异。但是，也有有用的图形方法来描述变异，而这些方法反过来又会引导我们更多地测量核苷酸多样性。考虑图 3.2A 中所示的比对。在这 10 条染色体中有 9 个分离位点，每个位点的频率在 1/n 和 (n − 1)/n 之间（请记住，如果一个等位基因存在于所有 n 条染色体上，则它不是多态性的）。如果我们不知道哪个等位基因是祖先的，哪个是衍生的，那么描述每个位点变异的一种简单方法是次要等位基因频率 (MAF)，即不太常见的等位基因的频率。因此，样本中的次要等位基因频率范围为 1/n 到 0.5。我们可以通过绘制等位基因频率谱来直观地总结样本中所有分离位点的 MAF，其中直方图中的每个箱体代表与给定次要等位基因频率比对中的位点数（或位点比例）（图 3.2B）。如果我们将 Si

<nowiki>*</nowiki> 定义为在 i 条染色体上发现等位基因的分离位点的数量，其中 * 指定此计数与祖先/派生关系无关，并允许 i 的值在 1 到 n/2 之间（奇数 n 向下舍入），则等位基因频谱只是 Si 各种值的图

1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920212223242526272829

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分离位点数

次要等位基因频率

图 3.2 (A) 对于每个分离位点，次要等位基因为蓝色，主要等位基因为黑色。对于此样本，n = 10、L = 29 和 S = 9。(b) (A) 中显示的比对的“折叠”等位基因频谱。等位基因频谱也称为位点频谱 (SFS)，当它仅显示次要等位基因频率时，它被称为折叠频谱。为了推断每个等位基因的祖先和衍生状态，通常使用一个或多个密切相关物种的序列。通常认为与这些物种匹配的等位基因代表祖先状态，尽管每个谱系中的平行突变都可能导致错误的推论；这就是为什么通常首选使用两个外群物种的原因——所有三个谱系中平行突变的机会应该非常小。如果外群物种序列与任一等位基因都不匹配，或者它们相互矛盾，则无法将状态指定为祖先和衍生状态。图 3.3A 显示与图 3.2A 相同的比对，但一个等位基因已被指定为衍生状态。我们现在可以使用衍生等位基因频率 (DAF) 描述每个位点的变异，它可以介于 1/n 和 (n − 1)/n 之间。再次，我们通过等位基因频谱总结所有分离位点的 DAF，这次是在展开状态下（图 3.3B）。如果我们是 i 条染色体上发现的具有衍生等位基因的分离位点的数量（i 现在从 1 到 n − 1），那么等位基因频率谱只是 Si 各种值的图。为了清楚起见，我只绘制了 Si，但通常也会将等位基因频率谱绘制为 Si /S，或每个频率下所有分离位点的比例（有关这一点的进一步讨论，请参阅第 6 章）。还应该清楚的是，一些 MAF < 0.05 的等位基因实际上可能具有 DAF > 0.95，因为如果不分配衍生值，就无法进行区分nd 祖先状态。这意味着忽略 MAF < 0.05 的位点（如果这些位点被认为是测序错误或有害突变，则可能会这样做）可能会导致进化上重要的变异的丢失。除了可以很好地总结变异之外，在后面的章节中，我们还将看到理论

1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920212223242526272829

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数量分离位点

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

衍生等位基因频率

图 3.3 与图 3.2 中的比对相同，但现在等位基因极化为

祖先和衍生。 (A) 对于每个分离位点，衍生等位基因为蓝色。 (b)

(A) 中显示的比对的“展开”等位基因频谱。

描述变异

关于等位基因频谱形状的预测可用于

推断一组序列的历史。

我们现在考虑几个总结序列多样性的统计数据，

这些统计数据使用有关衍生等位基因频率的信息，因为这些统计数据可以捕获有关我们数据的更多信息。 Fu 和 Li (1993a) 定义了一个统计量 ξ1

，基于样本中衍生的单例数，可以用本文使用的术语写成：

是仅在一条染色体上发现的具有衍生等位基因的分离位点数。该统计量有时称为 θe

（其中 e 指系谱的外部分支）。从图 3.3A 中的比对，我们可以计算出 ξ1

= 4 的值。我们无法从图 3.1 或 3.2A 计算出 ξ1

，因为我们没有识别衍生等位基因。但是，我们也可以根据样本中的所有单例（无论它们是祖先的还是衍生的）定义一个统计量，用本文使用的术语写成：

η = − (3.9)

<nowiki>*</nowiki> 如上所述（Fu 和 Li 1993a）。从图 3.2A 中的比对结果可知，η1 的值 = 3.6。(n – 1)/n 项可纠正以下事实：无论祖先/衍生关系如何，对样本中的所有单身人士进行计数，往往会略微多算中性平衡群体中预期的衍生单身人士数量。

使用祖先状态信息的第二个多样性汇总统计数据是 θH，它再次是 i 染色体携带衍生等位基因的分离位点的数量（Fay 和 Wu 2000）。（根据 Justin Fay 的说法，θH

中的 H 指的是该度量赋予高频衍生等位基因或衍生变体纯合性的权重。）从图 3.3A 中的比对中，θH

的值可以计算为 ([12 * 4] + [22 * 1] + [32 * 2] +

[42 * 1] + [82 * 1])/45 = 2.36。我们可以看到，由于

所有这些统计数据 — ξ1

— 都是在无限位点突变模型下处于平衡状态的 Wright-Fisher 群体中 θ 的估计值；具体而言，E(ξ1

) = θ。这些关系的出现是因为我们知道在标准中性假设下等位基因频率分布的预期形状（见公式 6.8 和图 6.5）。了解预期频谱和该频谱的汇总统计数据对于检测自然选择（第 8 章）和非平衡人口历史（第 9 章）特别有用。

顺便说一句，我们还可以根据派生的等位基因频率定义 θW

和 π，如下所示：

其中 a 定义如公式 3.6 所示，并且：

图 3.3A 中对齐的 θW

和 π 值分别为 3.18 和 2.98。有关 θ 估计量之间差异的进一步讨论，请参见第 8 章。有限位点模型下 SNP 的 θ 估计量和包含测序误差上述统计数据仅在几个限制性假设下才为种群突变参数 θ 的估计量。其中一个假设是，给定位点的突变仅发生过一次 — 即无限位点突变模型（第 1 章）。如果某个位点有多个突变，很容易看出这些统计数据为什么会向下偏差。例如，当多态性位点不是双等位基因时，统计量低估了多样性。在这种情况下，分离位点的总数小于单独突变的数量，因此 θW 低估了样本的杂合性。在多样性较低的种群中，这不会成为太大的问题：在人类样本中，三等位基因位点相对较少，而四等位基因位点几乎没有（Hodgkinson 和 Eyre-Walker 2010）。然而，在多样性较高的物种中，这可能是一个真正的问题（例如，Wang 等人，2010）。相反，在存在测序错误的情况下，这些估计值将向上偏差。这是因为错误会被误认为是真正的分离位点，因此许多这些位点将被纳入多样性统计的计算中。测序错误注定会成为基因组规模数据集中的一个大问题，这仅仅是因为大多数下一代测序技术更容易出错，而且许多位点在单个样本中的测序覆盖率较低，导致碱基调用不正确。

在这两种情况下——单个位置的多个真实突变或高测序错误——统计量 θW 会比 π 受到更大的影响（Tajima 1996；Achaz 2008；Johnson and Slatkin 2008）。在有限位点的情况下，π 的影响较小，因为位点上的第三（或第四）等位基因由于其频率较低，对成对差异的贡献较小。同样，我们预计测序错误只存在于一条或几条采样染色体上，因此这些错误对染色体间差异的平均数量影响很小。尽管如此，上述所有统计数据都会在一定程度上受到这些复杂因素的影响（Clark 和 Whittam 1992；Tajima 1996；Achaz 2008；Johnson 和 Slatkin 2008；Knudsen 和 Miyamoto 2009）。Tajima（1996）提供了多种方法来调整 θW 的计算，以通过使用 Jukes-Cantor 校正（第 7 章）并假设没有测序错误来解释有限位点突变模型。要调整 θW

需要计算样本中的最小突变数 S′，而不是分离位点数 S。如果我们的样本中某个位点有 j 个不同的等位基因，则该位点至少发生了 j − 1 个突变；将比对中所有位置的 j − 1 值相加可得出 S′。（请注意，如果所有位点

都是双等位基因，则 S′ = S。）使用每个位点的突变数（即除以序列长度 L），Tajima 表明，考虑到位点发生多个突变的可能性，sta 的新版本为：

( / ) W(finite)

− ′ (3.13)

其中 a 定义见公式 3.6，b 定义为：

     =

对于图 3.2A 或 3.3A 中所示的比对，S′ = S = 9 和 θW(finite)

在整个基因座上等于 0.125 * 29 = 3.62（与 θW 相比）

同样，使用 Jukes-Cantor 校正考虑位点发生多个突变的可能性的 π 的新版本为公式为：

1 4( / )/3 有限

π = − (3.15)

其中 π 根据公式 3.2 或 3.3 计算（Tajima 1996）。对于图 3.2A 或 3.3A 中所示的比对，π/L = 2.98/29 = 0.103。按照公式 3.15，π有限

= 0.119，整个基因座等于 3.45。

我们可以看到，校正了位点发生多个突变的可能性后，两个统计数据的值都略大于未校正版本，这与我们的直觉一致，即忽略有限位点的效果是低估核苷酸多样性。

使用任何测序技术都会发生测序错误，从传统的基于 Sanger 的方法到现代的下一代方法。如第 2 章所述，研究人员可以采取一些措施来最大限度地减少错误，包括在进行 Sanger 测序时对多个克隆进行测序，以及在使用下一代技术时使用严格的过滤器（包括最小读取深度和最低质量得分）。但是，增加最低可接受质量得分或读取深度也会导致偏差：随着越来越多的真实多态性被消除，估计的杂合性水平将不可避免地下降（Lynch 2008）。相反，大多数对 θ 估计量误差的修正都利用了这样一个事实，即错误很可能只会在单个染色体上发现，因此会在样本中显示为衍生的单例（Achaz 2008；Johnson 和 Slatkin 2008；Knudsen 和 Miyamoto 2009）。其他方法基于对单个杂交个体的深度测序，并且在具有两个以上等位基因的位点处识别出错误（Lynch 2008）。由于我们不知道较大样本中哪些单例是错误，因此我们必须忽略所有单例，在去除预期单例数量后调整使用预期分离位点数量（θW）和成对差异（π）的统计数据（仅基于样本中单例数量的统计数据显然无法以这种方式进行校正）。已经提出了多种方法来执行这种或类似的校正（例如，Achaz 2008；Johnson 和 Slatkin 2008；Knudsen 和 Miyamoto 2009），但在这里我仅介绍 Achaz（2008）中给出的误差校正估计量。让我们将 Smulti 定义为非单例（多例）分离位点的数量，即不包括衍生单例的分离位点的数量：Smulti。现在我们可以引入一个基于 Smulti 的新统计数据，以充分纠正测序错误：θ = − (3.16)，其中 a 如公式 3.6 中定义。使用 t图 3.3A 中显示的比对，

= 2.73（相比于同一数据集的 θW

= 3.18）。

类似地，如果我们将 πmulti

定义为仅针对那些没有派生单例的多态性位点的位点杂合度之和（公式 3.2），那么我们可以给出另一个考虑误差的新统计数据：

使用图 3.3A 中显示的比对，θπ(multi)

= 2.72（相比于同一数据集的

π = 2.98）。Achaz (2008) 还展示了如果不知道派生状态和祖先状态，如何校正 θW

π 的错误。

θW(multi) 和 θπ(multi) 都将准确估计无限位点突变模型下 Wright-Fisher 群体平衡状态下的参数 θ，假设所有错误都以单例形式存在于样本中。由于测序技术存在一致的偏差，多条染色体上存在的错误不会被这种方法所解释。

无论标准中性模型的假设是否正确，θW(multi) 和 θπ(multi) 都表示总结核苷酸多样性的统计数据，而不计算衍生的单例，因此在错误率高时可能是首选。请注意，虽然我们对有限位点和测序错误的修正都是标准 θW 和 π 的特殊情况，但它们对突变过程的假设非常不同。有限位点的校正明确允许一个位置有三个等位基因，但没有错误，而校正测序错误的框架假设存在无限个位点，因此没有多个命中不是错误的位置。最后，虽然我们之前看到θW的理论方差低于π，但这个预期假设没有测序错误。在存在测序错误的情况下，π成为一个“更好”的多样性度量，因为它受这些错误的影响较小（Achaz 2008；Johnson and Slatkin 2008）。当然，这两个统计数据都比仅使用单例（ξ1）的估计器更稳健，因为这些估计值预计受测序错误的影响最大。解释核苷酸变异的测量值

在中性模型下（分离位点的所有等位基因都是选择性等价的，并且选择对与中性变异相关的位点没有影响），基因座的变异水平仅受突变输入与遗传漂变导致的等位基因丢失之间的平衡控制。如果这些假设成立，并且种群处于平衡状态（甚至在不平衡时也经常如此），则每个位点序列之间核苷酸差异的预期平均数π为（Li 1977；Tajima 1983）：

在这种情况下，基因座的多态性水平应与有效种群大小（决定遗传漂变的影响）和中性突变率成线性比例。

然而，多样性与表观种群大小的相关性很弱。这种早期的观察结果被称为变异悖论（Lewontin 1974），即使在收集了更多数据集之后，这种悖论仍然存在（Leffler 等人 2012；Corbett-Detig、Hartl 和 Sackton 2015）。对生命之树上数百个物种的核苷酸变异的测量继续表明，尽管种群大小相差许多数量级（从普遍存在的细菌到极其稀有的脊椎动物），但细菌和脊椎动物之间核苷酸多样性的平均差异不到两个数量级（图 3.4）。在真核生物中，线粒体 DNA 的变异水平与种群大小没有相关性（Bazin、Glemin 和 Galtier 2006），核基因与我们假设的不同生物的普查种群大小之间只有微弱的关系（图 3.4）。除了假定的种群规模和变异水平之间缺乏线性关系外，重组率和变异水平之间存在意外的正相关性（Hahn 2008；Cutter 和 Payseur 2013 进行了综述）。在中性模型下，这种相关性是意料之外的，但在包含连锁选择效应的模型下，这种相关性是意料之中的（见第 1 章和第 8 章）。两个最完整的连锁选择模型预测多样性和种群规模之间存在弱正相关关系（背景选择；Charlesworth、Morgan 和 Charlesworth 1993）或无关系（搭便车；Maynard Smith 和 Haigh 1974），并且都预测重组率和变异水平之间存在正相关关系。背景选择模型提出，必须从种群中去除的有害突变的不断涌入会降低链接位点的多态性。搭便车模型认为，有利等位基因的快速固定会降低链接位点的多态性。虽然区分这两种模型并不简单（Stephan 2010；Coop 和 Ralph 2012），但我们可以写下两种模型下每个位点序列之间预期的平均核苷酸差异数。

在背景选择模型下，π 的期望值为：

其中 f 是种群中不携带有害突变的同源染色体的比例（Charlesworth、Morgan 和 Charlesworth 1993）。无突变染色体的比例取决于有效种群大小和重组率，以相对复杂的方式取决于对显性、重组和突变的假设（Charlesworth、Morgan 和 Charlesworth 1993）。但很容易看出，随着重组率的降低，具有中性多态性的位点将越来越多地与邻近的有害等位基因相连，导致 f 降低，π 随之降低。在具有重组的搭便车模型下，每个位点序列之间预期的平均核苷酸差异数的一个表达式是：其中 ρ = 4Ne c（群体重组参数；参见第 4 章），α 是一个复杂参数，取决于有利等位基因出现的速率、群体尺度的选择强度（Ne s）以及所选等位基因与正在分析的中性多态性的距离（Wiehe 和 Stephan 1993）。可以看出，重组水平的提高导致多样性水平非常接近没有选择的预期。增加搭便车效应（即增加 α）会降低多样性水平。不同搭便车模型的细节对 π 的期望略有不同，但重组水平和多样性之间几乎总是存在正相关关系。这些考虑意味着，虽然根据定义 θ = 4Ne

μ，但统计数据 π、θW

不一定等于 4Ne，尽管它们是无限站点模型下 Wright-Fisher 群体中 θ 的无偏估计量。在存在连锁选择的情况下——即使在正常重组区域也会产生重大影响（例如，Loewe 和 Charlesworth 2007），用于测量多态性水平的统计数据将至少告诉我们有关自然选择对连锁变异（遗传草案；Gillespie 2000）的随机影响，就像它们将告诉我们有关漂移和突变的影响一样多。这也意味着，通过将 π 除以 4μ 计算的有效种群大小 (Ne) 的值可能无法表示可解释的生物学值（当然也不是“个体”的数量；第 1 章），因为它仅代表中性模型下的有效种群大小。该数量的合并有效种群大小定义可能仍然代表合并的时间尺度，但 Ne 值的重新缩放将无法捕捉连锁选择模型的所有方面（Neher 2013）。相反，π 与表观普查种群规模有相关性（尽管相关性很弱）（图 3.4）这一观察结果表明，直接使用这种或其他核苷酸变异总结可能与使用不适当的 Ne 估计值一样有效。此外，普查种群规模在确定适应率方面可能比任何有效种群规模都更重要，因为普查种群规模在确定适应性突变的输入率方面发挥着重要作用（例如，Karasov、Messer 和 Petrov 2010）。选择性环境变化的速度也可能比任何种群规模概念在适应性进化中发挥更大的作用（Gillespie 2001；Lourenço、Glémin 和 Galtier 2013）。多样性的其他测量方法

微卫星变异

单个微卫星位点的变异可以采用与单个核苷酸位点变异大致相同的方式进行测量，尽管通常存在远多于两个等位基因（通常 >10 个等位基因）。这些等位基因在重复长度方面也会有很大差异，单个等位基因的重复单元数从 1 到 >30，具体取决于微卫星的结构。变异不必围绕平均重复长度呈正态分布，事实上，变异通常是双峰或甚至三峰的（参见图 3.5 中的示例）。

有多种方法可以总结微卫星位点的多样性，包括基于简单汇总统计数据的方法（见下文）和基于最大似然的方法（例如，Nielsen 1997；Wilson 和 Balding 1998；RoyChoudhury 和 Stephens 2007）。与总结核苷酸变异一样，最常用的统计数据也是 Wright-Fisher 平衡种群中种群突变参数 θ 的估计值m。

在这种情况下，突变率 μ 测量微卫星位点上新中性等位基因的突变率，我们必须假设一个适合微卫星的突变模型。最常用的模型是逐步突变模型 (SMM)，它只允许每个突变发生单个重复单元变化（第 1 章）。

总结微卫星位点变异的一种直接方法是报告样本中不同等位基因的数量 K（有时表示为）。虽然该统计数据可用作 θ 的估计量（例如，Haasl 和

等位基因大小

等位基因大小

图 3.5 人类微卫星位点等位基因变异示例。两个位点

都只有二核苷酸重复，相邻的条表示相差一个重复单位的等位基因频率。（来自 Valdes、slatkin 和 Freimer 1993。）

Payseur 2010），但实际上它通常是单独报告的，甚至没有对采样的染色体数量进行校正。

有两种常见的微卫星变异统计摘要

确实提供了在逐步突变模型下和 Wright-Fisher 平衡种群中 θ 的估计值。第一个公式使用样本的预期纯合性 F，其计算方法如下：

是基因座上第 i 个等位基因的频率（在 K 个总等位基因中）。

令人困惑的是，与公式 3.1 中所示的核苷酸杂合性计算不同，常用的纯合性计算不使用

Bessel 的偏差校正（n/[n − 1] 项）。但是，由于杂合子和纯合子的比例之和必须等于 1，我们还必须将未校正的杂合度 H 定义为 1 − F。根据这种计算样本纯合度的方法，我们可以将微卫星位点的参数 θ 的估计量定义为 (Ohta and Kimura 1973)：

尽管 θF 是 θ 的一个略有偏差的估计量，但可以通过基于模拟的改进来减少这种偏差 (Xu and Fu 2004)。

在逐步突变模型下，微卫星位点的 θ 的第二个估计量使用在单个位点 V 观察到的等位基因重复次数的方差。由于微卫星突变通常会产生与原始状态相距一个或几个重复单元的新等位基因，因此重复次数的方差可以很好地指示位点上保持的变异量。如果我们假设只可能发生单步突变，并且突变增加或减少重复单元的概率相等，则 E(V) = θ（Moran 1975；Goldstein 等人 1995；Slatkin 1995）。因此，θ 的直接估计量由以下公式给出：

虽然这个估计量是无偏的，但它的方差很大（Zhivotovsky 和 Feldman 1995）。这里提供的所有汇总统计数据只是逐步突变模型和标准中性模型的所有其他假设下参数 θ 的估计量。但是，可以在广义逐步模型下推导出 θ 的估计量，该模型具有关于添加或减去的平均重复单元数以及重复增加或丢失的任何不对称性的任意属性（Kimmel 和 Chakraborty 1996）。虽然这些估计量确实需要指定要使用的特定突变模型——并且这种模型中的许多参数对于任何特定基因座都是未知的——但似乎即使是一些假设 SMM 的估计量也可能对模型错误指定具有相对稳健性（Xu 和 Fu 2004；Haasl 和 Payseur 2010）。单倍型变异

如果核苷酸序列数据是分阶段的（无论是通过实验还是计算），那么图 3.1 中的 4 个序列代表 4 种单倍型，而图 3.2A 中的 10 个序列代表 10 种单倍型。图 3.1 中还有 4 种独特的单倍型，所有序列都代表不同的核苷酸组合（这些有时也称为等位基因；参见第 1 章）。图 3.2A 有 8 种独特的单倍型。如果没有重组，新的单倍型只能通过突变产生，独特单倍型的数量 K（有时也表示为 ne）最多为 S + 1。如果重组率高，则可以通过重组和突变产生新的单倍型，因此最多可以有 2S 种不同的单倍型。假设 Wright-Fisher 种群处于平衡状态，且无限等位基因突变模型没有重组（第 1 章），则基因座处独特单倍型的预期数量 K 与种群突变参数 θ 之间存在关系：

= + + + + + + + −

其中 n 再次是采样染色体的数量（Ewens 1972）。通常需要使用数值优化来求解此处的 θ，我将把这个 θ 估计量称为 θK

。请记住，在这种情况下，突变率 μ 测量基因座处突变为新的中性等位基因（即独特单倍型）的速率。总结单倍型变异的其他方法使用 Equa 的类似物tion 3.21 来计算单倍型纯合性：唯一的变化是

表示 K 个独特单倍型中第 i 个独特单倍型的频率。同样，这个值通常被称为 F，其中 H = 1 − F 用于计算单倍型杂合性（也称为单倍型多样性；Depaulis

和 Veuille 1998）。单倍型杂合性和独特单倍型的数量显然极大地依赖于单个核苷酸的包含，因为每个单个核苷酸都会创建一个新的单倍型。因此，通常可以看到这两个统计数据在计算时都不包括这些突变。

虽然在处理（大部分）非重组序列（如线粒体 DNA 或 Y 染色体）时将单倍型视为变异单位很有用，但许多重组核基因座的研究都集中在核苷酸位点变异上。值得注意的是，上述总结核苷酸多样性的统计数据并不依赖于单倍型的准确定相：即使单倍型是从同一组分离位点随机构建的，π、θW 和所有其他基于核苷酸的统计数据的值也不会改变。话虽如此，单倍型在检测自然选择方面有许多具体用途，稍后将讨论（见第 8 章）。重组 4

在上一章中，我们考虑了多种描述 DNA 序列样本多样性的方法，从分离位点数量的总结，到微卫星位点等位基因的数量，再到独特单倍型的数量。这些统计数据（包括基于分阶段单倍型的统计数据）都旨在总结突变在产生多样性方面的影响。在本章中，我将介绍多种总结重组在产生分子多样性方面的影响的方法，包括位点对之间和重组区域内。虽然我们检测重组的能力需要存在核苷酸变异，但重组在单倍型之间重新分配这些变体方面的影响与突变的影响截然不同。我首先描述检查重组对双基因座基因型的影响的方法，然后介绍重组的区域和全基因组摘要。

测量连锁不平衡

连锁和连锁不平衡

从一个个体收集两个单倍型意味着我们正在观察结合形成个体的两个亲本配子。也就是说，我们有在初始受精卵中结合在一起的母系和父系衍生的染色体。当然，这些序列本身不一定是母系或父系基因组中存在的单倍型，而是可能代表一种新的重组单倍型，它是亲本基因组中存在的两个单倍型的组合，并作为配子传递。连锁是指配子中位点的共同遗传，因为它们在染色体上物理相连。

图 4.1 给出了一个在两个基因座 (A1

) 上杂合且具有两个单倍型 A1 的个体的例子。

该个体产生的四种可能配子是 A1

。如果两个基因座紧密相连，那么几乎所有的配子都将是 A1

。如果两个基因座完全不相连，那么所有四个配子预计在减数分裂期间以相同的频率产生。我们将两个基因座之间的重组频率 c 定义为产生的 A1

配子的分数。

图 4.1 连锁。左边的例子显示两个紧密连锁的基因座，因此只产生两个亲本配子（c = 0），而右边的例子显示两个不连锁的基因座，所有四个配子以相等的频率产生（c = 0.5）。

因此，c = 0.5 意味着两个基因座不连锁，而 c < 0.5 意味着它们是连锁的。

正如连锁被定义为等位基因通过减数分裂的关联一样，连锁不平衡 (LD) 被定义为种群中等位基因的非随机关联。这个术语有点误导，因为连锁基因座不一定处于连锁不平衡中，甚至不连锁的基因座也可能处于连锁不平衡中。但物理连锁是 LD 的主要原因——事实上，许多紧密连锁的位点都处于 LD 中——这导致许多人将这两个术语混为一谈（关联不平衡可能是这种现象的更好选择）。如果两个基因座在群体中随机相互关联，那么第一个基因座上的 A1 并不能告诉我们第二个基因座是否会是 B1。但如果它们是非随机关联的（即连锁不平衡），那么具有 A1 的个体也可能更有可能具有 B1。如果我们将 pi 定义为第一个基因座上等位基因 Ai 的频率，将 qj 定义为第二个基因座上等位基因 Bj 的频率，并且如果等位基因之间存在随机关联，我们可以发现只需将两个基因座上的单个等位基因频率相乘即可得到预期的单倍型频率 gij。这些基因座被称为处于连锁平衡状态。但是，如果等位基因之间存在关联，那么这些预期值就会偏离一定量 D，我们将其定义为连锁不平衡系数（Robbins 1918；Lewontin 和 Kojima 1960）。如果我们考虑由两个各有两个等位基因的基因座产生的四种单倍型组合，我们可以更清楚地看到这一点。单倍型出现的频率为：当没有连锁不平衡（D = 0）时，单倍型频率恰好等于组成等位基因频率的乘积。但是

在存在 LD 的情况下，所有单倍型频率都会偏离量 D。

请注意，我们选择将 D 添加到 A1

单倍型并从 A1

中减去它是任意的：D 本身可以是正的也可以是负的，并且在这种情况下对于每个单倍型都必须相同，这样我们对连锁不平衡程度的推断就不会受到这种选择的影响。但是，在“耦合”阶段（即 A1

）将 D 添加到单倍型并从“排斥”阶段（即 A1

）的单倍型中减去 D 是标准做法。虽然在种群样本中耦合和排斥类型的分配也是任意的，但 Langley、Tobari、RECombinATion 和 Kojima (1974) 建议将包含两个较常见等位基因和两个较不常见等位基因的单倍型视为耦合，并且这种命名法已成为相对标准。其他命名系统，例如将祖先-祖先和衍生-衍生突变对分配为耦合阶段，也可能有用（例如，Langley 和 Crow 1974；Machado 等人 2002；Takahasi 和 Innan 2008）。

成对连锁不平衡的测量

根据上述定义，很容易看出，不平衡系数 D 可以按以下方式计算：

适用于任何等位基因组合。由于与观察到的单倍型频率的偏差只能与边际等位基因频率的乘积一样大，因此 D 的范围和值取决于 pi 。例如，= 0.5 和 q1 = 0.5，D 可以在 -0.25 和 +0.25 之间变化，而当 = 0.1 和 q1 = 0.7 时，D 介于 -0.07 和 +0.03 之间。这意味着位点对之间 D 值之间的差异既可以反映等位基因之间关联强度的差异，也可以反映等位基因频率的差异。为了能够比较位点对之间的连锁不平衡水平，Lewontin (1964) 建议使用以下标准化测量方法：

, ) , 表示 0

, ) , 表示 0

其中 max(x,y) 表示 x 和 y 中较大的一个，min(x,y) 表示较小的一个。

D′ 的值现在限制在 −1 和 +1 之间，尽管通常只报告绝对值。请注意，虽然 D′ 的范围不再取决于等位基因频率，但该统计数据的值（事实上所有连锁不平衡测量值）仍然取决于等位基因频率（Lewontin 1988）。

第二种常用的连锁不平衡测量方法是基于两个基因座等位基因的平方相关性，由 Hill 和 Robertson (1968) 首次提出：

这里使用统计量 r2 代替等位基因状态的相关性 r (=D/√[p1

])，以消除与计算 D 相关的符号。

因此，r2 统计量受 0 和 1 的限制。除了 r2 的值对边际等位基因频率的依赖性比 D′ 略低之外，

它还是一种有用的统计量，因为它与种群重组参数 r 相关（见下文）。

连锁不平衡的两个测量方法 D′ 和 r2 也提供了有关等位基因之间关联的非常不同的信息。简而言之，虽然 D′ 告诉我们两个基因座之间的重组，但 r2 告诉我们我们的能力，即根据另一个基因座的等位基因状态，预测一个基因座等位基因的身份。要了解这一点，请考虑图 4.2 中给出的示例。在此样本 (A1) 中仅观察到三种独特的单倍型，因此 D′ 将等于 1（有时称为完全 LD）。事实上，除非观察到所有四种单倍型组合，否则 D′ 始终为 1，而这只有在两个基因座之间发生重组时才有可能（复发突变的情况除外，在这种情况下，所有四种单倍型都可以存在而无需重组）。这些限制是四配子重组测试的基础（Hudson 和 Kaplan 1985；另见下文）。相比之下，从图 4.2 中的样本计算出的 r2 值为 0.111。该值如此之低是因为在了解 A 基因座的等位基因的情况下，几乎没有能力预测 B 基因座的等位基因，即使h 没有发生重组。除非一个种群中只有两种单倍型，并且它们各自在两个基因座上都含有替代等位基因（通常称为完美 LD），否则 r2 将始终小于 1。r2 的这一特性使其在表型性状的关联（连锁不平衡）映射中非常有用，其中的问题更多地围绕着预测不同表型状态背后的基因型，而不是重组的存在。

无论使用哪种统计数据，计算任何观察到的连锁不平衡的重要性都很简单。

一种方法是将四种可能的单倍型的计数排列在 2×2 列联表中，如图 4.3 所示。然后可以将任何独立性检验（例如 Fisher 精确检验）应用于这些计数，以询问 D 是否与 0 有显著差异（在所示示例中 P = 1.0）。第二种方法源于 nr2 服从 c2 分布，自由度为 1（其中 n 表示采样的分阶段单倍型的数量）。在这种情况下，c2 统计量为 10 * 0.111 = 1.11，这也不显著。由于当次要等位基因频率较低时（样本量不是很大），很难获得显著的 r2 值，因此通常会忽略涉及次要等位基因频率 <0.05 的多态性的计算。在处理基因组规模的数据集时，必须考虑计算连锁不平衡的几个细微差别（有关单倍型的实验和计算定相问题的讨论，请参见第 2 章）。一个常见的问题是缺失数据：具有准确基因型信息的位点之间的染色体数量可能经常存在差异。由于无法在个体中定义一对位点的单倍型，而其中一个位点的状态未知，因此每对位点的样本量可能不同。在存在缺失数据的情况下正确计算 D′ 或 r2 要求将具有至少一个未定义位点的任何个体从两个位点的单倍型计数和等位基因频率计数中移除，并相应调整样本量和等位基因频率。此要求显然仅适用于涉及缺失数据的位点的 RECombinATion 成对比较；相同的采样染色体可用于其他比较，这些比较在两个位点都定义了基因型。无论是通过测序还是基因分型平台获得，都会出现缺失数据，并且可以从任一数据源计算连锁不平衡。然而，基因分型方法（如 SNP 芯片）固有的确定偏差意味着连锁不平衡的总体水平也可能存在偏差（Akey 等人，2003 年）。需要明确的是：连锁不平衡的个别测量不会因任何一对位点而产生偏差，但许多对之间的平均不平衡水平将相对于理想群体的期望而产生偏差（有关这些期望，请参见下文）。可能并不令人意外的是，由于它们使用的数据方面不同，确定偏差对 D′ 和 r2 的影响也大不相同（Nielsen 和 Signorovitch 2003）。确定偏差导致中频多态性的过度表达，这意味着 D′ 倾向于向下偏差，而 r2 倾向于向上偏差，尽管如果知道原始确定方案，这两种偏差都可以纠正（Nielsen 和 Signorovitch 2003）。

总结成对连锁不平衡

计算许多分离位点对的连锁不平衡系数——无论是在一个区域内还是来自整个基因组——都会提供大量数据。那么问题就变成了：我们如何理解所有这些数据？有许多方法可以总结成对 LD，其主要区别在于目的是提供局部还是全局的连锁不平衡视图。局部视图试图总结单个区域内的 LD 模式，而全局视图可能总结多个区域甚至整个基因组的 LD。

有两种简单的方法可以总结区域内的成对连锁不平衡，一种是图形方法，另一种是简单地使用所有成对测量值的平均值。Kelly (1997) 将 n 个序列样本中 S 个分离位点的平均 r2 值定义为：

（之所以选择 Z，是因为它是 John Kelly 最喜欢的字母。）与 r2 一样，

的值在 0 和 1 之间变化，表示某个基因座的平均成对 LD。

如果没有重组，平衡状态下的 ZnS

平均值预计约为 0.15（Kelly 1997）。位点内重组会导致 ZnS 的值降低，而某些形式的选择可以提高 ZnS 的值。Rozas 等人 (2001) 提出了一种 ZnS 的修改方法，可用于检测是否发生了重组通过测量相距越来越远的位点对之间的 LD 下降来比较 ZnS。然而，ZnS 最常用于检测自然选择（见第 8 章）。图 4.4 显示了果蝇 su(wa) 基因座（Langley 等人，2000 年）中某个区域的成对连锁不平衡的图形摘要。显著的成对比较用彩色框表示，与 0 显著不同的 D 的成对比较用彩色框表示（P < 0.01；Fisher 精确检验）。仅比较在 51 条采样染色体中至少 2 条上发生的多态性。虚线将分离位点的位置与其在矩阵中的对应列连接起来。（来自 Langley 等人，2000 年。）低 P 值表示存在连锁不平衡的证据（相当于图 4.3 中所示的检验）。我们可以在这个例子中看到，许多（但不是全部）相邻的多态性彼此之间有显著关联，而且相距近 2,000 个碱基的多态性之间也存在一些显著关联。否则，该区域的连锁不平衡模式没有太多结构，LD 不会延伸很远，这对于果蝇来说是典型的。相比之下，图 4.5 提供了人类 500 kb 区域中成对 LD 的图形摘要（国际 HapMap 联盟，2005 年）。在此表示中，只有 D′ = 1 的多态性对用彩色框表示；更多的对具有

D′ > 0。该图中区域 LD 的一个显著特征是由于人类重组的点状性质：由于重组主要发生在染色体上有限数量的位置（Jeffreys、Kauppi 和 Neumann 2001；McVean 等人 2004），因此存在大块非常高的 LD，它们几乎可以独立于相邻块。这些所谓的

单倍型块可以包括数百种彼此完全连锁不平衡的多态性，重组“热点”将各个块分开。尽管用于定义单倍型区块的标准可能因研究而异，但此类区块是迄今为止研究的哺乳动物种群的共同特征（例如，Guryev 等人，2006 年；Villa-Angulo 等人，2009 年）。

区域 LD 的简单表示，例如图 4.4 和

RECombinATion

图 4.5 东亚智人 2q37.1 区域中的成对连锁不平衡。D ′ = 1 的成对比较用彩色框表示。

（来自国际 Hapmap Consortium 2005。）

4.5 可以是一种相对直接的方式来可视化基因座和物种之间 LD 和重组模式的差异。

为了更全面地了解整个基因组的连锁不平衡，显然我们不能使用图 4.4 和 4.5 中所示的图表类型——我们需要为每条染色体绘制单独的图表，并且每个三角矩阵都必须非常大才能包含整个染色体。当然，我们可以给出一个统计量，即所有位点对的平均 LD，但这种总结并没有提供大量有关 LD 在基因组中结构方式的信息。一个常见的基因组（或较小区域）LD 总结是 LD 低于某个阈值的距离，旨在揭示 LD 的规模。通常，这个阈值是 r2 的任意值（例如，r2 < 0.2）或平均 r2 低于初始值 50% 的距离（即相邻碱基多态性之间的值）。

图 4.6 显示的正是这种连锁不平衡衰减的显示。在豆科植物模型苜蓿（Medicago trunculata）的基因组中，绘制了相距小于 20 kb 的多态性之间约 350,000 次比较的 r2 值（Branca 等人，2011 年）。26 个苜蓿近交系（n = 26）的整个基因组已经测序，并且显示了所有相距小于 20 kb 的 SNP 之间的 r2 值分布（涵盖所有 8 条组装染色体）。（LD 可以在插入/缺失之间计算，

或者实际上在任何变体之间计算，但在本例中没有这样做。）我们可以看到

r2 值有很大的差异，许多对在非常短的距离处具有 r2 = 0，而在距离高达 7 kb 时具有 r2 = 1。该图显示 M. trunculata 中的 LD 规模约为 5 kb；也就是说，对于相距约 5 kb 的 SNP，平均 LD 低于

r2 = 0.2，并且下降到

其初始值的一半以下

2 到 3 kb。这个数字当然是在许多不同的

区域内平均的，每个区域可能都有自己的重组率。因此，观察到的 LD 的衰减可能在每个区域内都不同，总结

SNP 之间的距离（以 kb 为单位）

图 4.6 连锁不平衡的衰减um 横跨 M. trunculata 基因组。

粗红线表示相距 20 kb 以内的所有多态性对之间的 r2 平均值（未显示单个点）。 50% 范围的值以深蓝色显示，90% 范围的值以浅蓝色显示。（来自

branca 等人，2011 年。）

图 4.6 中显示的表示全基因组平均重组率的成对 LD 下降；下面的公式 4.11 和 4.12 提供了在给定平均重组率和基因座之间的种群大小的情况下对这种衰减的理论预期。虽然该图没有显示相距超过 20 kb 的多态性之间的 r2 值，但我们预计平均 r2 最终会下降到未连锁基因座的 1/n。

扩展到多个等位基因、多个基因座和基因型

到目前为止讨论的连锁不平衡测量仅考虑了两个基因座（每个基因座有两个等位基因）之间的比较，或这种成对测量的总结。我们还假设我们知道染色体上等位基因的相位，因此也只考虑了同一染色体上基因座之间的不平衡。在这里，我简要讨论了依次放宽这些限制的 LD 测量；更多详细信息可在 Weir (1996) 中找到。

当一个或两个基因座上有多个等位基因时，必须为每对等位基因计算单独的不平衡系数：

与两个等位基因的情况不同，为两个以上等位基因计算的系数在所有对之间并不相等。但是，与双等位基因的情况一样，所有 Dij 值的总和必须为 0，并且任何特定 i 或 j 的所有 Dij 值的总和也必须等于 0（例如，如果第二个基因座有三个等位基因，则 RECombinATion

除了成对连锁不平衡之外，我们还可以考虑两个以上基因座之间的不平衡。所有 LD 的高阶测量都可以从三基因座的情况中轻松得出，因此我在这里仅讨论三基因座不平衡。给定三个基因座 A、B 和 C，其等位基因频率为 pi

我们想知道在所有三个基因座的等位基因组之间是否存在非随机关联，而这种关联不能由等位基因对之间的非随机关联来解释。为了回答这个问题，我们在计算中包括了成对不平衡系数：

对于三个以上基因座之间的不平衡也进行了类似的计算，

始终考虑所有低阶不平衡。重要的是要认识到，这些测量值不是总结区域 LD，而是测试两个以上基因座之间的高阶相互作用。

到目前为止讨论的所有计算连锁不平衡的方法都假设所有个体都有已知相位：染色体上等位基因的排列是已知的。因此，通常将先前的统计数据称为配子连锁不平衡的度量。但如果相位未知——要么是因为两个位点在一条染色体上相距很远，要么是因为它们位于不同的染色体上——我们仍然可以询问两个基因座的基因型之间是否存在非随机关联（例如，图 4.7），这种状态称为基因型连锁不平衡。假设两个基因座各有两个等位基因，则每个基因座有三种不同的可能基因型 ) 和九种不同的基因型组合 (图 4.8)。如果我们将 A1 个体的频率表示为，将 A1 个体的频率表示为 g1112 ，将 A1 个体的频率表示为 g1211 ，将 A1 个体的频率表示为 g1212 ，则基因型不平衡系数可计算为 (Weir 1979)： + 0.5g1212 对于图 4.7 中所示的九种二倍体基因型样本，∆ = 0.136。假设种群处于 Hardy-Weinberg 平衡状态，图 4.7 来自种群的九种二倍体基因型样本。 A 和 B 基因座之间的连锁关系（以及配子阶段）未知。

图 4.8 基于图 4.7 中显示的个体，样本中双基因座基因型的计数。

重要性可以再次使用 3 × 3 基因型表上的独立性检验来评估（图 4.8）。

如果已知单倍型之间存在随机交配，则这种基因型不平衡估计值也等同于配子不平衡系数 D。假设 18 种单倍体基因型中的每一种（例如，图 4.7 中的 A1 代表一个分阶段的单倍型，则此样本的 D = 0.123，与我们的基因型不平衡系数相似。

估计重组

查找样本中重组事件的最小数量

到目前为止讨论的统计数据主要局限于分离位点之间的成对比较，因此只能告诉您特定位点对之间重组的影响。但是，我们希望能够对重组在单个区域和整个基因组中的影响做出更普遍的推断。在此下一节我将介绍总结重组效应的多种方法。这里我们首先介绍用于估计单个区域序列样本中必须发生的最少重组事件数的方法。正如前面解释 D′ 和 r2 之间的差异时提到的，可以使用四配子检验 (Hudson and Kaplan 1985) 推断出群体遗传数据集中重组的确凿证据。该检验的本质是，在两个基因座中，每个基因座都有两个等位基因，在无限位点假设下，产生所有四个可能配子的唯一方法是在两个基因座之间的某个地方发生重组事件。无限位点假设很重要，因为等位基因的复发突变可以在不发生重组的情况下产生所有四个配子。例如，图 4.2 显示了一组仅存在三种单倍型的序列样本：A1

但是，如果 B1

突变复发，并且发生在背景中，则所有四个配子都将存在于种群中，并且

可能存在于染色体样本中。

当然，仅仅观察所有四个配子并不能告诉我们样本历史上发生了多少次

重组事件，只能告诉我们

至少发生了一次事件（模复发突变）。

估计样本中的重组事件数 R 实际上非常困难：与样本中的分离位点数 S 不同，R

不能直接观察到。许多重组事件可能发生在一组序列的历史中，但无法观察到，要么是因为它们没有发生在祖先中处于杂合状态的两个位点之间，要么是因为它们产生了样本中已经存在的重组单倍型。然而，我们可以估计样本中必须发生的重组事件的最小数量，这个数字通常比 R 小得多，因为大多数重组事件 RECombinATion 都无法检测到（Hudson 和 Kaplan 1985；Stephens 1986；Posada 和 Crandall 2001）。有两个常用统计数据用于限制样本中重组事件的最小数量：Rm（Hudson 和 Kaplan 1985）（Myers 和 Griffiths 2003）。 Rm

根据四配子检验确定区域中必须发生重组的最大非重叠间隔数。Rh

基于以下观察：在具有 K 个独特单倍型和 S 多态性的任何区域中，重组事件的数量必须满足 R ≥ K − S − 1。因此，可以通过 K − S − 1 来估计最小重组事件数。对于较长的序列，这种关系会失效，特别是当分离位点的数量大于不同单倍型的数量时（这当然受采样染色体数量 n 的限制）。但是，通过将来自每个具有 K ≥ S + 1 的多个位点子集的最小重组估计值组合在一起，Rh

可以为整个区域内重组事件的全局最小数量提供一个界限。用于查找 Rm 的算法还提供了推断的重组事件的位置。一般来说，Rh 的估计值比 Rm 更准确，因此（Myers 和 Griffiths 2003）。要了解为什么会出现这种情况，请考虑图 4.9 中给出的示例。在此示例中，我们有四个位点（1-4）和八个采样染色体（a-h），每个染色体都有一个独特的单倍型（K = 8）。计算 Rm 的算法如下（图 4.9 中的示例有明确结果）：

1. 对于所有位点 i 和 j 对，确定所有四个配子是否

• 图 4.9：（1,2）、（1,3）、（1,4）、（2,4）和（3,4）

2. 删除完全包含其他区间的区间，包括具有相同起点或终点的区间。

• 图 4.9：删除（1,3）、（1,4）和（2,4）

图 4.9

3. 如果任何剩余区间重叠，则转到步骤 4；如果不是，则转到步骤 5。

• 图 4.9：转到步骤 5

4. 对于第一对位点（按起始点递增顺序列出）（i1），删除任何带有 i1 的区间（m，n）

下一个不重叠对（i2），删除任何带有的区间（m，n），重复此过程，直到没有重叠区间。

• 图 4.9：没有这样的区间

5. 剩余区间的数量表示重组事件的最小数量，并且分配一个事件在每个区间发生。

八个采样染色体（n = 8）中四个分离位点的单倍型示例。

每个多态性

有两个等位基因，

任意表示为

0 或 1。每个四基因座单倍型都是

唯一的，因此 K = 8。

对于此示例，

= 2 和 Rh

（有关详细信息，请参阅文本）。

• 图 4.9：区间 (1,2) 和 (3,4) 中的重组事件

（根据 myers 和

Griffiths 2003。）

在此示例中，Rm

= 2，Hudson-Kaplan 算法表示，位点 1 和 2 之间必须发生至少

一次重组事件，并且位点 3 和 4 之间至少有一个。相反，Rh = 3（= 8 − 4 − 1），而 Myers-Griffiths 算法（参见 Myers 和 Griffiths 2003）表示所有位点对之间必须发生至少一次重组事件。我们可以直观地了解 Hudson-Kaplan 算法为什么错过了重组事件（位点 2 和 3 之间），因为注意到这对位点只有三个单倍型。然而，这些位点之间确实发生的重组事件产生了一个新的四位点单倍型，Myers Griffiths 算法会将其考虑在内，因此推断出的重组事件的最小数量更大。存在许多其他算法来找到

更准确的最小重组事件数界限

（例如，Song 和 Hein 2005），尽管对于大量样本和多态性，它们在计算上变得难以处理。

群体重组参数

许多进化过程会影响特定区域中连锁不平衡的估计水平：重组、自然选择、漂移、人口历史，甚至突变（最后一种，因为如果没有足够的多态性，许多重组事件将无法检测到）。然而，正如我们在第 1 章中看到的那样，在标准中性模型下，影响序列样本中重组量的唯一因素（无论是否可检测）是每个位点的重组率 c 和有效种群大小 Ne ，它与遗传漂移的幅度成正比。我们将常染色体位点的群体重组参数定义为 r ≡ 4Ne 。（r 有时称为 C 或 R，而 c 通常称为

r。为了在使用希腊字母命名参数时保持一致，并避免

r 和 r2 之间的混淆，我们将使用此处给出的符号。）在标准中性模型的假设下，r 与样本中的重组事件数呈正相关，与连锁不平衡量呈负相关。具体而言，大小为 n 的样本中重组事件的预期数量由 (Hudson

and Kaplan 1985) 给出：

R 的这个期望与第 3 章中给出的分离位点数 S 的期望形式完全相同，只是 q 被 r 取代。正如

q 不等于突变率一样，r 也不等于重组率，但预计在染色体上与重组率高度相关。

事实上，人类谱系研究中 c 的估计值与 r 的估计值高度相关（例如，McVean 等人，2004 年），尽管这些测量值之间的局部偏差可能表明自然选择的作用（O’Reilly、

Birney 和 Balding，2008 年）。

重新组合

在关于 r 是大还是小、样本大小以及在计算 r2 之前是否去除低频等位基因的略有不同的假设下，已经得出了 r2 和 r 的预期值之间的多种关系。假设样本量无限大且 r 值较小，则 r2 与 r 之间的经典关系为 (Sved 1971)：

此公式无法校正小样本量，并且错误地预测当 r = 0 时（即在完全链接的位点之间）的平均值 r2 = 1（回想一下，只有当一对位点的边际等位基因频率完全相同时，r2 才能等于 1）。另一种关系（Weir 和 Hill 1986；Hill 和 Weir 1988）可校正有限样本量，并在排除低频率等位基因（<10%）时为较小的 r 提供正确的预期：

) 1 (3 )(12 12

此公式不适用于较大的 r 值——特别是，当 r 大到足以使位点有效地脱钩时，它不会预测 r2 的值为 1/n。

对于 r = 0 和非常大的样本量，它预测 r2 的值为 5/11，类似于无限样本量的其他结果（Ohta 和 Kimura 1971；McVean 2002）。

公式 4.11 和 4.12 中给出的关系为我们提供了一种将重组水平和连锁不平衡联系在一起的方法。就不同种群之间的比较而言大小，这些结果预测在具有较大规模的群体中 LD 水平较低（假设每个位点的重组率相等）。非洲和非非洲人类种群之间的比较证实了这一预测，由于人类迁出非洲时瓶颈导致有效种群规模减少，非洲人的 LD 远低于非非洲人（国际 HapMap 联盟 2005）。就一对分离位点而言，c 的适当值是分离位点的核苷酸数量的倍数，因此对于相邻核苷酸的多态性，r = 4Ne

c，对于相距 L 个核苷酸的多态性，r = 4Ne

c(L-1)。这意味着，对于相距越来越远的位点，r 会增加，并且，将越来越大的 r 值代入公式 4.12，预计 r2 会沿着近似指数衰减染色体。

图 4.6 显示了 r2 与多态性之间的距离之间的这种递减关系。事实上，我们可以使用公式 4.12 和如图 4.6 所示绘制的数据来找到任何特定数据集的最佳拟合值 r（例如，Brown 等人，2004 年）。虽然这个 r 估计值代表了绘制的所有区域的平均值，但还有更准确的方法来估计 r。接下来我将描述其中一些方法。

估计种群重组参数

用于描述核苷酸变异的常见汇总统计数据（所有这些都是在适当假设下对参数 q 的估计）与用于估计重组参数 r 的统计数据之间存在两个重要差异。首先，用于描述核苷酸变异的统计数据（例如，公式 3.2、3.5、3.8、3.9 和 3.10）都是序列多样性的直接描述，即使平衡 Wright Fisher 模型的假设不成立，也很容易解释。虽然重组效应的总结（例如 K、ZnS）或多或少容易解释，但这些都不是 r 的估计量，尽管它们可以间接用于估计此参数（见下文）。相反，最准确、最常用的估计量采用近似似然法，假设标准中性模型来计算似然，研究人员并不总是清楚这些方法的作用。虽然提供对其功能的直觉并不是精确方法的必要条件，但在违反标准中性模型假设的情况下，统计数据应该是可解释的。第二个更重要的区别是，r 的估计量远不如 q 的估计量准确。也就是说，即使我们处理的是符合标准中性模型假设的群体，这些估计量在正确估计群体重组参数方面的表现也会比 q 的等效估计量差得多，尤其是在 r 较低且分离位点很少的情况下（Wall 2000a；Hudson 2001）。对多态性水平的依赖尤其令人不安，因为这意味着在突变率低的地区，或在由于选择或近期人口规模变化而导致多样性水平降低的地区，r 的估计值会有偏差。尽管存在所有这些警告，但估计这些统计数据已被证明在许多应用中很有用。与 q 的估计量一样，r 也有基于矩和基于似然的估计量。完全似然法（例如，Griffiths 和 Marjoram 1996；Kuhner、Yamato 和 Felsenstein 2000；Nielsen 2000；Fearnhead 和 Donnelly 2001）计算量非常大，而且考虑到可分析数据集的大小限制，它们与近似似然法相比提供的准确度（如果有的话）可能很小。因此，我重点介绍基于矩的估计量和多种形式的近似似然估计量。

基于矩的 r 估计量基于这样的观点：取样染色体之间的成对差异的方差（即 p 的方差）随着重组的增加而下降（Hudson 1987；Wakeley 1997）。要了解为什么会出现这种情况，请想象一个在所有分离位点对之间具有最大 LD 的样本：无论有多少多态性，这样的样本都只包含两个单倍型。因此，将存在最大方差——两个不同单倍型之间的所有比较都将导致每个多态性核苷酸的差异，而同一单倍型样本之间的所有比较都没有核苷酸差异。重组的作用是将样本分解成更多独特的单倍型，从而减少成对差异的方差。此描述还强调了估计 r 和 q 之间的另一个区别：与基于矩的 q 估计量 RECombinATion 不同，后者都使用分离位点数分布的一阶矩（即平均值），而 r 的估计量使用二阶矩（即方差）。Wakeley (1997) 略微改进了 Hudson (1987) 首次提出的估计量；这个改进的估计量表示为 rp，是目前使用最广泛的基于矩的估计量。我们之前看到（公式 3.3），通过使用所有序列对 i 和 j 之间的核苷酸差异数 (kij)，我们可以计算 p 如下：

基于此，我们可以计算 p 的方差如下：

Wakeley (1997) 表明，重组样本中 S2 的期望取决于参数 r 和 q，方式很复杂，但可用于估计 rp

不幸的是，rp 是一个比基于各种似然法的估计量更有偏差的估计量；Hudson (1987) 早期基于矩的方法甚至更糟（Wall 2000a；Hudson 2001）。幸运的是，有四种不同的方法可以找到基于似然性的 r 估计量。这些方法都不能被认为是完全似然方法，因为它们都使用了这样或那样的近似值，但总的来说，它们比完全似然方法在准确性、计算效率和速度方面都有所提高。其中两种方法可以简要总结一下：Hey 和 Wakeley (1997) 表明，对于 n = 4 和 S = 3 的样本，可以精确计算出 r 的似然估计值。对于大于此的样本，他们的估计量 rg（他们称之为 g）对四个序列的所有可能子集中的每组三个相邻的多态性取平均估计值。总体而言，rg 似乎给出了略微向下偏向的 r 估计值（Hey 和 Wakeley 1997；Hudson 2001）。Li 和 Stephens（2003）提出的另一种方法利用了这样一个事实：看到任何特定单倍型的概率取决于样本中的所有其他单倍型以及 r 和 q 的值。样本中每个单倍型的条件概率都不同，但可以通过使用马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC）方法对整个样本中的所有单倍型取平均值来找到最大化可能性的 r 值（我将其称为 rLS）。在程序 PHASE（Li 和 Stephens 2003）中，可以在从未定相的数据重建单倍型的同时估计 rLS。第三种方法（Wall 2000a）使用有时称为近似似然法的方法（有关详细信息，请参阅第 9 章）。该方法首先计算样本的几个汇总统计数据，例如 K 和，然后模拟样本数量和分离点数量的等效数据集，以 r 的许多值表示。给定任何特定的 r 值，观察到的汇总统计数据的概率是具有相同统计数据的试验的比例。最大似然估计量定义为最大化该比例的 r 值。估计量 rK ——实际上是找到一个 r 值，使观察到的单倍型数量 (K) 最大化，或者使单倍型数量和最小重组事件数量 (K 和 Rm) 最大化，这种方法被证明效果最好 (Wall 2000a；请注意，本文将单倍型数量称为 H)。作为 Wall 方法的一个应用示例，图 4.10 显示了针对单个 r 值进行一次此类模拟运行的结果。如果在样本中我们观察到 K = 10，则该图中的结果表明，在 r = 0.03（每个位点）的情况下，K = 10 的概率约为 0.079。也就是说，在 1,000 次随机模拟中，r = 0.03，样本大小和分离位点数量相同，只有 79 次模拟会产生K = 10。当 r = 0.03 时，这显然不是最可能的结果，因此较小的参数值可能会最大化看到 K = 10 的概率。对 r 的一系列值进行类似的模拟将使我们能够找到最大似然估计 rK。在找到 rKRM 的最大似然 (ML) 估计量时，我们需要找到最大化 K 和 Rm 观测值概率乘积的 r 值；因此，我们还必须记录给定特定 r 值的 Rm 概率。近似似然法易于实现，可用于为许多不同类型的参数找到最大似然估计量，而无需似然函数（例如，Andolfatto 2007）。事实上，很容易看出，给定观察到的分离位点数量，也可以模拟许多不同的 q 值来找到最大化观察到的 S 可能性的该参数的估计值。但是，简单的基于矩的方法提供同样准确（且更快）的 q 估计值，因此在这种情况下可能性方法通常是不必要的。概率（K|ρ = 0.03）图 4.10 给定 r = 0.03 查找观察到 K 个单倍型的概率。运行了一千次合并模拟，其中 n = 20、S = 10 和 r = 0.03，并记录每次模拟运行的唯一单倍型数量 K。 3 4 5 6 7 8 9 10

RECombinATion

我在这里考虑的 r 的最终估计量现在也是最广泛使用的估计量之一，部分是因为它的准确性，部分是因为实现它的软件包易于使用。这个估计量的最初想法来自 Hudson (2001)，他证明了在给定不同的 r 值的情况下可以快速计算出双位点抽样分布，从而可以进行“复合”可能性估计 rCL

（第 9 章还更详细地讨论了复合可能性方法）。

双位点抽样分布在某些方面类似于上一章中描述的等位基因频谱。预期ed 等位基因频率谱表示单个多态性的概率密度函数，即在样本中以任何特定频率发现单个变体的概率。双位点抽样分布表示一对位点的概率密度函数，具体来说，所有四种可能的双位点单倍型————都会出现在特定的频率组合中（例如 g11 = 1）。特定双位点样本配置的概率取决于 r，因此，我们可以通过模拟许多具有不同 r 值（假设 q 较小）的双位点样本来找到 r 的最大似然估计值，类似于上面描述的 Wall (2000a) 的方法。 Hudson (2001) 的关键见解是表明，可以将许多对链接位点的单个 ML 估计值（每个位点之间的距离可能不同，因此它们之间的重组率可能不同）组合起来，为整个数据集生成一个单一的复合似然估计值 rCL。由于这是一种复合似然方法，因此该估计值的平均值将反映真实平均值，但由于各个 ML 估计值之间的不独立性，置信区间将比预期的要窄。数据引导法已用于生成 rCL 估计值的准确界限，但这在计算上可能很昂贵。一种用于准确估计复合似然计算中的置信区间的较新方法是使用 Godambe 信息矩阵（Coffman 等人，2016 年），它可以快速有效地计算不确定性。复合似然估计器已得到改进，包括允许在同一位点发生多个突变的可能性（即有限位点模型；McVean、Awadalla 和 Fearnhead 2002）以及允许 rCL 值沿染色体变化（McVean 等人 2004）。在复合似然框架中，缺失数据也很容易处理。允许 rCL 值变化的能力特别强大，尤其是在处理区域内重组率差异很大的物种时（例如，图 4.11）。尽管程序 LDhat

（McVean、Awadalla 和 Fearnhead 2002）和 LDhelmet （Chan、Jenkins 和 Song 2012）使用 MCMC 方法来估计染色体上的可变重组模式，并且此类方法通常计算量更大，但获得的信息通常可以抵消所需的稍长运行时间。

性别平均重组率

位置（kb）

图 4.11 人类 HLA 区域中群体遗传数据（红色）和直接配子基因分型（蓝色）的重组率估计值比较。rCL 的估计值（红线）已通过假设人类有效种群大小的单一值和 c 转换为重组率。（根据 mcVean 等人 2004 年的研究；基于 Jeffreys、Kauppi 和 neumann 2001 年的研究。）

最后，应该对这里讨论的所有 r 估计量做一点评论。与上一章讨论的 q 估计量一样，所有这些统计数据都只是在 Wright-Fisher 平衡种群和适当的突变模型假设下估计 4Ne

c 的数量。如果这些假设不成立，那么我们的统计数据肯定会与样本中的重组量有关，但我们不知道确切的关系。在比较 q 和 r 的估计量时，这个问题尤其严重。在标准中性模型的假设下，q/r = 4Ne

c = m/c，因此这些参数的比率告诉我们基因位点突变和重组的相对重要性。但是，除非所有假设都成立，否则诸如 qW

之类的统计数据将无法准确估计 q 和 r，因此 qW

不等于 m/c。即使违反我们的模型似乎提供了一种直接估计等效平衡值的方法（如人口瓶颈），各个估计量的特殊行为也很难确保我们估计的是 m/c。例如，估计量 qW

和 p 在人口瓶颈之后以不同的速率恢复到其平衡值（参见第 9 章），因此非平衡人口中的统计数据选择将极大地影响结果。这意味着 r 的各种估计量恢复到其预期值的速率也可能有很大差异。总之，虽然对群体重组和群体突变参数的估计量的比较让我们对重组和突变的相对大小有了一些了解，但这个比率通常不等于 m/c。

基因转换

重组

到目前为止，在我们对重组影响的研究中，我们只考虑了交叉在打破位点间关联方面的作用。正如我们之前所看到的，然而，基因转换是重组的另一种结果（第 1 章）。

在连锁不平衡模式方面，交叉和基因转换之间的主要区别在于每种模式的影响程度。

交叉的影响随着物理距离的增加而增加，LD 根据公式 4.11 和 4.12 中给出的关系衰减。然而，由于基因转换片段（即转换的 DNA 片段）相对较短 - 大约为 100 到 1,000 个核苷酸（Chen、Cooper 等人，2007 年） - 该过程只会对紧密链接的位点产生影响，并且对于相距足够远的标记，该过程应该与距离无关（Andolfatto 和 Nordborg，1998 年；Wiehe 等人，2000 年）。要了解为什么会出现这种情况，请考虑图 4.12 中给出的示例，其中基因转换仅限于相对较小序列段，仅影响所示的三种多态性中的一种。如果我们想象一个群体，其中在所示的转换事件之前仅存在 A1 单倍型，则 A1 单倍型的产生显然会减少 A 和 B 基因座等位基因之间以及 B 和 C 基因座等位基因之间的关联。但是，对 A 和 C 基因座之间的连锁不平衡没有影响，因为转换事件不会改变转换道两侧基因座之间的关系。这样，转换道两侧基因座的结果类似于双交叉的结果，仅在受影响序列的长度上有所不同。因此，基因转换预计对紧密连锁位点的影响大于对较远位点的影响，而交叉在远距离上占主导地位。自然种群中的连锁不平衡模式与转换的重要作用一致，紧密连锁变体之间的 LD 低于如果交叉是重组的唯一机制所预期的 LD（Langley 等人，2000 年；Ardlie 等人，2001 年；Frisse 等人，2001 年）。事实上，许多估计基因转换影响的方法都依赖于小规模和大规模 LD 之间的对比（例如，Padhukasahasram 等人，2006 年）。 Hudson 的复合似然估计量 rCL 和类似方法 (Wall 2004) 可以很容易地改变，以另外估计基因转换与交叉的比率 (f) 和平均束长度 (q)，后者被认为是几何分布的 (Hilliker 等人 1994)。所有用于检测基因转换的方法的主要问题是，如果没有大量数据，许多此类事件将被遗漏 (Wiuf 和 Hein 2000)；即使有转换前转换后图 4.12 等位基因转换的影响。上图显示了一个在三个基因座 A、B 和 C 上杂合的二倍体个体。基因转换事件发生在减数分裂期间（上图中虚线箭头所示），等位基因 B2 作为供体，B1 作为受体。结果是额外的 B2 携带配子。大量数据，如果平均束长度远小于平均多态性间距离，那么几乎不可能准确估计束长度分布（但请参阅 Miller 等人 2012 年的可能方法）。基于沿序列的多态性分布的替代方法 - 并且不试图估计 r - 提供了基因转换的明确测试，但也会错过较短的束，并且如果转换过于猖獗以至于整个序列均质化（Sawyer 1989），则不会检测到任何事件。种群结构 5

种群分化

种群、亚种群和群落

如第 2 章所述，从分子种群遗传数据集得出的推论可能对所采样的精确个体非常敏感，尤其是个体是否全部来自同一种群。我所说的种群是指一群自由杂交的二倍体个体；该术语对自交或无性谱系的定义更具争议性。虽然它们有时可以用来表示略有不同的事物，但亚种群或群落这些术语通常与种群含义相同，我将交替使用它们。除了在特定情况下，一般会避免使用含义更丰富的术语种族和亚种。物种可以细分为任意数量的种群，无论它们是完全分离的（即它们不交换任何迁徙者）还是仅部分分离的（即它们交换一些迁徙者）。正如没有特定的遗传距离阈值来区分不同的物种一样，也没有特定的阈值来将两组个体称为不同的种群。正如下面将要讨论的那样，从分子数据中实际识别种群的问题可以归结为识别自由杂交的个体群体的问题——但完全随机交配的理论理想在现实生物中很少甚至从未实现。此外，种群可能已经分离了不同的时间，或者它们之间的关系可能存在某种系统发育结构（例如，种群 A 和 B 彼此之间的关系比它们与 C 之间的关系更密切）。如果亚种群尚未达到迁移-漂移平衡，则用于推理的模型的许多假设可能会被违反。如果亚种群没有完全杂交，任何改变种群内等位基因频率的进化力量（突变、选择、漂移、迁移）都可能导致它们之间的这些频率差异（图 5.1）。然后这些种群被称为分化的（我通常将“分化”一词保留为物种之间的差异）。分化导致种群结构

种群 1

种群 2

图 5.1 两个种群的例子，每个种群的等位基因 A 和 a 都是多态的。种群 1 中 A 等位基因的频率为 p1，种群 2 中为 p2（请注意，p1 的总和不必为 1）。

在群体之间，这仅仅意味着种群内的个体往往比种群之间的个体更紧密相关。显然，昨天才完全停止交换移民的种群并没有自由杂交，但它们也不会表现出任何结构。

这个关于种群的简单讨论引出了两个非常重要的问题：（1）我们如何衡量种群之间的差异？（2）我们如何在实践中定义种群？虽然我将在第 9 章中讨论推断人口人口历史的许多方法，但上述问题对人口遗传数据分析的重要性要求我们在此解决这些问题。此外，人口结构研究比分子数据的出现早了几十年，并且在某种程度上独立于推断人口历史的其他方法而发展。因此，它值得进行充分的讨论，特别是考虑到目前用于测量人口差异和定义人口的许多方法。我们依次处理这些主题；但是，通过首先了解 Wahlund 效应，可以更好地理解我们两个问题的答案。

Wahlund 效应

Hardy-Weinberg 平衡下的基因型频率的简单预期（第 1 章）提供了一个强有力的零假设，我们可以据此检验随机交配假设的偏离情况。一个基因座或种群可能脱离哈代-温伯格平衡的原因有很多，并非所有原因都涉及非随机交配甚至自然选择（Waples 2015）。然而，种群结构可能导致偏离 HWE，因为它会在种群之间产生强烈的非随机交配。当对多个亚群进行采样而不知道底层结构时，就会偏离 HWE：即使所有单个亚群本身都在 HWE 中，总体“种群”也可能远离 HWE 预期。这种偏离预期的形式总是相同的——观察到的杂合子个体比 HWE 下的预期要少。这种杂合子缺陷被称为 Wahlund 效应，以瑞典遗传学家 Sten Gösta William Wahlund 的名字命名，他首次描述了这种采样类型的后果（Wahlund 1928）。要了解杂合子不足的原因，请考虑图 5.1 中的两个种群。我们将种群 1 中 A 等位基因的频率表示为，将种群 1 中 a 等位基因的频率表示为 q1（我们在这里使用此符号，以免将等位基因 A1 与种群 1 和 2 混淆）。在种群 1 中，p1 = 0.8 和 q1 = 0.2，而在种群 2 中，p2 = 0.8（请注意，p1 不必等于 1，因为这些是来自两个不同种群的相同等位基因的频率）。如果我们从每个种群中抽取了相同数量的个体，则两个种群的平均等位基因频率，即种群结构 p，为 0.5，因此预计所有个体中有 50% (=2) 在 HWE 下是杂合的。但是，样本中观察到的杂合子比例将约为 )，这比预期值低得多。通过进行更多这样的计算，您会注意到，与 Hardy-Weinberg 期望值的偏差幅度与等位基因频率的差异成正比：与等位基因频率差异很大的种群相比，等位基因频率相似的种群在分组时与 HWE 的偏差非常小。因为我们经常要处理两个以上的亚群，所以种群间等位基因频率差异的一个有用度量是频率方差 s2。因此，一般来说，Wahlund 效应对预期每种基因型的频率可以表示为：

其中再次表示种群中等位基因的平均频率，pAA表示基因座上三种不同二倍体基因型的频率。等位基因频率的方差越大，纯合子越多，杂合子越少，当种群固定为替代等位基因时，获得的最大方差（=0.25）导致没有观察到杂合子。这些关系表明，种群间等位基因频率的方差可能是量化与 HWE 偏差的一种好方法，因此也是衡量种群间分化程度的一种好方法。我们将看到，对方差的轻微修改是衡量种群分化的理想方法，它将理论预测与数据联系起来。测量种群分化

使用 FST 测量种群分化

给定一个物种内多个种群的多个个体样本，我们希望能够说出这些种群的差异有多大。暂且不论我们计算这些差异的确切方式，实际上有多种其他方法来总结分化。我们可以询问多个种群之间的平均细分量，或询问所有种群之间的成对关系。我们也可能拥有非常不同的数据类型，从单个多态性位点（或多个未链接位点）的等位基因频率到编码或非编码区域中的完整单倍型序列。处理两个或两个以上亚群的方法大致相同，但测量单个位点与整个序列的分化的许多不同方法通常不同；因此，我们首先讨论单个多态性位点的分化。在上述关于 Wahlund 效应的讨论中，我们看到，种群间等位基因频率的差异是衡量分化的自然方式，并且它与基因型频率的理论预期很好地相关。然而，等位基因频率的差异本身并不是一个非常有用的统计数据，因为它的值高度依赖于平均等位基因频率。假设每代都对等位基因进行二项式抽样，平均等位基因频率为 p = 0.5 的基因座在种群间表现出的差异将比从完全相同的个体中抽样但 p = 0.01 的基因座高得多。这意味着很难比较不同基因座之间或不同种群组之间的差异。为了用最大可能的方差来标准化方差，我们可以定义一个新的分化统计量：其中 s2 是等位基因 A 在人群中频率的观测样本方差，是等位基因 A 在人群中的平均频率，是等位基因 a 在人群中的平均频率（=1 − ）。图 5.1 中显示的人群的值为 0.09/0.25 = 0.36。该度量首先由 Wright（1931、1943、1951）提出，他将其定义为亚群之间的分化量，并表明它对任何频率的中性等位基因都具有相同的预期值。就我们的目的而言，下标“ST”并不是真正必要的，但它将此度量与此处未涵盖的类似 HWE 偏差度量（具体而言，FIS ，其中“I”代表“个体”，“S”代表“亚群”，“T”代表“总群体”，这是 Wright 的原始符号）区分开来。作为群体分化的度量，它具有一些非常好的特性。它的范围在 0 到 1 之间，0 表示没有分化，1 表示不同亚群中替代等位基因的完全固定。有很多不同的方法可以理解 FST 到底代表什么，但我们可以通过简单的代数将其与 Wahlund 效应联系起来：

该方程表示，当没有分化（FST = 0）时，杂合子不存在缺陷，但当完全分化（FST）时，杂合子完全缺失。因此，FST 可以被认为是 Wahlund 效应大小的量度。或者，人们可以将其视为一组种群中总变异量的量度，该量度由种群间方差而不是种群内方差来解释，或者作为亚种群内等位基因与总种群之间的相关性（Holsinger and Weir 2009）。

已成为一种使用分子数据量化种群分化的非常流行的方法。然而，计算“FST”的方法有很多种。与估计核苷酸的许多不同统计数据一样多样性

参数 q（第 3 章），还有许多不同的方法来计算

FST 类统计数据。与核苷酸多样性测量的另一个相似之处是

人口结构

通常（且容易混淆）用于表示参数和统计数据——即既是与人口模型相关的理论构造，又是从数据中估计该参数的精确方法。更令人困惑的是，一个常见的 FST 类统计数据被表示为 q（Cockerham 1969；Weir 和 Cockerham 1984）！参数和统计数据的这种混合可以追溯到 Wright 对 FST 的原始定义，我不会尝试理清符号或引入我自己的新符号来区分相互竞争的用法（在本章中，我也不得不以两种方式使用该术语）。但是，应该意识到，用于量化种群内和种群间相对变异量的许多不同统计数据和参数都称为 FST。如果在亚群中采样的染色体数量相同，则公式 5.2 是在“固定”效应模型（下文进一步解释）下估计 FST 的无偏方法。如果样本量不相等，则计算此统计数据的更好方法是：其中对于所有 K 个亚群，每个亚群 i 的样本量 ni 样本等位基因频率 pi ，并且整个数据集的平均样本量 n 和平均样本等位基因频率（Weir 1996）。请注意，如果所有亚群的样本量相同（即所有 ni 都相等），则此公式简化为公式 5.2。从同一组种群中的分离点计算出的 FST 值存在相当大的差异。这是因为产生种群结构的进化过程（见下文）具有很大的随机成分，导致 FST 的实际值范围很广。在看似严格的关于潜在种群结构的假设下，Lewontin 和 Krakauer (1973) 表明，变换后的值应为 c2 分布，自由度为 K − 1（其中 K 再次是亚种群的数量）。尽管更复杂（但不一定更现实），但已经得出了 FST 方差的预期（例如，Nei 和 Chakravarti 1977；Weir 等人 2005），c2 近似值似乎非常符合从自然种群收集的数据。图 5.2 显示了四个人类种群中从整个基因组计算出的 FST 分布。请注意，FST 中存在很大的方差，并且它与具有三个自由度的 c2 分布非常相似（Weir 等人，2005 年）。Cockerham（1969 年）指出，上面给出的计算方法仅考虑了种群内个体的采样。如果研究目标是一组固定的种群，那么这种“固定”效应模型是完全合适的。固定效应模型也更适用于种群数量有限的情况——例如人类。但是，如果我们试图将从一小部分种群中获取的 FST 值与更大的种群联系起来，那么我们还必须考虑与不仅种群内个体采样相关的随机性，而且还要考虑物种内种群的采样。 Weir 和 Cockerham (1984) 随后展示了 FST 类参数如何对人类基因组产生影响。数据来自四个人类群体中 1 号染色体上的 599,356 个 SnP。（Weir 等人，2005 年之后）他们称之为 q 的等式可以在这种“随机”效应模型下进行估计，以便使用方差分析 (ANOVA) 方法更好地整合多级抽样。当然，随机效应模型更合适的条件也是非常理想化的：所有亚种群必须彼此平等相关，并且具有相同的种群规模，并且所有亚种群之间的迁移率必须相同（相当于无限岛模型；参见第 1 章）。满足这些条件的物种可能很少。此外，当从大量亚群中抽取大量样本时，随机效应模型会收敛到固定效应模型（Weir 1996）。因此，固定效应估计量（公式 5.2 或 5.4）可能适用于许多研究。

Wright 原始公式的首次修改之一是由 Nei (1973) 进行的，他引入了一种当一个基因座有两个以上等位基因时计算 FST 的方法。 Nei 将他的统计量称为 GST

（当只有两个等位基因时，它相当于统计量 FST

），并将其定义为：

是根据所有子群体中的所有个体的所有 i 个等位基因的频率计算得出的总采样群体（个体）中的预期杂合度：

= − −∑ (5.6)

是从每个采样子群体（每个子群体都有自己的样本大小 nS

）分别计算得出的预期杂合度的平均值：

请注意，数量 HT

有时被称为 DST

（Nei 1973）。

这些杂合度的定义与以下定义非常相似公式 3.1 给出了这些值，但现在它们是根据种群结构的层次结构定义的。根据图 5.1 中所示的种群计算出的 GST 值为 (0.526 − 0.356)/0.526 = 0.323，与使用公式 5.2 获得的值相似。在测量具有两个以上等位基因的位点的种群分化时出现的一个问题是 GST 不考虑等位基因的身份。因此，两个种群可能不共享任何等位基因，但种群结构不会有 GST = 1。要了解原因，请注意，当 HS 不为 0 时，GST 会小于 1，即使分化可能已经完成（即没有共享等位基因）。种群分化度量对种群内变异的依赖性是本文描述的许多统计数据的共同点，将在下一节进一步讨论。为了克服对其最大可能值的依赖，Hedrick (2005) 提出了一个标准化统计量 G′ST，类似于第 4 章介绍的标准化连锁不平衡系数 D′。然而，G′ST 本身存在许多问题，不能与 FST 的参数期望相关（Whitlock 2011）。对于具有许多等位基因的基因座（例如微卫星），我们可以通过明确考虑突变过程，从而考虑等位基因之间的突变距离来克服 GST 的局限性。对于采用逐步突变模型并假设岛屿模型的微卫星位点，Slatkin (1995) 表明，他所称的 RST 统计量可用作参数 FST 的估计量。该统计量的计算方法如下：

是所有亚群所有样本中单个位点上观察到的等位基因的重复次数（或等位基因大小，当不知道确切的重复次数时）的方差，VS

是每个亚群内重复次数的平均方差。我们之前已经看到过使用微卫星等位基因大小方差的统计量，qV（公式 3.23）；为了保持一致性，我们将继续使用那里引入的符号，但请注意，“S”通常用于表示公式 5.8（Slatkin 1995）中的方差。我们还可以看到，使用等位基因频率（公式 5.2、5.4 和 5.5）测量种群分化与使用等位基因大小（公式 5.8）测量种群分化之间存在令人愉悦的对称性：两者都基于种群内和种群之间的方差差异。RST 通常比 GST 更准确地推断微卫星，至少在逐步突变模型成立时如此。当它不成立时，RST 也可能有偏差（Balloux 等人，2000 年）。为了从全序列数据计算 FST

，我们可以使用一个基因座上的位点杂合性总和（Nei 1982）：

根据公式 3.2 计算，使用跨亚群的所有样本组合，而 pS

是分别对每个亚群进行相同计算的平均值（数量 pT

有时也称为

）。因此，统计量 gST

类似于

的多位点版本，因此，正如 Nei（1982，第 172 页）所述，“显然，pT

对应于 HT

”在单位点分析中（显然）。Slatkin

（1991）表明 gST

是岛屿模型的 Wright 参数 FST

假设的估计量。已经提出了类似的统计数据来衡量从完整序列数据（通常是单倍型）进行的种群分化，包括对单个位点的多个突变的校正。Lynch 和 Crease（1990）提出了一种测量方法，他们称他们的统计数据为 NST。两者的一个重要区别是，前者在计算 pT 值时包括来自同一亚群的序列之间的比较，而后者则没有（请参阅下文的类似测量）。这意味着 NST 不是 FST 的估计量，尽管 NST 会收敛到大量采样种群（Lynch 和 Crease 1990）。Excoffier、Smouse 和 Quattro（1992）又增加了一项新内容，他们基于序列之间的单倍型差异引入了 Weir 和 Cockerham（1984）的 ANOVA 框架的扩展；他们的统计数据表示为 fST。 Excoffier、Smouse 和 Quattro 的分子变异分析 (AMOVA) 方法与其他使用全序列数据的方法不同，它不使用位点杂合性的总和，而是需要完整的单倍型。这是因为它考虑了数据集中所有单倍型对之间的核苷酸差异数量，然后将得到的距离矩阵转换为层次方差分量。因此，fST 通常应用于线粒体 DNA (mtDNA) 数据，尽管实际上可以为微卫星等位基因生成类似的距离矩阵，并且 fST 也可以用于这种数据（Michalakis 和 Excoffier 1996）。与标准方差分析不同，在 Weir 和 Cockerham (1984) 的 ANOVA 方法和 Excoffier、S小鼠和 Quattro (1992) 的 AMOVA 方法中，方差分量（因此）可以为负数，而不必全部加起来为 1；在所有分析中，将负值设置为 0 是标准做法。有关这些种群分化测量方法之间的差异和相似之处的讨论，请参阅 Excoffier (2007)。种群分化的替代测量方法及其相关统计数据只是总结种群分化的一种方式。已经提出了替代方法（有时也会使用），这些方法基于私有等位基因（仅在一个种群中出现的等位基因；Slatkin 1985）、共享等位基因（Bowcock 等人 1994）、等位基因频率的绝对差异（或其平方根变换值；Cavalli-Sforza 和 Edwards 1967）、基因座上没有重组时的基因树拓扑结构（Slatkin 和 Maddison 1989；Hudson、Slatkin 和 Maddison 1992）以及种群间纯合性的差异（Nei 1972）。最后一个测量值（称为 Nei 的 D）一直是用于等位酶和微卫星数据的遗传距离的特别流行的测量值，对于这些基因座，可能有许多等位基因。 Nei (1972) 将一对种群的某个基因座的统计量定义为：

种群结构分别是种群 X 和 Y 中某个基因座的第 i 个等位基因的频率。在这些计算中，JX 表示种群 X 中所有等位基因的预期总纯合度（假设随机交配），JY 表示种群 Y 中所有等位基因的预期总纯合度，JXY 表示如果种群 X 和 Y 具有完全相同的等位基因频率，则所有等位基因的预期总纯合度。如果两个种群在相同的样本频率下具有相同的等位基因，则 D = 0。种群之间等位基因频率的差异越大，D 值就越大。与 FST 之类的统计数据不同，Nei 的 D 取决于基因座的突变率。虽然独立于突变率似乎使 FST 和相关统计数据更加可靠，但在解释这些测量值在不同基因座之间的差异时，仍然存在重要的警告。

上述所有类似 FST 的统计数据的一个非常重要的方面是，它们受到亚群内变异水平的强烈影响（Charlesworth 1998；Jakobsson、Edge 和 Rosenberg 2013）。因此，我们将它们称为相对分化测量。相反，种群分化的绝对测量大多独立于种群内多样性水平；绝对测量也称为遗传距离。对种群内变异水平的依赖意味着类似 FST 的统计数据的值会因标记类型（SNP、微卫星等）的不同而不同，这仅仅是因为标记间的平均杂合度不同（例如，Moyle 2006）。对种群内多样性的依赖还意味着，从基因组中多样性较多或较少的部分采集的相同类型的标记将提供截然不同的分化水平视图。例如，来自重组减少的区域（由于连锁选择，这些区域的多样性通常会降低）的 FST 将高于正常重组的区域，原因仅仅是核苷酸多样性的总体水平不同（Charlesworth、Nordborg 和 Charlesworth 1997；Charlesworth 1998；Noor 和 Bennett 2009；Cruickshank 和 Hahn 2014）。为了解决这个问题，Nei（1973）提出计算两个种群序列之间成对差异的平均数量，不包括种群内序列之间的所有比较。我将把这个统计数据称为 dXY，尽管在文献中它也被称为 pXY（和 Li 1979）、DXY（Nei 1987）和 pB（Charlesworth 1998）。这种绝对的分化测量与所比较的两个种群内的多样性水平无关（但取决于突变率）。它的计算方法如下（Nei 和 Li 1979；Nei 1987，等式 10.20）：分别是种群 X 中第 i 个单倍型和种群 Y 中第 j 个单倍型的频率，kij 是每个种群中单倍型对之间的核苷酸差异数。这个等式类似于我们计算种群内单倍型间平均差异数的方式（等式 3.3），尽管这里我们只计算种群之间的差异。的方差在 Nei (1987, eq. 10.24) 中给出。请注意，dXY 也可以从非相位数据中计算出来，其中 xi 表示等位基因频率，kij 为 1 或 0，具体取决于等位基因在单个位点是否不同。然后将各个位点的值相加以获得全基因座测量值。dXY 也可以使用来自每个种群的单个序列来计算，因为它具有与发散统计量 d 相同的期望值（参见第 7 章）。是一系列基于 dXY 的相对分化测量指标，应用广泛。在两个种群 X 和 Y 中，我们将种群内的多样性水平称为 dX，分别用样本 X 中的 p 和样本 Y 中的 p 计算。Nei 和 Li (1979) 将两个种群之间的“净”核苷酸差异测量 da（他们称之为 d）定义为：

该统计数据（通常也称为 Da

）旨在仅捕获自种群分裂以来积累的差异。它通过减去分裂前积累的差异（见图 7.1）来实现，假设祖先变异水平等于两个当前种群中发现的变异的平均值。因此，da 是一个相对测量指标，因为它的值会受到种群内变异量的强烈影响。（令人困惑的是，Nei [1987] 在不同的地方将此统计数据称为 da、d 和 Dm。）我们还可以将种群或物种之间的固定差异数表示为 df（例如，Ellegren 等人，2012 年）。固定差异数也是一个相对度量，因为它依赖于种群内的变化。要了解这些绝对和相对度量如何产生不同的结果，请考虑图 5.3 中给出的示例。图 5.3A 显示了具有平均重组率的区域中某个基因座的两个种群的一个假设谱系历史（有关基因谱系的详细讨论，请参阅第 6 章）。种群内多样性水平与每个种群样本最近的共同祖先的时间成正比，因此相对于其历史的种群间部分而言较高。在这种情况下，较高，而 da 相应较低，因为它们依赖于种群内变异。另一方面，图 5.3B 显示了来自低重组区域的基因座的假设谱系历史，该基因座取自与图 5.3A 完全相同的种群和个体。由于连锁选择，在这种情况下，种群内最近的共同祖先的时间非常近。这意味着 dX 较低，而 da 相应较高；dXY 在两个图中完全相同。这样，da 可以为来自同一种群的基因座提供非常不同的结果，因为两个基因座依赖于种群内变异，而一个则不依赖。因此，Charlesworth (1998, p.538) 建议，相对分化测量“不一定适合于我们想要比较种群内变异水平非常不同的基因座”。

许多种群分化测量依赖于相对多样性水平的最后一个含义是，它们可能会受到确定偏差的影响。要理解原因，请回想一下确定的主要原因

种群结构

种群 X

种群 Y

种群 X

图 5.3 演示 dX 之间的差异

(B) 都显示了与两个种群（X 和 Y）的四个采样染色体（A、B、C 和 D）相关的示例谱系。统计数据 dX 分别测量种群 X 和 Y 中样本之间的平均核苷酸差异数。 dXY 测量种群 X 中每个样本与种群 Y 中每个样本之间的平均核苷酸差异数，不进行种群内的比较。da 表示 dXY 之间的差异（公式 5.12 和 5.13），df 表示固定差异的总数。（A）和（B）之间的重要区别在于，两个面板之间的 dX 存在差异，但 dXY 没有差异。为简单起见，两个面板中的谱系具有相同的高度，每个图中种群 X 和 Y 内的融合时间也相同。情况不一定如此，但它使区分此处描述的各种度量变得更容易。存在偏见的原因是，中频多态性更有可能在小型“发现”个体样本中观察到。这意味着，种群频率接近 0.5 的分离位点将在确定的标记集中过度代表。这种确定偏差对汇总统计数据的影响很复杂（Rosenblum 和 Novembre 2007；Albrechtsen、Nielsen 和 Nielsen 2010），但会影响许多关于种群结构的推断，包括 FST 的值（Clark 等人 2005）、推断的种群间迁移率（Wakeley 等人 2001）以及种群本身的结构（Foll、Beaumont 和 Gaggiotti 2008；Guillot 和 Foll 2009）。是否有证据表明某个基因座存在种群分化？上述所有用于测量种群分化的统计数据都提供了对种群在等位基因频率上差异程度的一些定量评估。一旦这些测量有了这些样本，我们就可以利用它们推断出所采样种群的结构以及可能导致观察到的任何差异的进化力量。

种群 Y

种群 1

种群 2

图 5.4 图 5.1 中的等位基因计数。计数分别显示种群 1 和种群 2 中的 A 和 a 等位基因数量。对这些数据进行 χ2 检验（由于每个单元格中的计数较小，因此使用连续性校正）得出 P = 0.025。

我们可以提出的最简单的问题是是否有任何证据表明存在种群结构 — 即样本是否来自一个混血种群。有多种方法可以检验种群结构的证据，包括如果已经从个体收集了基因型数据，则检验是否偏离哈迪-温伯格平衡（参见前面关于 Wahlund 效应的讨论）。如果尚未收集基因型数据，我们仍然可以通过比较拟议亚群之间的等位基因频率来检验结构。进行此测试的最简单方法是使用 c2 检验或其他等位基因计数独立性检验（参见 Goudet 等人，1996 年）。使用图 5.1 中的等位基因计数，我们可以通过如图 5.4 所示排列数据来应用此类检验。通过应用 c2 检验，我们发现这些等位基因计数来自一个单一种群的概率为 P = 0.025，因此这两个亚群很可能存在差异。

我们还可以根据这些等位基因计数，用统计学术语来提出我们的问题，例如 FST 及其相关测量。测试种群结构相当于测试 FST = 0 的零假设。获取此类测试的 P 值的一种直接方法是多次在种群中置换样本，从而生成零值分布（Hudson、Boos 和 Kaplan 1992）。然后，P 值基于模拟分布中观测值的位置；因此，P 值为 0.01 要求观测值高于除 1% 之外的所有置换值。对于单个多态性位点，使用 FST 进行测试似乎并没有比等位基因计数（Hudson、Boos 和 Kaplan 1992）具有太大优势，但对于包含多个分离位点的较长序列，由于位点之间的不独立性，必须使用置换方法。这种方法将为观察到的数据计算 gST 或其他基于序列的分化统计数据（例如，Hudson 2000），然后多次置换亚群中的个体单倍型以生成零分布。正如我所描述的那样，使用等位基因计数的方法和使用分化汇总统计数据的方法都在测试无结构的零假设。那么应该显而易见的是，样本大小和效应大小之间存在紧密的关系，当对大量染色体进行采样时，即使是非常小的分化水平也可以检测到。换句话说，如果有足够的数据，低至 FST = 0.001 的值可能具有重要意义，并且仅表明存在某种低水平的人口结构。因此，决定是否应合并或拆分亚群取决于样本量和要解决的特定问题（参见 Waples 和 Gaggiotti 2006）。对于何时说两个种群是分化的，没有单一的规则，并且大多数研究可能不会受到将分化水平为种群结构 = 0.001 的亚群合并的影响。相反，最近使用数十万个标记物的研究可以检测到重要的地理结构模式，即使平均值为 0.004（Novembre 等人，2008 年）。在本章后面，我将讨论使用信息论方法确定具有多个基因座的种群结构的几种方法，这些方法使我们能够对提出更多亚群时数据拟合度增加的情况做出似然陈述。一旦我们确定存在显着的种群结构，我们如何解释我们对分化的总结？“很多”或“一点”分化是多少？Wright（1978，第 85 页）给出了以下指导方针：“我们将 FST = 0.25 作为一个任意值，高于该值时分化非常大，0.15 到 0.25 的范围表示中等分化。但是，如果小到 0.05 甚至更小，分化绝不能忽略不计。”这些解释是否应该在所有情况下使用 - 或者仅仅作为经验法则 - 是不可能知道的，特别是当结果取决于所使用的标记时。此外，

从人口分化数据中得出的最有趣的推论将不仅限于 FST 任何特定值的大小或含义，而是与推动这种分化的进化力量有关。进化过程对分化的影响

自然选择对种群分化的影响

种群间等位基因频率的差异是由改变种群内等位基因频率的相同过程驱动的：突变、

自然选择、遗传漂变和迁移。突变的影响将始终非常小，并且主要限于将新的等位基因引入个体种群。复发性突变有时会将状态相同的等位基因引入不同的亚种群，但发生此类事件的概率很低，取决于 q（Clark 1997）。然而，

选择、漂变和迁移——以及这些力量之间的相互作用——可能会对种群分化产生非常大的影响。该领域的大部分近期工作都集中在梳理这些力量产生的模式。

我将首先关注自然选择对种群间差异的总体影响，并回到第 10 章中用于识别特定选择位点的方法。正如预期的那样，自然选择对种群分化的影响对于不同的选择形式非常不同：弱负选择、平衡选择和正选择可以产生高度独特的分化模式。这意味着我们可以在一定程度上区分这些影响，尽管在中性情况下仍然很难区分它们。强负选择当然会阻止任何变体达到可观的种群频率，因此对分离多态性的分化影响不大。然而，弱负选择允许变体以低频率分离，但限制了可能的等位基因频率范围。这种限制意味着，对于弱有害变体，平均 FST 将低于能够漂移到任何频率的典型中性变体（图 5.5）。此外，虽然平衡选择也会降低 FST（见下一段），但只有弱负选择会导致变异在每个种群中的频率较低；平衡选择下的多态性可能处于任何频率。我们预计，在采样种群中受到相同（或非常相似）选择压力的平衡多态性在种群中的频率相似。如前所述，在这种情况下，选择再次限制了可能的等位基因频率的范围，这意味着与中性多态性相比，种群之间的等位基因频率变化会更小。所有这些都意味着平衡选择将降低 FST。这种选择的典型例子是人类的 ABO 血型基因座：A、B 和 O 等位基因存在于几乎每个人类群体中，但等位基因频率范围很窄（Brues 1954；Chung 和 Morton 1961）。尽管作用于该基因的平衡选择的具体形式尚不清楚，但 ABO 基因座除了非常低的 FST 外，还显示出平衡选择的多种分子特征（Stajich 和 Hahn 2005；Calafell 等人 2008）。

中性突变

有害突变

FST < 0.05 的 SNP 比例（%）

中性突变

有害突变

1 3 5 10 15

图 5.5 负选择对 FST 的影响

。显示了模拟两个种群之间共享的中性和

选择多态性的结果，平均 FST

设置为 0.11（相当于人类种群之间的平均分化）。

随着对有害突变的选择增加，（A）平均 FST

降低，并且

（B）所有 FST

<0.05 的多态性的比例增加。（Barreiro

等人，2008 年。）

种群结构

任何对物种内所有亚群起类似作用的正向选择预计不会导致亚群之间的分化，除非当一个新的有利等位基因连续扫过每个种群时（但参见 Bierne 2010）。然而，仅限于种群子集的正向选择（称为局部适应）可能导致等位基因频率的巨大差异。（这种空间变化选择形式有时被称为平衡选择，因为多态性在物种水平上得以维持。在研究种群分化的背景下，我只会将维持亚群内多态性的过程称为平衡。）在极端情况下，在一种环境中极其有害的等位基因在另一种环境中可能非常有利：在这种情况下，等位基因频率在密切相关的种群之间可能从 0 到 1 不等。在这种情况下，选定的多态性可以显示 FST = 1，即使在大多数基因组中没有分化（例如，Turner 等人，2010 年）。在不太极端的情况下，正向和负向效应的影响有害选择将被视为 FST 值分布上尾中选定多态性的过量。图 5.6 显示了人类基因组中具有 FST 的非同义 SNP 的大量过量；对于 FST < 0.05 的非同义 SNP，即分布下尾中的有害多态性，也观察到了类似的过量（Barreiro 等人，2008 年）。这种过量是相对于假定受到很少直接选择的多态性（在此示例中为非基因 SNP）来衡量的。但是因为 FST

和等位基因频率并不完全独立，所以正确的统计比较必须比较多态性

SNP 比例 (%) 与 FST > 0.65

2.2 × 10−15

4.3 × 10−12

3.9 × 10−3

图 5.6 人类基因组中正向选择的影响。在四个人类群体中，总共对 851,856 个 SnP 进行了基因分型，并根据 Excoffier、Smouse 和 Quattro (1992) 的方法进行了 FST。FST 分布上尾的非同义多态性大量过剩与正向选择的作用一致（P 值表示与非基因 SnP 相比过剩）。编码区域中的连锁选择很可能增加了此尾部中同义多态性的比例。（Barreiro 等人，2008 年）从选定和未选定的位点类别中获取频率相似的短语，以检查选择对种群分化的影响（例如，Barreiro 等人，2008 年；Langley 等人，2012 年）。

迁移和漂移对种群分化的影响

对于中性多态性，种群分化模式将由迁移、漂移和连锁选择决定。连锁选择显然对靠近选定多态性的中性多态性有影响——例如，参见图 5.6 中同义多态性的 FST 模式——它生成的模式将是找到特定区域的关键，这些区域是空间变化选择的目标（参见第 10 章）。

同义

非同义

连锁选择也会对与选择目标松散关联的大片基因组的 FST 估计值产生影响，因此整个基因组的分化将是显示该过程不同影响的基因座的混合体（Nosil、Funk 和 Ortiz-Barrientos 2009）。由于连锁选择的结果主要是减少或增加局部 Ne，因此在本章的其余部分，我将简单地将此机制视为确定种群分化水平的漂移项的一部分。种群分化主要由迁移和漂移的相反力量决定。为了理解迁移和漂移对种群分化的不同影响，解释亚种群历史的两个对立模型是有益的：恰当命名的迁移和隔离模型（Wakeley 1996a）。考虑两个经常被问到的关于亚种群（有时是物种）的问题：（1）它们多久前分裂的？（2）它们之间有多少次迁徙？事实证明，所选择的种群历史模型将从根本上影响这些问题的答案。

迁移模型本质上是 Wright 的无限岛模型（第 1 章）。

在这个模型中，亚种群之间的迁移使等位基因频率同质化，而漂移引起的采样会导致等位基因频率的差异。在迁移模型中，所有亚种群都已达到迁移-漂移平衡，因此不再有任何分裂的历史信号（图 5.7A-C）。在下面列举的大量假设下，Wright (1931) 表明，统计 FST 常染色体基因座的预期值为：是每个亚种群的大小（假定它们相等），m 是每个个体每代的迁移率（有时复合参数 4Ne m 或仅 Ne m 本身表示为 M ）。如果没有迁移（m = 0），则 FST 在平衡状态下将等于 1（图 5.7C）；随着迁移的增加，FST 将下降至 0（图 5.7A）。公式 5.14 似乎提供了一种简单的方法来估计每代在人群之间移动的有效移民人数，Ne 人们要做的就是从数据中计算 FST（或类似 FST）统计数据。然而，要使这种关系成立，必须满足大量假设，违反任何这些假设都会导致对总迁移的极度误导性推断。这些假设中最重要的——也是最有可能不真实的——是 (1) 人口确实处于迁移漂移平衡状态，以及 (2) 人口之间没有空间结构（后一个假设仅在考虑两个以上人口时才有意义）。任何时候，由于祖先多态性而不是迁移，人口共享等位基因时，第一个假设都会被违反；这些情况正是隔离模型与此相关，将在下文进一步讨论。当没有无限数量的人口彼此交换相等数量的移民时，第二个假设就被违反了。例如，在垫脚石模型中

人口结构

FST = 0.44

人口 1

人口 2

人口 1

FST = 0.44

人口 2

人口 1

人口 2

人口 1

人口 2

A A A a aa

人口 1

人口 2

A A a a aa

人口 1

图 5.7 迁移和隔离模型之间的差异。（A-C）说明了在不同人口迁移水平下的迁移模型。每个椭圆形代表一个单独的人口。（A）中的迁移率最高，（B）中的迁移率中等，（C）中的迁移率不存在（即没有迁移）。所有的分化都是迁移和有效种群规模的函数（见公式 5.14）。（D-F）说明了自种群分裂以来不同时间下的隔离模型。图中显示了两个种群中个体染色体的假设谱系关系，底部的线代表染色体采样的时间（即现在）。（D）中分裂是最近的，（E）中分裂是过去的中间时间，（F）中分裂是很久以前的时间。所有的分化都是分裂以来的时间和有效种群规模的函数（见公式 5.15）。（第 1 章）存在空间结构，因为种群与邻近种群交换了更多的移民。在这种情况下，附近的种群将具有更相似的等位基因频率，并且将存在“距离隔离”（Wright 1943；见第 9 章）。如果违反了这些假设中的任何一个或许多其他假设，包括选择没有影响（参见 Whitlock 和 McCauley 1999），则公式 5.14 不能用于准确估计迁移率。已经开发了几种方法，可以通过允许祖先共享的等位基因和种群之间的不对称迁移来放宽其中一些假设（例如，Beerli 和 Felsenstein 1999、2001；Bahlo 和 Griffiths 2000）。然而，这些模型仍然假设种群处于平衡状态，并且它们没有区分迁移和隔离作为促成种群结构的过程。隔离模型描述了一种种群分裂情景，分裂后没有进一步的迁移（图 5.7D-F）。在这种情况下，两个产生的种群将具有相似的等位基因频率，只是因为它们一开始就有相似的等位基因频率：分裂后，这两个种群应该在祖先种群中具有大约相等的所有等位基因的代表性（图 5.7A）。由于漂移（和选择）——所谓的谱系分类过程——等位基因频率将随着时间的推移而偏离，以至于在足够的时间之后，将没有共享的等位基因，并且所有染色体将仅与同一种群内的其他染色体最密切相关——也就是说，将存在相互单系（图 5.7F）。谱系分类可能需要很长时间，并且该过程的随机性意味着单个基因座在成为相互单系所需的时间上会有所不同。作为一般准则，Hudson 和 Coyne (2002) 计算出 95% 的常染色体基因座样本在 9 到 12Ne 代后不会在两个谱系之间共享任何等位基因。在隔离模型中，对种群分化贡献最大的两个参数是种群分裂以来的时间 t 及其有效种群大小 Ne，假设它们在种群之间是相等的。隔离模型中 FST 统计量的预期值为 (Wright 1931)：其中，漂移对常染色体基因座等位基因频率方差的影响在 t 代中简单地叠加。在其他所有条件相同的情况下，增加分裂时间会增加发生的漂移量，从而导致 FST 值增大（图 5.7D-F）。同样，增加种群规模会降低漂移的影响，从而减少一个或所有亚种群中降低 Ne 的 FST 过程（例如种群萎缩）将增加该亚种群中漂移的影响并导致种群分化增加。同样，漂移对非常染色体基因座的影响更大，导致这些基因座的分化增加（例如，Keinan 等人，2009 年）。如果我们假设隔离模型成立，则可以使用公式 5.15 来估计联合参数 t/2Ne。但是，同样，要使这种关系成立，必须满足许多假设。主要假设是种群之间没有交换移民。由于迁移使等位基因频率同质化，任何迁移都会降低 FST，导致低估 t/2Ne。该假设还要求种群分离是瞬间发生的，所有交换都在过去 t 代立即停止。这些假设有时可能是正确的，在这些情况下，可以估计隔离模型的参数（包括每个后代种群和祖先种群的单独种群突变参数 q）（例如，Wakeley 和 Hey 1997；Wang、Wakeley 和 Hey 1997；Leman 等人 2005）。但在许多情况下，隔离和迁移模型的主要假设都会被违反，或者我们无法先验地确定哪种模型更适合数据。这就是为什么最近的研究转向包含两个过程的模型，即隔离与迁移模型。区分迁移和漂移：隔离-迁移模型分子群体遗传学中最具挑战性的任务之一是区分种群或物种间共享多态性的原因。由于迁移和最近的分裂事件都可能导致共享多态性（图 5.7A-F），因此迁移和隔离模型都可以解释广泛的分化值。因此，最近研究的目的是找到每个过程的不同特征，并设计一个统计框架，在这个框架内可以对迁移率、分裂时间或迁移和祖先多态性对分化水平的联合影响做出有力的推断。在这里，我描述了一些区分这些过程以及将它们整合到一个模型中的尝试。几种早期方法提出了旨在区分隔离和迁移模型的测试。 Wakeley (1996a) 表明，单个基因座上序列的成对差异的方差（公式 4.14）在迁移模型下比在隔离模型下更大，即使成对差异的预期值相同。也就是说，即使两个模型之间的 FST 预期值相同，p 的方差也会不同。如果存在不对称迁移，则在接受大量移民的种群中，p 的方差将更大。方差的预期差异假设基因座内没有重组和没有选择，这是两个非常重要的限制。由于迁移增加了交换基因的两个种群的 p 值和它们的总差异（相当于上面的 dXY），因此可以构建一个测试来区分隔离和迁移。在 Wakeley (1996b) 提出的检验中，隔离模型是零假设，因为与方差较大的零模型相比，方差较小的零模型具有更大的统计能力来拒绝它。当迁移率较低或自分化以来的时间较长时，该检验似乎具有最大的效力，即模型之间的方差差异最大。随着迁移率的增加或自分裂以来的时间减少，方差会收敛到单个随机交配种群的预期方差；在高迁移率/最近分裂情景中，这种效力的降低似乎在不同方法中普遍存在（见下文）。在另一个方法中，Wakeley 和 Hey (1997) 发现，可以计算隔离模型中预期的共享多态性数量、每个种群中的排他性多态性（即私有等位基因）以及两个种群之间的固定差异。这些汇总统计数据在比较迁移模型和隔离模型时很有用，因为单个非重组基因座可以具有共享多态性或固定差异，但不能同时具有两者（它们也可以两者都没有）。基因流将增加共享多态性的数量，同时减少种群 1 种群 2 的数量。图 5.8 两个种群的隔离与迁移模型。在最基本的模型中，有六个参数需要估计：三个种群突变参数）、两个迁移参数以及种群分裂以来的时间（t）。 IM、IMa 和 IMa2 程序按中性突变率缩放所有参数，这样估计的迁移参数为 m/µ，时间参数为 tµ。（根据 Hey 和 nielsen 2004。）固定差异和排他性多态性的数量。然后可以将这四个汇总统计数据用作针对模拟值（Wang、Wakeley 和 Hey 1997）或预期值（Kliman 等人 2000）应用测试的基础。在任一测试中拒绝零模型意味着纯隔离模型可以被丢弃作为数据的可行解释，因为这些汇总统计数据中的基因座之间存在太多差异。所有这些测试都需要来自两个种群中的每一个的适度数量（>10）的相位单倍型。刚刚描述的两种方法测试了替代迁移模型人口分裂

但不估计任何人口参数。

在涉及两个种群的隔离与迁移模型中，有六个基本参数（图 5.8）：两个后代种群和单个祖先种群的 q 值、分歧以来的时间以及双向迁移率（有时会合并为单个迁移参数）。为了估计具有大量参数的模型，贝叶斯方法通常使用合并谱系的 MCMC 抽样

来得出最可能的参数值（参见第 9 章）。使用 MCMC 估计隔离-迁移模型参数的第一种方法只能使用来自单个基因座的相位序列数据（Nielsen 和 Wakeley 2001），但随后的改进允许研究多个基因座和两个以上的后代种群（在程序 IM [Hey 和 Nielsen 2004]、IMa [Hey 和 Nielsen 2007] 和 IMa2 [Hey 2010] 中实现）。使用 MCMC 抽样的分析为每个参数的值提供了后验概率的分布。虽然该分布的峰值通常被视为参数的估计值，但曲线的形状可用于衡量对估计的支持并对比替代模型。具体而言，在试图区分隔离和迁移模型时，“[迁移参数] 峰值和迁移率为零时的概率之间的差异可用于对零基因流零假设进行似然比检验”（Pinho 和 Hey 2010，第 223 页）。一个显著的结果表明需要一定量的迁移才能更好地解释数据并拒绝纯隔离模型。使用 IM 程序及其后继程序推断隔离与迁移模型中的参数提供了一种推断近期进化过程的强大方法，但这些方法并非没有问题。大多数困难来自方法所做的假设，这些假设经常会被违反并在许多情况下影响所做的推断（Becquet 和 Przeworski 2009；Strasburg 和 Rieseberg 2010）。主要假设包括所有基因座的选择性中性（即没有正向或平衡选择）、种群结构：基因内无重组、采样后代种群或祖先种群内无进一步的种群结构、基因间独立、符合所选突变模型、无从未采样种群迁移。Strasburg 和 Rieseberg (2010) 发现 IM 软件包“相对稳健”，可以缓和任何违反上述假设的情况，尽管特定的违反情况确实会导致误导性推论。最常被违反的假设之一是没有基因内重组，其结果是增加每个后代种群的 q 估计值并增加它们之间估计的分化时间。为了解决这一限制，Hey 和 Nielsen (2004) 建议仅保留采样序列的非重组部分进行分析，尽管这种方法可能会产生其他偏差。违反 IM 假设的情况也很常见，这可能导致祖先 q 的估计值过大，包括祖先群体中未说明的结构（Becquet 和 Przeworski 2009）。最后一个警告是，这些方法似乎高估了最近分裂的迁移率（例如，Naduvilezhath、Rose 和 Metzler 2011；Hey、Chung 和 Sethuraman 2015）。隔离与迁移模型的另一个用途是尝试估计迁移时间（例如，Won 和 Hey 2004）。尤其是在考虑物种间最近的分裂时，区分具有基因流动的初级物种形成模型和分化后的二次接触模型是非常有意义的。估计迁移事件的时间应该可以让研究人员知道在给定数据的情况下哪种模型更有可能。然而，模拟（Strasburg 和 Rieseberg 2011）和理论（Sousa、Grelaud 和 Hey 2011）都表明，在这个模型中无法推断出任何迁移事件的确切时间。IM 方法使用的数据中似乎没有足够的信号来自信地确定单个迁移事件发生的时间，尽管可以对比先验定义具有不同迁移率的时代的模型（Sousa、Grelaud 和 Hey 2011）。还使用了其他方法来估计隔离-迁移模型中的参数，每种方法都有自己的局限性。几种方法使用与 IM 和相关程序相同的基本方法，但只需要非常少量的个体和非常大量的定相（Wang 和 Hey 2010）或非定相基因座（Gronau 等人 2011）。使用数据摘要的类似方法允许基因座内重组，并且可以可以采用贝叶斯方法（Becquet 和 Przeworski 2007）或“近似”贝叶斯方法（见第 9 章）。一种完全不同的方法使用多群体等位基因频谱（即所有后代群体的联合位点频谱）作为输入数据，从中推断参数（Wakeley 和 Hey 1997）。使用这种数据表示的方法可以使用数百或数千个个体和数千个标记的数据，假设多态性是独立的（有关详细信息，请参阅第 9 章）。应该强调的是，虽然这些较新的基于模型的方法被用于区分漂移和迁移作为种群分化的原因，但大多数情况下它们尚未经过广泛测试。大量研究详细阐述了违反 IM 及其后续程序假设的后果（例如 Becquet 和 Przeworski 2009；Hey 2010；Strasburg 和 Rieseberg 2010），但缺乏对新方法的此类研究并不意味着它们更准确——只是它们尚未经过测试。即使使用最现实的理论模型和最先进的计算工具，也很难将祖先多态性与迁移区分开来。这种困难部分是由于每个模型中必须做出的假设仍然不切实际，部分是由于当仅使用部分可用遗传数据时，所有进化过程都会产生非常相似的模式。未来此类方法可能需要使用改进的模型和新类型（或更大量）的数据。检测种群对之间迁移的其他方法

在第 9 章中，我们将讨论一些推断迁移的其他方法和理解迁移产生的模式的新模型。但在继续本章之前，我想介绍几种方法，这些方法可以在没有明确表达单个统计数据的预期值的情况下，预测基因流存在下的变化模式。这些方法使用模拟来生成跨基因座的预期值，因此对模拟中使用的参数的准确性相对敏感。例如，考虑一种情况，我们使用简单的汇总统计数据（例如 FST）来评估两个种群之间是否发生了迁移。如果真实数据来自两个最近分裂的种群，则假设古老的种群分裂而生成的模拟数据集可能会导致错误的迁移推断。此类误差是由于观察到的统计值远低于模拟值而导致的，对此类观察的简单解释是发生了迁移。然而，在实践中，大多数误差的方向相反，这使得检测迁移变得更加困难。其原因是发散时间是根据与迁移相同的数据估算的，从而导致测试中的循环性：如果发生迁移，则考虑到实际分裂时间，我们样本之间的序列发散将低于预期。因此，没有迁移的模拟数据将与观察到的具有迁移和较早分裂的数据紧密匹配，从而导致对迁移的保守测试。尝试通过模拟解决这些问题的一种方法是尝试检测显示出种群间迁移迹象的单个基因座，即使基因组中的基因渗入很少见。在这种情况下，希望模拟能够反映大多数基因组的非迁移历史，从而更容易检测到具有迁移信号的异常基因座。如果发现异常值，则这是发生迁移的初步证据。这种推断模式可以再次使用，尽管两者都存在正确解释异常基因座的困难。如上所述，FST 会受到选择的强烈影响，因此经历平衡选择的基因座的值似乎比中性进化区域（或受搭便车影响的区域）低得多。这种模式可能会被误认为是已渗入的基因座。使用具有极低中性突变率的 dXY 将具有非常低的发散水平，这再次增加了它们与渗入基因座混淆的可能性。此外，FST 均对低频迁移等位基因的存在不敏感（Geneva 等人，2015 年）。这意味着仅使用这些统计数据进行分析可能无法检测到最近的基因渗入（例如，Murray 和 Hare，2006 年）。为了检测甚至罕见的基因渗入谱系，Joly、McLenachan 和 Lockhart（2009 年）建议使用来自两个种群或物种的任何一对单倍型之间的最小序列距离。定义 kij（公式 5.12），最小序列距离 dmin，mini∈X

是两个种群 X 和 Y 中所有单倍型配对之间的最小距离（图 5.9）。该方法背后的逻辑是，任何两个彼此高度相似的序列（因此代表比种群分化时间更近的祖先）只能通过基因渗入来解释。通过将观察到的 dmin

与无迁移模型下的预期值进行比较，我们可以获得基因渗入的积极证据。

当满足其假设时，该方法具有很高的功效（Joly、McLenachan 和 Lockhart 2009），但与 dXY

一样，它假设基因座之间的突变率没有变化。

已经提出了多种解决方案来解释突变率变化，特别是在使用 dXY

时出现同样的问题。解决这个问题的一种方法是明确地在模拟中包含突变率的变化，但这些突变率很少为人所知。一种不需要估计每个基因座突变率的替代方法是使用两个分类单元与一个种群 X 相比的相对节点深度 (RND) 来解释这种变化。图 5.9 用于检测迁移的其他序列统计数据。图中显示了两个交换了移民谱系的种群的代表性谱系。虚线表示与看不见的外群 (dout) 的差异。两个种群中所有序列之间的平均距离 dXY 仅在一定程度上受到迁移事件的影响。然而，两个种群中序列之间的最小距离 dmin 比无迁移情景下的预期要低得多。（基于 Rosenzweig 等人，2016 年）

种群 Y

外群（Feder 等人，2005 年）。RND 定义为两个种群之间的 dXY

除以每个种群与外群的平均距离：

其中 dout

是种群 X 与外群 O 之间的平均距离；dYO

是种群 Y

与外群之间的平均距离（图 5.9）。低突变率反映在 X 和 Y 之间以及每个种群与外群之间的分支长度缩短。因此，只要突变率在整个树中保持不变，RND 对低突变率就具有鲁棒性。事实上，当基因流广泛存在时，该统计数据最常用于查找未渗入的区域（例如，Nachman 和 Payseur 2012；Carneiro 等人 2014），这些区域将表现为 RND 值特别高的区域。在寻找渗入基因位点时，RND 原则上可以解决突变率变化的问题，但对低频移民仍然不敏感。最近引入了两种方法，它们对最近的迁移敏感，同时仍然对突变率的变化具有鲁棒性。Geneva 等人（2015）引入了一个统计数据 Gmin，定义为（见图 5.9）：由于较低的突变率预计会对基因位点的所有谱系产生同等影响，因此通过两个种群中所有序列之间的平均距离进行标准化将解释基因位点之间不同的进化率。虽然 Gmin

有能力检测低频率的移民，但当移民等位基因的频率较高时，它就会失去能力。这可能是因为

随着移民谱系的频率上升，dXY

会降低。当移民等位基因

接近固定时，dmin

的比率会向 1 移动，接近

没有移民时的预期值。

一个对低频率和高频率移民都敏感的统计数据——

同时仍然对突变率变化具有鲁棒性——结合了 dmin

和 RND 的最佳方面。Rosenzweig 等人 (2016) 将他们的统计数据

定义为（见图 5.9）：

低突变率反映在缩短的外群分支长度中，

（如 RND）对可变突变率具有鲁棒性。同样，像两者一样，

对甚至罕见的移民单倍型也很敏感。该统计数据的主要优势在于，即使移民频率很高，它仍然很有效（Rosenzweig 等人，2016 年）。与上述论点类似的论点也可用于查找与单个种群中所有其他单倍型距离比预期更远的单个单倍型，因为这些单倍型可以代表最近渗入的序列（例如，Brandvain 等人，2014 年）。

除了刚刚描述的“最小距离”方法外，我们还可以考虑最近渗入对种群结构连锁不平衡模式留下的不同信号。Machado 等人（2002 年）指出，在隔离和迁移模型下，共享多态性之间的 LD 模式预计会有所不同（图 5.10）。在隔离模型中，共享多态性被认为存在于祖先群体中，因此被认为经历了多轮重组，并且预计彼此之间不会存在强烈的 LD，也不会在每个后代群体中都具有排他性的多态性。相反，在迁徙中n 模型中，共享多态性被认为是从一个种群向另一个种群渗入的结果，因此预计它们彼此之间存在强烈的 LD，至少在接收移民的种群中是如此。此外，该模型还提供了有关 LD 符号的具体预测：随着迁移，两个渗入在一起的共享多态性的派生等位基因将呈正相关，而一个共享多态性和一个排他性多态性的派生等位基因将呈负相关（图 5.10）。在隔离模型下，LD 符号没有特定的方向性。 Machado 及其同事 (2002) 提出了一种统计方法，该方法取两个平均 LD 测量值之间的差异——第一个是所有共享多态性对之间的差异，第二个是所有一个是共享多态性而另一个是排他多态性的位点对之间的差异——并使用隔离模型下推断的种群历史的模拟生成 P 值。与此处描述的许多其他方法一样，当迁移是近期发生时，该方法最有能力检测出与隔离模型的显著偏差祖先种群 1 P 图 5.10 迁移对重组位点内连锁不平衡模式的影响。每行字母代表一个单倍型，祖先种群在所有四个位点上都是单态的。分离后，种群 1 发生 A→a 和 B→b 突变，种群 2 发生 C→c 和 D→d 突变。

迁移事件将单倍型 ABcd 引入种群 1。

根据祖先和派生状态定义 lD 的符号，这种基因渗入的结果是种群 1 中具有共享多态性的位点（C/c 和 D/d）之间的 lD 为正，而这些共享多态性与种群 1 独有的多态性（A/a 和 B/b）之间的 lD 为负。（根据

Machado 等人，2002 年）

种群 2

（因为基因渗入区域的 LD 尚未分解）和

当种群分裂更早的时候（因为在分裂之前实际上一直存在的共享多态性之间的“背景”LD 会更少）。该测试的结果也完全取决于模拟的特定隔离场景，因此使用不切实际的参数进行模拟可能会导致拒绝零模型，即使没有迁移。

尽管 Machado 等人(2002) 研究了多个种群中采样的单个基因座中包含的 LD 模式，类似的想法已用于仅使用来自单个种群的 LD 数据检测古代基因渗入（Wall 2000b；Plagnol 和 Wall 2006）以及使用全基因组数据集检测密切相关种群之间的所谓迁移区（或混合块）（例如，Falush、Stephens 和 Pritchard 2003）。此类区域的长度可用于估计推断的迁移事件或迁移率变化的时间（例如，Koopman 等人 2007；Pool 和 Nielsen 2009；Moorjani 等人 2011），或作为种群间迁移和隔离模型的明确测试（Loh 等人 2013）。 LD 模式和由于多个种群之间迁移而产生的每个基因组的比例在首先定义种群以及在分配每个个体在种群中的成员资格方面非常有用。在下一节中，我将讨论这些基本问题并提出解决方案。

定义种群

识别种群及其中的个体

到目前为止讨论的所有分析都假设我们对我们感兴趣的物种的种群结构有所了解。具体来说，我们假设我们知道有多少个种群，并且可以将样本分配给这些种群。如果不这样做，我们就无法测量种群之间等位基因频率的差异，也无法询问是否有证据表明存在显著的种群结构、迁移等。这些问题都要求我们首先识别种群并将我们的样本分配给这些种群。然而，在许多情况下，这些分配可能事先并不知道，或者可能仅根据样本采集的地理位置推断出来。此外，可能存在隐秘的种群结构，掩盖了从同一地点采集的样本实际上属于不同种群的事实。在这两种情况下，我们都可以使用统计工具来帮助我们对物种内亚种群的组成进行概率推断。必须对提前知道种群的情况和不知道种群的情况进行重要区分。在前者中，要解决的问题是将个体分配到种群中——因此使用的方法称为分配测试。所有这些方法（例如，Paetkau 等人，1995 年；Rannala and Mountain 1997；

Cornuet 等人 1999）要求分配个体的多位点基因型，以及每个可能的源种群的种群等位基因频率；他们还假设每个基因座的 HWE 和基因座之间的连锁平衡。然后，将个体最佳地分配到源种群是基于个体的基因型与每个种群中的等位基因频率之间的匹配，并且可能伴随着分配中的不确定性测量。分配的准确性在很大程度上取决于种群间等位基因频率差异的大小、种群等位基因频率估计的准确性以及正确源种群的纳入（Cornuet 等人 1999）。

尤其是当源种群等位基因频率的估计是基于少数个体时，考虑到小样本量，在分配中具有一定的不确定性度量非常重要。由于基因型和种群等位基因频率不匹配，种群也可能被排除在个体的可能来源之外。如果正确的源种群无意中被排除在研究之外，则所有抽样种群的高排除概率（或低分配概率）可能表明其缺失。在未预先定义种群的情况下，我们必须使用替代工具同时将个体分配到种群中，并估计种群数量及其在每个基因座的等位基因频率。此外，我们样本中的一些个体可能有混合血统——也就是说，他们可能有来自多个种群的遗传贡献。我们将这样的个体称为混合个体。我们希望识别这些个体，并估计每个源种群对其血统的贡献比例。

幸运的是，有多种方法可以执行所有这些计算，甚至更多。尽管每种方法在细节上有所不同，但许多方法都使用相同的基本原理：即最小化哈代-温伯格不平衡和连锁不平衡。下面我将描述程序结构（Pritchard、Stephens 和 Donnelly 2000）使用的基本方法，这是在不知道种群数量或每个个体在这些种群中的成员身份的情况下推断种群结构存在的最广泛使用的方法。

使用 Wahlund 效应识别种群结构

我们已经看到了 Wahlund 效应如何解释哈代-温伯格不平衡的情况，即当来自多个亚种群的个体被错误地认为来自同一种群时。按照类似的逻辑，将个体错误地分配到亚种群也会导致它们通过引入不太可能的基因型而处于哈代-温伯格不平衡状态。

因此，找到个体与种群的最佳分配（或找到最可能的种群数量）的一种方法是尝试最小化哈代-温伯格不平衡量。大多数软件包通过尝试大量不同的个体与种群分配来实现这一点，通常使用 MCMC 方法。最佳分配是导致每个种群中哈代-温伯格不平衡量最少的配置。因此，这些方法都假设每个种群中都存在哈代-温伯格平衡，唯一的例外是允许近亲繁殖的情况（例如，Gao、Williamson 和 Bustamante 2007）。还有第二种由个体与种群错误分配产生的不平衡：连锁不平衡。要了解为什么会这样，请考虑两个在两个基因座上固定了替代等位基因的种群（图 5.11）。种群 1 只有 AB 个个体，而种群 2 只有 ab 个个体。在每个种群中都没有 LD，但被视为单个种群时，两组等位基因之间存在完美关联（即完美 LD）。Wahlund（1928）实际上是第一个指出这个问题的人，但后来被多个其他团体重新发现（Cavalli-Sforza 和 Bodmer 1971；Sinnock 和 Sing 1972；Nei 和 Li 1973；Prout 1973）。这种效应有时被称为多位点 Wahlund 效应（Feldman 和 Christiansen 1974）或混合 LD（Falush、Stephens 和 Pritchard 2003）。种群之间固定的差异并非产生这种效应的必要条件：如果个体被错误地归类到种群中，任何等位基因频率的差异都可能产生 LD。事实上，产生的不平衡程度与种群之间等位基因频率的差异成正比。考虑两个基因座，每个基因座都有两个等位基因：A/a 和 B/b。如果我们将种群 1 中 A 等位基因的频率表示为 p1A，将种群 2 中 B 等位基因的频率表示为 p1B，将种群 2 中 B 等位基因的频率表示为，那么LD 量由以下公式给出：

D y y p p p p

其中 y 表示来自种群 1 的个体占总样本的比例，1-y 表示来自种群 2 的比例。可以很容易地看出，这种抽样形式即使在不同染色体上的基因座之间也会产生连锁不平衡。与单基因座不平衡一样，个体到种群的最佳分配将是

图 5.11 通过对多个种群进行抽样来产生连锁不平衡。两个种群（黄色椭圆内）被视为单个种群（白色椭圆）。种群 1 固定为 AB 单倍型，而种群 2 固定为 ab 单倍型。这两个基因座在种群 1 和 2 中都处于连锁平衡状态，但当将其视为单个种群时，它们之间存在完美的连锁不平衡。

种群 1

种群 2

种群结构

最小化位点之间的连锁不平衡。实际上，最小化这两种不平衡在计算上都很有挑战性，尤其是当人们还试图找到最可能的种群数量以及每个种群对每个个体祖先的可能贡献时。但诸如structure之类的软件包可以完成这些任务，以及识别单个基因座的祖先。

从种群结构的确定中进行进化推断

这里描述的方法的最重要用途之一是找到样本中包含的“最佳”种群数量。由于 Hardy-Weinberg 不平衡和连锁不平衡都会随着种群数量（表示为 K）的增加而进一步最小化，因此数据的可能性也会随着 K 的增大而增大。与许多统计问题一样，我们希望避免过度拟合具有大量参数的模型，而是选择足以解释数据的最小参数数量（参见 Burnham 和 Anderson 2002）。虽然有许多不同的方法可以推断 K 的最佳值（如下所述），但也应该记住，种群可以是主观实体，并且种群的确切划分可能会根据所提出的问题而改变（Waples 和 Gaggiotti 2006）。事实上，当人口结构是分层结构时，数据集的全局“最佳”K 可能对某些问题有用，而对个别人口的进一步细分可能对其他问题有用（例如，Rosenberg 等人，2002 年）。

对于几乎完全由混合个体组成的人口（例如，非裔美国人），甚至不清楚 K 的值应该代表什么：源人口的数量还是当前的单一人口？

在一个类似的模拟示例中，Pritchard、Stephens 和 Donnelly（2000 年）推断单个混合种群的 K = 2。作为选择单个最佳 K 值的替代方案，还可以对多个 K 值进行下游分析，并报告每个值的结果。图 5.12 显示了 Rosenberg 等人（2002 年）分析的全球人类样本增加 K 的结果。有两种主要方法可以推断最佳种群数量。第一种方法是使用结构等程序的输出对每个 K 值下数据集的可能性进行事后分析（有关此方法的注意事项，请参阅 Janes 等人 2017 年）。由于结构会计算固定 K 值下个体的最佳分配，因此必须使用 K = 1、2、3 . . . n 进行独立运行，直到达到某个最大种群数量 n。然后可以根据数据可能性随 K 增加而增加的速率（Evanno、Regnaut 和 Goudet 2005）或更严格的统计模型选择方法（例如 Gao、Bryc 和 Bustamante 2011）推断出 K 的最佳值。在第二种方法中，种群数量是在分配过程中同时估计的。软件可以

为单次运行中考虑的种群数量指定上限，使用 MCMC 过程拆分或合并这些种群

（例如，Corander、Waldmann 和 Sillanpaa 2003；Corander 等人 2004），或者它

班图（肯尼亚）

姆布提俾格米人

巴科拉俾格米人

推断种群数量和身份的一个重要问题是抽样的影响。与具有预定义种群的分配测试一样，种群识别的准确性取决于所包括的个体数量、使用的基因座数量以及种群之间的等位基因频率差异（Pritchard、Stephens 和 Donnelly 2000；Rosenberg 等人 2005）。此外，种群识别可能受到个体内混合量和数据集中混合个体的比例（Pritchard、Stephens 和 Donnelly 2000）以及从每个“纯”种群中抽取的个体数量（Fogelqvist 等人 2010）的强烈影响。甚至对于一个低样本的有限范围

在另一种方法中，主成分分析 (PCA) 可用于查找样本中的隐藏结构（参见第 9 章）。虽然 PCA 方法与迄今为止描述的混合模型确实存在潜在关系（Engelhardt 和 Stephens 2010；Lawson 等人 2012），但它们不会将个体分配到种群中。然而，Patterson、Price 和 Reich (2006) 表明，PCA 研究中的重要特征值的数量等于 K − 1。因此，PCA 可用于独立（并且更快速地）计算数据集中的最佳种群数量。可以将 K 视为给定某些先验分布的随机变量（Dawson 和 Belkhir 2001；Huelsenbeck 和 Andolfatto 2007）。一些方法还可以使用个体的空间采样位置来提供种群数量和个体分配到种群的先验信息（Guillot 等人，2005 年；François、Ancelet 和 Guillot，2006 年；Hubisz 等人，2009 年）。

图 5.12 人类种群结构。每个个体都用一条细垂直线表示，该线代表 K 个种群中每个种群的混合比例。黑线将不同预定义种群（在底部命名）中的个体分开，上面给出了种群的大陆位置。每行有 K 种颜色用于区分每个个体的混合比例。

（摘自 Rosenberg 等人，2002 年）

巴勒斯坦

汉族（中国北方）

美拉尼西亚

中东

中东

中东

中亚/南亚

中亚/南亚

中亚/南亚

中亚/南亚

中亚/南亚

中亚/南亚

中亚/南亚

中亚/南亚

人口结构

值，即使没有结构，也可能识别出重要的结构（Orozco-terWengel、Corander 和 Schlötterer，2011 年）。

一旦做出了最佳的种群选择并将个体分配到种群中，进一步的分析就可以识别出移民或混合个体。最近的移民将具有统计上显着的分配到源种群，这些分配与其采样位置重叠的种群不匹配（Rannala 和 Mountain，1997 年）。大多数此类方法只能识别移民或估计最近几代的移民率（例如 Wilson 和 Rannala 2003），因为重复的回交会抹去原始源种群的遗传信号。然而，许多被确定为最近移民的个体可能被错误标记或被污染的样本（Rosenberg 等人 2002）。结构报告的混合比例——以及类似方法，如 FRAPPE（Tang 等人 2005）和 ADMIXTURE（Alexander、Novembre 和 Lange 2009）——揭示了单个样本的祖先。识别混合个体对许多应用都很重要，可以作为关联研究中人口分层混杂效应的校正（例如，Hoggart 等人，2003 年；Price 等人，2006 年），帮助确定濒危种群的状况（例如，Beaumont 等人，2001 年），并为混合区研究提供关键信息（例如，Nielsen 等人，2003 年）。它不仅可以估计每个个体的单个基因组范围的混合比例，还可以估计单个基因座的祖先（分别称为全球和本地祖先；Alexander、Novembre 和 Lange，2009 年）。任何个体的基因组都可以被分成单独的染色体“块”或单倍型，每个块都有自己的祖先起源、物理长度和种群频率。尽管结构的原始版本需要不相连的标记，因此“混合”LD 是唯一的不平衡来源（见上文），但较新的版本可以考虑由连锁标记块的渗入（混合 LD）产生的 LD 以及 LD 的背景水平（Falush、Stephens 和 Pritchard 2003；另见 Patterson 等人 2004；Tang 等人 2006；Sankararaman 等人 2008）。如本章前面所述，识别这些混合块可用于推断迁移过程的特征（例如，Koopman 等人，2007 年；Pool 和 Nielsen，2009 年；Loh 等人，2013 年），以及校正关联研究中的分层（例如，Hoggart 等人，2004 年），甚至推断重组率（Wegmann 等人，2011 年）。进一步使用单倍型特异性祖先，使用 fineSTRUCTURE 程序中实现的方法（Lawson 等人，2012 年），可以揭示使用未链接标记无法显示的精细尺度种群结构。最后，必须对种群结构和混合的推断提出一个非常重要的警告。尽管在结构和 ADMIXTURE 等程序中，祖先分配被称为混合比例（我在这里也使用过这个术语），但它们实际上并没有表明是否发生了混合，因此可能具有误导性gly 命名。考虑这样一种情况，即有一个包含大量祖先多态性的单一大型种群，再加上几个较小的种群，这些种群已经从较大的种群中分离出来，并且每个种群都经历了瓶颈。在许多情况下，较小的种群将被软件识别为单独的种群，而单个较大的种群则表示为来自所有其他种群的祖先的混合。在这种情况下，混合比例不应被视为任何混合历史的证据；相反，它们应该被理解为仅仅表明与许多较小种群共享祖先的分配。因此，结构图（和类似的图）本身不能用于推断混合的历史（有关更多讨论，请参阅第 9 章）。聚结 6

模拟 DNA 序列样本

为了准确推断影响分子变异的进化力量，我们必须能够准确模拟 DNA 序列。理想情况下，我们希望能够在各种模型、不同的人口历史、选择形式和强度以及任何其他感兴趣的参数下模拟种群。

此类模拟的结果应该是 DNA 序列样本，相当于我们从自然种群中收集的样本。

这个过程重复了数千次，然后可以用来找到最适合我们观察到的数据的模型，或者作为零分布，我们可以用它来测试特定的假设。

我们如何模拟这样的种群？最直接的方法是，从大量二倍体个体（相当于我们想要模拟的种群规模）开始，这些个体根据我们选择的种群模型进化。我们将对适当长度的序列（可能等于我们希望与模拟进行比较的 DNA 序列的长度）应用突变和重组，同时进行交配和任何可能的自然选择。然后，该系统必须运行多代，至少直到种群达到平衡，最后需要从种群中抽取少量染色体以创建一个模拟数据集。为了生成数千个独立模拟的样本，这个过程必须运行数千次。这个过程通常被称为正向模拟，因为它从最初相同的种群开始向前进行。从上面的描述中可以明显看出，这种方法非常低效：我们只想知道样本的属性，但我们正在跟踪整个种群。为了解决这种低效率问题，几位数学遗传学家独立提出了后来被称为合并过程的方法（Kingman 1982a、1982b、1982c；Hudson 1983a；Tajima 1983）。合并过程的核心是，我们可以根据生成谱系间关系集（系谱）的简单规则来生成 DNA 序列样本。这些规则使我们能够生成具有几乎任何人口历史的样本，而无需模拟整个种群。由于该过程从现在开始并向后运行，因此被称为向后模拟。如今，有许多软件包可用于执行合并模拟（表 6.1）。由于合并过程仅考虑样本而不是整个种群，因此它可以成为生成大量模拟数据集的一种非常有效的方法，但它也存在自身的局限性，无论是生物学还是计算上的。从生物学上讲，合并是模型的模型：也就是说，它是 Wright-Fisher 或 Moran 种群（尽管非常好）的近似值，而 Wright-Fisher 或 Moran 种群本身是自然种群的近似值。合并的一个关键假设是样本大小 n 比有效种群大小 Ne 小得多。违反这一假设可能会导致对种群过程的误导性推断（例如，Wakeley 和 Takahashi

■ 表 6.1 用于模拟 DNA 序列种群样本的程序

程序来源

COALESCENT（“后向”）模拟软件

ms Hudson 1990；Hudson 2002

GENOME Liang 等人 2007

SIMCOAL/SIMCOAL 2.0 Excoffier 等人 2000；Laval 和 Excoffier 2004

CoaSim Mailund 等人 2005

Recodon Arenas 和 Posada 2007

discoal Kern 和 Schrider 2016

msprime Kelleher 等人 2016

WRIGHT-FISHER（“前向”）模拟软件：

EASYPOP 巴卢克斯 2001

simuPop 彭和金梅尔 2005

尼莫纪尧姆和鲁日蒙 2006

弗雷杰尼·霍加特等人。 2007年；查多-海姆等人。 2008年

ForSim 兰伯特等人。 2008年

FORWSIM Padhukasahasram 等人。 2008年

GENOMEPOP 卡瓦哈尔-罗德里格斯 2008

SFS_CODE 埃尔南德斯 2008

FFPOPSim 扎尼尼和内尔 2012

fwdpp 桑顿 2014

SLiM/SLiM 2 梅塞尔 2013；Haller 和 Messer 2017

ARGON Palamara 2016

近似合并（“侧向”）模拟软件

FastCoal McVean 和 Cardin 2005；Marjoram 和 Wall

MaCS Chen 等人 2009

fastsimcoal/fastsimcoal2（Excoffier 和 Foll 2011；Excoffier 等人 2013）

合并

2003）。虽然可以修改标准合并以更精确地匹配 Wright-Fisher 模型并放宽 n << Ne 假设，但这种修改会导致算法速度下降（Fu 2006）。更重要的是，从生物学角度来看，合并只会在没有自然选择的种群中生成一小部分随机染色体样本。

它不是对整个种群的模拟，因此无法提供除样本属性之外的任何结果。尽管模拟具有选择的合并方法一直在改进（例如，Spencer 和 Coop 2004；Teshima 和 Innan 2009；Ewing 和 Hermisson 2010；Kern 和 Schrider 2016），但可以建模的选择形式仍然有限。从计算角度来看，当计算机处理器速度和内存资源有限时，合并提供的优势更为重要，而这已越来越不成问题。技术发展使得合并的效率变得不那么重要，除非在使用贝叶斯抽样方法的应用中（参见第 9 章）。然而，最重要的是，当模拟基因组的非常大的区域或具有非常高重组率的区域时，合并可能变得非常低效，以至于无法使用它来建模当前正在收集的数据集。解决此问题的一种方法是发明近似合并方法，该方法基于在沿着一段 DNA 移动时生成相关谱系，而不是为整个区域生成一个大谱系（Wiuf 和 Hein 1999）；因此它们是横向模拟。这些方法更正式地称为顺序马尔可夫合并 (SMC) 模型（McVean 和 Cardin 2005；Marjoram 和 Wall 2006），并且有多个程序可以执行它们（表 6.1）。

SMC 模型已经变得非常有用，但它们与自然种群的距离甚至更大：它们是模型的模型的模型！

将来，正向模拟可能会成为此类方法中最广泛使用的方法。越来越多的快速灵活的正向模拟器可以在许多不同的自然选择形式和许多不同的人口历史下对非常大的基因组区域进行建模（表 6.1）。计算技术的进步使这些方法更加可行，而 DNA 测序技术的进步可能使它们成为必需。虽然到目前为止，我只介绍了合并算法作为生成样本的算法，但这种方法有许多重要用途（请参阅 Hein、Schierup 和 Wiuf 2005 和 Wakeley 2009 以获得良好的概述）。合并算法为我们提供了一种概率建模谱系的方法，因此为分子群体遗传学中的各种结果提供了预期。这些预期中的许多都用在了本书的后面章节中。联合体还为我们提供了一个从谱系角度思考的框架，因此可以让我们深入了解我们采样的 DNA 序列之间的潜在关系。这个框架对于直观地了解群体遗传过程非常有帮助，因此在本章的其余部分，我将讨论中性联合体谱系的基础知识，并解释联合体的一些最重要的方面。在后面的章节中，我们将研究自然选择和非平衡人口历史对某个基因座谱系的影响。

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[[Category:遗传学]]

第一章进化的模型

2025-08-26T09:09:48Z

Magezeya：

进化始于一个个体的一条染色体上的一个突变。分子群体遗传学就是研究此类突变在群体中频率的上升和下降。各种进化力量可以加速或阻碍突变在群体中的传播，这些力量的作用可以从个体间分子变异的模式中推断出来。

尽管遗传标记的使用可以追溯到 1900 年 ABO 血型的发现，但真正的“分子”群体遗传学的开端可以追溯到 Harris (1966) 和 Lewontin 和 Hubby (1966) 的开创性研究。这些研究人员表明，在分子水平上，个体之间的变异比之前形态学表型研究的预期要大得多。然而，这些研究使用等位酶allozymes（“等位基因”和“酶”的混合词；Prakash、Lewontin 和 Hubby 1969）来发现分子变异，因此仍然只观察到所有变异的一小部分——这些突变导致蛋白质由于电荷变化而以不同的速度穿过凝胶。直到 1983 年，才出现了第一批核苷酸水平的分子变异研究（Aquadro 和 Greenberg 1983；Kreitman 1983）。通过对每个核苷酸进行测序，这些研究使我们能够充分观察自然种群中分离的遗传变异。

分子群体遗传学研究提出了关于进化过程对自然种群的影响的广泛问题。为了做到这一点，他们通常使用一小部分个体的 DNA 序列来了解作用于整个种群的力量。即使是从单个基因座获得的遗传变异模式也可用于推断突变、重组和自然选择的力量，以及人口统计历史的细节——例如，其相对规模或迁徙历史。之所以能够做出这些推论，是因为在过去的 100 年里，大量的人口遗传学理论已经发展起来，这些理论告诉我们当这些力量中的每一个起作用时，我们应该观察到什么。早期的人口遗传学理论研究并没有考虑到分子数据，但分子方法的兴起激发了越来越多的工作，这些工作明确关注对分子进化过程的建模。

分子群体遗传学理论对于从 DNA 序列数据进行推断至关重要，因此至少有必要在这里回顾一下主要的模型及其假设。本章提供的简介并非旨在介绍种群遗传学的基础知识，并假设读者熟悉许多基本概念。相反，本章试图提炼出与分子种群遗传数据最相关的理论和模型。这些模型是用于从序列数据进行推断的模型，因此了解它们的结构是理解这些推断如何进行的关键。此外，本章试图澄清该领域中常用术语的使用方式，并定义它们在整本书中的使用方式。最后讨论了分子进化的中性理论，试图解释该理论的含义及其一些常见的误解。

== 基本序列术语 ==
[[文件:MPG1.1.png|缩略图|235x235像素|图 1.1 四个序列的比对。在本例中，样本大小为 n = 4，每个序列的长度为 L = 15。总共有六个位点在序列之间存在核苷酸差异（在位置 2、5、8、11、13 和 15）,因此S=6.]]
分子种群遗传研究中收集的 DNA 序列数据将类似于图 1.1 中所示的比对。该比对显示了四个 DNA 序列，每个序列有 15 个核苷酸，来自染色体上的同一'''基因座locus（位置）'''。我将把这四条同源 DNA 链称为'''序列sequences或染色体chromosomes'''，因为数据来自四条独特的同源染色体，无论序列本身是否独特。该术语将在整本书中使用，但应该注意的是，'''文献中有许多术语用于这四个 DNA 序列，包括基因、等位基因、样本、顺反子和等位基因拷贝'''。使用基因一词来表示在单个基因座采样的多个序列并不像 20 年前那么常见，特别是现在个别研究人员定期从物种内的多个基因收集多个序列。但许多研究仍然使用等位基因一词来指代每个采样染色体，实际上使用了等位基因的“起源不同”定义（Gillespie 2004，第 6-8 页）。我将仅使用等位基因一词来指代单个核苷酸（或氨基酸），当它们在比对中的单个位置上有所不同时，例如 A 或 C 等位基因。这种用法被称为等位基因的“状态不同”定义。所以我们可以说图 1.1 中的比对中有 n = 4 条染色体。请注意，这个术语不t 取决于这四个序列是来自两个随机二倍体个体、四个单倍体个体还是四个独立的近交（同源）二倍体系。在所有情况下，我们仍然从自然界中取样了四条染色体。

在比对中，我们可以看到序列在几个位置上存在差异，一个核苷酸或另一个核苷酸存在于不同的个体染色体中。我们'''将主要关注双等位基因位点biallelic sites'''，因为它们是观察到的最常见的变异类型，尽管任何位置都可以有两个以上的等位基因。有许多不同的术语用于描述这些 DNA 差异：我们可以说我们的样本中有六个多态性polymorphisms或分离segregating位点sites或突变mutations或单核苷酸多态性 (SNP)（在位置 2、5、8、11、13 和 15）。多态性和分离位点这两个术语在历史上一直是最常用的术语，尽管 SNP（发音为'''“snip”'''）最近变得更加常见。（最早使用 SNP 这一缩写可追溯到 Nikiforov 等人 [1994]。）在单个序列上发现的一组等位基因称为'''单倍型haplotype'''。

不同领域对突变一词的处理方式截然不同。它可用于表示 DNA 发生变化的过程或由此过程产生的新等位基因。有时，突变被用作任何多态性的同义词，或仅指在更偏向医学的群体遗传学中出现的罕见多态性（发生率 <1-5% 或仅存在于单个序列中的多态性）（Cotton 2002）。因为所有多态性最初都必须以突变的形式出现，并且因为我将在本书中讨论变异的进化起源，所以我试图将突变的使用限制在表示变异生成过程和此过程产生的新突变。

最后，我将保留术语替换，仅表示在物种之间观察到的 DNA 差异，与物种内的变异不同。我们通常不将插入/缺失 (indel) 多态性视为分离位点，尽管长度为 1 个碱基对 (bp) 的插入缺失有时也包括在此分类中。原因是很难计算两个具有多核苷酸插入缺失的序列之间的实际差异数量——2-bp 插入缺失算作一个多态性还是两个？答案取决于我们认为发生了单个 2-bp 突变还是两个单独的 1-bp 突变。'''在分析中通常不考虑具有插入缺失或任何类型的缺失数据的比对列，因此样本大小 (n) 的值可能因位点而异（参见第 3 章）'''。

== 进化过程模型 ==

=== 种群的模型 ===
在所有种群中，对于所有多态性，遗传漂变都会改变等位基因频率。漂变只是等位基因频率的随机变化，这是由于所有种群的有限性质造成的，并且是因为在每一代新染色体中，一些染色体比其他染色体留下更多的后代。漂变不同于自然选择（一种确定性力量），因为等位基因或基因型在后代数量上没有一致的差异，因此每个个体等位基因的频率不会仅仅因为漂变而持续上升或下降。

漂变模型是种群中个体如何代代更替的必要模型。最常用的模型之一是 '''Wright-Fisher 模型'''（Fisher 1930b；Wright 1931）。该模型设想一个具有 '''N 个二倍体雌雄同体且大小恒定的种群；我们要求它们是雌雄同体（即雌雄同株），以便所有个体都可以相互交配'''，但该模型'''可以扩展到具有不同性别的种群'''。由于个体是二倍体，因此对于常染色体基因座，每代种群中有 2N 条染色体。如果我们的模型包括性染色体和来自两个不同性别的相等数量的个体，则将有 '''1.5N X 或 Z 染色体、0.5N Y 或 W 染色体和 0.5N 线粒体或叶绿体基因组'''，具体取决于所研究的生物系统。为了形成下一代个体，我们将假设个体随机交配，并且染色体被均匀地取样并替换以留下后代。'''没有个体能存活到下一代'''——相反，整个种群被其后代所取代。这种模型最适用于世代不重叠的物种，例如一年生植物或一年出现一次的昆虫（一年生脊椎动物物种很少见，因为但确实存在；参见 Karsten 等人，2008 年）。

要了解漂移对 Wright-Fisher 模型中等位基因频率变化的影响，考虑具有两个等位基因的单核苷酸位置 A1和A2。在第 t 代，有 i 条染色体携带等位基因 A1，其频率为pt，pt= i/2N。这意味着有 2N − i 条染色体携带等位基因A2，其频率为 qt。'''下一代染色体的采样相当于从参数为 2N 和 i/2N 的二项分布中采样'''。因此，Wright-Fisher 模型中下一代 p 的均值和方差为：

[[文件:MPG--1.png|无框]]

其中 E(•) 表示随机变量的期望（均值），Var(•)表示方差。这些方程表明，当只有漂移发生时（没有突变和选择），平均等位基因频率预计会随着时间的推移保持不变。由于等位基因频率的预期变化为 0，因此无法预测任何特定等位基因的上升或下降。另一方面，该过程中的方差与种群规模直接相关，因此在较小的种群中，等位基因频率的变化会更大，并且等位基因频率处于中间水平。重要的是，即使没有预期的平均变化，从相同等位基因频率开始的独立种群也将不可避免地开始在其平均等位基因频率上有所不同，从而导致进化分歧。等位基因将向频率 0 或 1 漂移，此时频率为 1 的等位基因将被称为“固定”。一旦一个或另一个等位基因固定，就不可能再发生任何变化，因为两个等位基因中的一个已经从种群中丢失。

这些变化的一个相关后果是，'''当漂移是唯一起作用的力量时，预计种群中遗传变异的水平会下降。'''如果我们将'''杂合性heterozygosity'''定义为随机选择的两条染色体具有不同等位基因的概率，那么'''随机交配种群中双等位基因位点的预期杂合性量为 2pq'''（这一想法在第 3 章中有更深入的介绍）。当一个等位基因变得比另一个等位基因更常见时，杂合性就会下降（因为它在 p = q = 0.5 时达到最大值）；'''在 Wright-Fisher 模型中，预期杂合性每代下降 1/2N'''。尽管杂合度的下降不是等位基因频率变化的直接测量，但上述结果提供了当漂移是唯一作用力时等位基因频率变化非常缓慢的洞察。

'''第二个种群模型'''——在某些方面比 Wright-Fisher 更现实，在某些方面更易于数学处理——是 '''Moran 模型''' (Moran 1958)。在 Moran 模型中，'''不同年龄的个体可以共存'''，我们不会在每一代用新个体全面替换种群。'''严格来说，Moran 模型仅适用于单倍体种群'''，但为了便于与 Wright-Fisher 模型进行比较，我们'''将考虑一个由 2N 个单倍体个体组成的恒定大小的种群'''。在给定的时间点，随机选择一个个体进行繁殖，随机选择第二个个体（不一定与第一个不同）死亡。在下一个时间点，新的后代个体以及所有幸存的个体都具有繁殖的潜力，再次选择一个个体进行繁殖，另一个个体被选择死亡。'''如果我们将这个生死步骤重复 2N 个时间点，我们将得到 Wright-Fisher 模型中的一代'''。这是因为，平均而言，每个个体都将被替换；但是，有些个体的寿命会短于“一代”，而有些个体的寿命会更长。

在 Moran 模型下，当携带一个等位基因的个体被选择繁殖，而携带另一个等位基因的个体被选择死亡时，等位基因频率就会发生变化。当然，也可能出现这样的情况：被选择繁殖的个体和被选择死亡的个体携带相同的等位基因，在这种情况下等位基因频率不会发生变化。在 2N 个时间点重复生死操作后，我们可以问下一代等位基因频率的均值和方差是多少。再次考虑与 Wright-Fisher 模型中描述的相同类型的双等位基因位点，Moran 模型的下一代等位基因频率 p 的均值和方差为：

[[文件:MPG--2.png|无框]]

与 Wright-Fisher 模型一样，预计平均等位基因频率不会发生变化。'''然而，Moran 群体的等位基因频率方差是 Wright-Fisher 群体的两倍。这是因为 Moran 模型中每个个体的后代数量的方差是 Wright-Fisher 模型的两倍'''。与 Wright-Fisher 模型相比，后代数量方差增加的直观解释是是由在不同时间点繁殖的个体（即“存活”时间不同的个体）增加的方差。这种差异的结果是 Moran 模型中的漂移量是原来的两倍，因此杂合性以两倍的速率（1/N）丢失。在 Moran 模型中，漂移进化仍然非常缓慢，但它的速度是 Wright-Fisher 模型的两倍。这里描述的两种种群模型对于大多数物种来说都不切实际，对于某些应用，在种群遗传学中还有其他更切合实际的模型——尤其是 '''Cannings 模型'''（Cannings 1974）。Cannings 模型可以具有后代数量的任意方差，并且是 Wright-Fisher 模型的推广。但是，Wright-Fisher 模型既直观又可以推导出许多重要的进化结果。正如我们将在下一节中看到的，它也是其他种群模型得出的结果的试金石，可以作为所有其他模型的比较对象。

=== 种群的有效规模 ===
种群遗传学的一个核心概念是'''有效种群规模'''，通常表示为 '''Ne'''（Wright 1931）。与人口普查中的人口规模（只是给定时间的个体数量计数）相比，有效种群规模是一个抽象值，'''允许将实际种群建模为具有等量遗传漂变的 Wright-Fisher 种群'''。由于有许多因素导致自然种群中后代数量的方差超过 Wright-Fisher 模型中的预期值，因此有效种群规模通常小于人口普查人口规模。种群的有效规模使我们能够在一个参考框架内比较不同的种群和物种——即理想化的赖特-费希尔种群中预期的漂移量。这样，我们就有了一个单一的值，它有助于量化遗传漂变在确定突变、选择、重组和迁移的有效性方面的作用'''。我们甚至可以设想基因组不同区域具有不同有效种群规模，'''每个区域的历史都与具有不同遗传漂变水平的赖特-费希尔种群的历史相同。这些差异可以表现为整个基因组中许多进化过程的差异（有关综述，请参阅 Charlesworth 2009）。

然而，由于其定义和应用，有效种群规模也可能是一个模糊且被广泛误解的概念。一个问题是，至少有四种方式可以表征漂移的影响，因此任何给定种群都可以用四种不同的方式等同于赖特-费舍尔种群中漂移的某些方面。这导致了有效种群规模的多种定义： '''the variance effective size（方差有效种群大小）, the inbreeding effective size（近交有效种群大小）, the eigenvalue effective size（直译为：特征值有效种群大小）, and the coalescent effective size（溯祖理论有效种群大小）.'''在满足赖特-费舍尔模型假设的平衡种群中（以及在许多非平衡种群中），这些有效种群规模的度量将相等。'''但在一些具有非平衡历史的种群中，这些有效规模可能彼此相差很大，甚至可能未定义 - 也就是说，在这些情况下没有等效的赖特-费舍尔种群（Ewens 2004）'''。对于分子序列数据，最适用的有效大小可能是'''eigenvalue effective size'''大小，尽管在某些情况下它仍未定义（Sjödin 等人，2005 年；Wakeley 和 Sargsyan，2009 年）。根据此定义，我们将遗传漂变量等同于coalescence率（参见第 6 章）。

有效种群大小的概念也经常被误用，或者至少其含义和应用被不必要地扩大。正如 Ewens (2004, p. 38) 所强调的，“如果将形容词‘有效’替换为‘在某些特定方面相当于 Wright-Fisher 模型’，那么它将更能说明进化模型概念的含义。” Ne 与理想化的 Wright-Fisher 人口模型（特别是与该模型中的漂移）的本质联系经常被忽视或被认为比实际情况更重要。如上一节所述，Wright-Fisher 模型是许多理论人口遗传学的基础，是理解许多不同目标人口行为的中心比较器。但是这个 Wright-Fisher 人口的规模并不等同于繁殖个体的有效数量、对下一代有贡献的个体数量或任何“真实”人口规模。我们可以很容易地将有效规模定义为与具有相同遗传漂变量的 Moran 群体相当的规模，尽管在这种情况下，Ne 的数值将只有一半。这一切都意味着，虽然 Ne 的数值不是非常有用，但基因组区域之间或生物体之间的等级值仍可能告诉我们漂移和选择的相对预期强度（见第 3 章）。

=== 突变模型 ===
DNA 突变过程有许多模型。需要多种模型，因为存在许多不同类型的突变，并且因为不同的分子生物学技术提供了有关潜在变异的不同数量的信息。使用某些模型只是因为它们在数学上更易于处理。重要的是要认识到，这些不是突变如何在生殖系中发生的特定分子模型（例如，DNA 聚合酶和相关的校对酶如何整合不正确的碱基）。相反，这些模型旨在以一般的定量方式解释在当今样本中检测到的多态性是如何在许多代以前出现的，以及不同的突变率如何导致观察到的不同数量的多态性。突变的群体遗传模型也可以比该过程的许多系统发育模型更简单，主要是因为我们期望在比较的序列之间发现更少的差异。

尽管突变的群体遗传模型之间存在差异，但也存在许多相似之处。所有模型都假设突变是随机的，尽管随机的含义可能与一般用法不同。自然界中的突变在许多方面都是高度非随机的。例如，并非所有突变都同样可能发生。众所周知，'''核苷酸转换突变（嘌呤之间或嘧啶之间的突变）比核苷酸颠换（从嘌呤到嘧啶的突变，反之亦然）更常见'''。所有基因座发生突变的可能性也不尽相同——例如，染色体上的突变率存在很大的区域差异（Hodgkinson 和 Eyre-Walker 2011），CpG 位点（DNA 链上 G 跟随 C 的位点）的突变率可能比附近位点高 10 倍（Bird 1980）。然而，进化意义上的随机性仅意味着在一种环境中有利或有害的突变在另一种环境中发生的可能性不会相对更高或更低，尽管总体突变率可能会发生变化。尽管可以考虑突变过程的复杂性，但这些突变模型通常忽略所涉及的核苷酸变化的细节，只考虑是否发生了突变。此外，在此处考虑的突变模型中，通常只考虑对适应度没有影响的突变（中性突变）。

我们的突变模型所需的随机性与它们在时间和空间上的起源有关，这两者都可以用泊松过程来描述。假设中性突变以恒定速率 μ（每代）在位点之间和沿谱系独立积累，这样在 t 代之后'''观察到的突变数将呈泊松分布，平均值为 μt。'''泊松分布是合适的，因为突变率非常低，在真核生物中每代每位点约为 10^-8 到 10^-9（Lynch 2010）。突变率可以按基因座或位点表示，在后一种情况下，在 L 个核苷酸位点的单代中观察到的突变数将呈泊松分布，平均值为 μL。在考虑核苷酸按顺序排列的模型中，我们假设每个位点都有独立的突变概率。鉴于新的方法考虑了染色体上多态性的间距（例如，Li 和 Durbin 2011），关于突变独立性和位点恒定突变率的假设可能非常重要。遗憾的是，这两个假设都不是始终正确的（例如，Schrider、Hourmozdi 和 Hahn 2011；Harris 和 Nielsen 2014），尽管这些违反假设对大多数方法的影响可能并不大。
[[文件:MPG1.2.png|缩略图|图 1.2 突变模型。(A) 中展示了四种不同的模型：双等位基因模型指具有两个等位基因的单个位点，尽管这些位点也与其他模型一致。无限位点模型是指每个位点最多发生一次突变的序列。有限位点模型是指在同一位点可以发生多个突变的序列。无限等位基因模型将每个整个序列视为一个等位基因，而不是单个位点的交替状态（因此这里显示了三个等位基因）。（B）逐步突变模型，在该模型下，突变只能导致相邻等位基因之间的变化，通常在重复次数上有所不同。]]
最简单的突变模型涉及两个等位基因（图 1.2A）。在经典的群体遗传学中，它们通常表示为 A 和 a 或 A1和A2，可以代表两种不同的核苷酸、两种不同的氨基酸或两种不同的单倍型。（我一般会在本书中使用 A1和A2，除了第 5 章和第 9 章，我使用其他符号以避免与种群 1 和 2 中的等位基因混淆。）这种'''双等位基因模型two-allele model'''是考虑单个位点数据时最常用的突变模型。如果在建模数据中也知道这样的分配，则可以将两个等位基因中的一个指定为祖先状态，尽管这些分配不是必需的。该模型的一个重要特征是每次使用时必须指定的允许突变的数量和类型。通常允许 ) 突变，在这种情况下我们说没有回复突变的可能性。这与允许样本历史中仅发生来自 A1 的单一突变不同，因为有时可以放宽此条件而不放宽对回复突变的限制。但通常只对每个突变的单一起源进行建模，而没有回复突变。

将双等位基因模型直接扩展到更大的 DNA 序列被称为'''无限位点模型infinite sites model''' (Kimura 1969)。在这个模型中，我们假设我们有足够长度的 DNA 序列，以至于我们的样本中有多个分离位点。'''由于突变率低，无限位点模型假设样本历史中的每个突变仅发生一次，没有回复突变，并且每个新等位基因的突变都发生在序列中的新位点'''（图 1.2A）。这些假设确保个体在 DNA 水平上相似，因为有共同的历史，而不是趋同突变。这些假设还意味着每个分离位点最多是双等位基因，样本中仅存在两个等位基因（例如 A1）。假设突变根据泊松过程独立发生。

在某些情况下，在采样染色体的历史中，一个位点可能发生了多个突变。由于我们不再满足无限位点假设，因此我们必须使用'''有限位点模型 finite sites model.'''有限位点模型最常用于物种间 DNA 序列的比较，其中涉及的长时间段意味着位点可能已多次改变。有几种方法可用于准确估计位点存在多个替换时序列之间的距离，例如 Jukes-Cantor 校正（Jukes 和 Cantor 1969；第 7 章）。在分析多态性数据时，当分离位点为三等位基因或四等位基因时，最常需要有限位点模型（图 1.2A）。在这些情况下，分离位点的数量不再等于样本历史中的突变数量，因为单个位点可能经历了两次或两次以上的状态变化。

此类变化可以表现为新的衍生状态、对先前存在的祖先等位基因的回复突变或对样本中已经存在的衍生等位基因的复发突变。有限位点模型中的突变仍然可以是泊松分布的，但现在每个新突变都必须有机会发生在已经经历过突变的位点和已经存在的等位基因状态。

对于无限位点和有限位点模型，我们都假设对底层 DNA 序列有完美的了解。然而，在分子群体遗传学的早期，DNA 序列本身尚不可用。同位酶技术（例如 Hubby 和 Lewontin 1966）仅允许区分氨基酸变化不同的序列，导致蛋白质以不同的速度通过凝胶。这意味着'''许多氨基酸突变和所有同义突变都无法检测到'''。为了模拟这样一个系统（其中不同的等位基因被识别为电泳可区分的变体），研究人员使用了'''无限等位基因模型infinite alleles model'''（Kimura 和 Crow 1964）。该模型'''假定基因座上的每个新突变都会创建一个群体中不存在的新等位基因，而不必了解底层 DNA 序列'''，也不必处理发生突变的位点的细节。

此时我们必须明确无限等位基因模型中等位基因的含义与无限位点模型中等位基因的含义之间的关系（图 1.2A）。如上所述，我们目前使用等位基因来区分单个核苷酸或密码子位置的替代状态。然而，<u>无限等位基因模型中的不同等位基因相当于不同的单倍型，其中每个单倍型可能由多个核苷酸变化来区分</u>。无限等位基因模型不考虑不同单倍型（等位基因）之间的位点数目差异，因此<u>没有利用完整的序列信息</u>。此外，尽管无限等位基因模型已经得出了许多具有历史意义的结果（例如，Ewens 1972），但它们<u>通常忽略了重组</u>在创建新单倍型方面的影响。由于所有这些原因，无限等位基因模型<u>很少用于现代分子群体遗传学</u>。

与无限等位基因模型相关的是'''逐步突变模型 stepwise mutation model'''，该模型最初是为了<u>表示突变在密切相关的等位基因之间移动的影响而提出的</u>（Ohta 和 Kimura 1973）。在原始模型中，等位基因代表单倍型，但单倍型的排序使得<u>突变可以在 A1 A2之间或 A2 A3之间进行，但不能在 A1A3 之间进行</u>（图 1.2B）。逐步突变模型最初用于模拟等位酶位点，之后作为'''微卫星'''的模型得到了更广泛的应用。'''微卫星'''——也称为短串联重复序列 (STR) 或可变数目串联重复序列 (VNTR)——由短重复单元（通常长度为 1-6 个碱基）组成，可连续重复 1 至 50 次（Goldstein 和 Schlötterer 1999；Ellegren 2004）。多态性微卫星上通常有许多等位基因，每个等位基因的重复单元数不同。微卫星上的突变被认为是通过聚合酶滑移发生的，导致重复次数增多或减少。逐步突变模型允许通过增加或减少单个重复单元来改变等位基因大小，其增益和损失概率是对称的，且等位基因大小与突变率之间没有关系（图 1.2B）。真实的微卫星数据表明，存在多步突变，每次导致<u>多个重复的增加或损失，并且突变的方向往往存在偏差</u>（Di Rienzo 等人，1994 年；Rubinsztein 等人，1995 年；Sun 等人，2012 年）。出于这些原因，可以使用允许从任何其他等位基因到达任何等位基因的替代模型（也称为无限等位基因模型）或允许任何特定的步长和突变率分布（对称或不对称）（此类模型称为'''广义逐步模型generalized stepwise models'''；Kimmel 和 Chakraborty，1996 年）。

=== 重组模型 ===
重组建模通常与突变建模类似。重组事件被认为以类似泊松分布的方式沿染色体发生，'''重组率由参数 c 给出'''，定义为两个标记之间发生交叉事件的概率。实际上，交叉比这更复杂，但我们在群体遗传模型中忽略了大多数这些复杂因素（例如交叉干扰）。我们经常测量每代每个位点的重组率，因此，<u>在相距 L 个核苷酸的两个位点之间在单个代中发生的重组事件的预期数量为 cL。</u>在某些生物体中，交叉的一个突出特征是存在所谓的'''重组热点'''（Jeffreys、Kauppi 和 Neumann 2001；McVean 等人 2004）。重组热点代表交叉事件密集发生的小区域，通常使重组率比背景重组率高出许多倍。<u>即使那些似乎缺乏真正热点的生物体也显示出染色体不同位置的重组率大幅度改变。</u>对于一般的重组——以及对于包括热点在内的特定场景——所有这些都意味着事件<u>通常以'''“有限位点”'''的方式建模，其中多个重组事件可以发生在样本历史的同一位置。</u>

突变和重组之间的主要区别之一是重组事件不会改变单个位点的等位基因频率。通过沿染色体重新排列等位基因，交叉只会改变 DNA 单倍型的频率（图 1.3A），而每个位点的等位基因频率保持不变。此外，虽然交叉是重组的一个结果，但另一个结果是'''基因转变'''，即遗传物质的非对称交换（图 1.3B）。在基因转变中（不必真的涉及一个基因），个体中的两个等位基因拷贝中的一个充当供体，而另一个充当受体。供体的 DNA“覆盖”了接受体的 DNA，从而产生了两个相同的重组结果。
[[文件:MPG1.3.png|缩略图|图 1.3 重组的不同结果。（A）一个二倍体个体在四个基因座 A、B、C 和 D 处杂合。B 和 C 基因座之间发生交叉事件（用 × 表示），从而产生了两个重组单倍型。（B）相同的初始设置，转换事件影响 B 和 C 基因座。因为 B1所有基因作为供体，结果是一个 B1 等位基因纯合的个体。]]
<u>有时这种情况会以有偏的方式发生，因此一个等位基因更有可能成为供体</u>。<u>无论是否有偏向，基因转变都会改变等位基因频率。</u>基因组内重复基因座之间也可能存在非相互的遗传物质交换，这被称为 '''non-allelic or interlocus or ectopic gene conversion（直译为：非等位/基因位点间/异位基因转变）''' 在这里，我只考虑等位基因之间的基因转变；这被称为'''allelic or intralocus gene conversion（等位/基因位点内基因转变）.'''

基因转变的纳入需要在重组模型中引入两个附加参数。一个是'''每代每个位点的基因转变率 g'''，另一个是'''基因转变带的平均长度 q'''。<u>由于所有重组事件都会导致较短的基因转变带，但并非所有事件都会导致交叉，因此 g/c 的比率（有时表示为其自己的参数 f）通常远大于 1，范围从果蝇的约 4到人类的约 7。基因转变片段（即转换的 DNA 片段）约为 100-1,000 个核苷酸</u>，<u>其长度分布类似于参数为 1/q 的几何分布</u>。基因转变片段以概率 g 在每个位点处起始，然后该片段被建模为延伸到起始位点的右侧（Wiuf 和 Hein，2000 年）。第 4 章将讨论有关交叉和基因转变的更多细节。

=== 自然选择模型 ===
自然选择的许多方面与分子群体遗传学相关，但这里无法全部讨论。也许最有用的介绍只是定义常用术语并指出当今该领域使用的定义中的歧义。

就其对生物体适应性的影响而言，新突变有三种后果：相对于祖先等位基因的适应性，它可能'''有利、有害或中性'''。当然，新突变对不同遗传背景、杂合或纯合形式的适应性的影响各不相同，但这里我们感兴趣的是突变在不同背景和种群频率下的平均边际效应。如果我们将 s 定义为新突变的选择系数（即拥有一个新等位基因拷贝的个体与祖先等位基因纯合的个体之间的相对适应性差异），那么对于有利突变，s > 0；对于有害突变，s < 0；对于中性突变，s = 0，因为这两个等位基因具有相同的适应性。效果大的突变具有较大的 |s|，要么增加适应度，要么减少适应度，<u>认为在自然种群中s = 0.10（适应度增加 10%）被认为是非常大的效果</u>。正如我们将在第 7 章中看到的那样，<u>效果比这小得多的有利突变将迅速在种群中传播。</u>

为了总结基因或基因座的选择历史，我们经常使用短语'''负（纯化）选择negative (or purifying) selection'''、'''正选择 positive selection和平衡选择 balancing selection'''。<u>这些非常有用但通常非常模糊的自然选择总结并不总是与用于定义单个突变效果的术语一致</u>。<u>负选择是指基因座的历史，其中发生的绝大多数突变都是有害的。因此，受到负向选择的基因或非编码区通常是保守的，自然选择会去除大多数改变功能性 DNA 序列的突变。</u>在某些情况下，一级序列可能不保守，但该序列仍会经历纯化选择，<u>因为序列的长度或序列的平均生化特性是所选特征</u>。我们也经常说，这些区域或核苷酸位点受到选择的限制，只能位于序列空间的有限区域内。从这个定义中应该可以清楚地看出，几乎所有蛋白质编码基因始终处于负向选择之下，即使有大（或小）比例的突变是中性的或有利的。未受到负向选择的区域不受限制，也不会受到选择。使用短语负选择时出现的<u>一个歧义是，一个基因受到的负选择比另一个基因更强。这可能意味着受限位点的替代碱基的平均选择系数变得更负；这肯定是短语负选择所暗示的当 s 接近于 0 时，称为“弱选择”。或者，它可能意味着某个区域中的更多位点（例如，蛋白质中的更多氨基酸）受到任何限制，因此在整个区域观察到的平均替换数较低。</u>无论如何，负选择是一种常用的简写，在大多数情况下具有明确的含义。

'''正选择是指有利突变已经出现并固定或正在固定的基因座的历史'''。由于有利突变比有害突变少见得多，因此<u>假设负选择作用于几乎所有保守和功能性区域。相比之下，即使只有一个可检测到的有利替换的基因座也被认为受到正选择。</u>这种替换可能发生在遥远的过去，也可能目前正在passing through群体。有利突变的频率可以迅速增加，这种快速增长产生的许多模式可用于检测正向选择的特征。由于<u>检测正向选择已成为分子群体遗传学存在的理由(raison d’être )</u>，我们将在整本书中多次回顾它。

用于总结基因座选择历史的最后一个概念是平衡选择。该术语<u>涵盖了多种不同的选择模型</u>，但所有模型的<u>共同点都是维持种群或物种内的选定'''多态性'''</u>。这些模型与具有普遍有利或有害突变的模型形成对比，因为平衡多态性由相对适应度随时间、空间或种群频率变化的等位基因组成。因此，平衡选择通常与包括正向和负向选择的“定向”选择模型形成对比。常见的平衡选择包括'''杂合优势（或超显性选择）'''，其中杂合基因型比纯合基因型具有更高的适应性；'''负频率依赖选择'''，其中稀有等位基因具有更高的适应性；以及'''空间或时间变化选择'''，其中种群中等位基因的适应性分别取决于它们所处的环境或季节。在许多情况下，空间变化选择被认为是一种局部适应形式，而不是平衡选择，尽管在整个物种的层面上，任何此类多态性都在保持多样性，因此受到平衡选择。对于某些形式的平衡选择，平衡多态性可能是双等位基因或多等位基因。也就是说，一个位点上可能存在两个平衡的替代等位基因（例如，Kreitman 和 Aguadé 1986），也可能存在多个平衡的等位基因（通常在多个位点上）（例如，Ségurel 等人 2012）。

最后必须对用于描述自然选择数量性状（例如身高、体重，甚至某些基因组特征）的语言做出评论（例如，Kimura 1981）。数量性状通常由多个基因座的等位基因的综合作用决定，并且这些基因座中的任何一个都可能受到负面、正面或平衡选择的影响。然而，表型本身据说受到稳定、定向或破坏性选择的影响。这些过程中的每一个都类似于 DNA 上的一种选择形式，但这种类比仅限于此。例如，稳定选择不同于负选择——稳定选择的作用是消除表型极端的个体，方法是消除无条件删除的等位基因，保持平衡的多态性，或者只是在许多基因座上保留适应度接近的等位基因的最佳数量。表型的定向选择与单个基因座的正向选择最为相似，尽管对任何一个有助于数量性状的等位基因的选择强度可能非常弱。最后，表型的破坏性（或多样化）选择对应于对具有中间性状值的个体的选择，但不一定需要在任何特定基因座上进行平衡选择。还要注意的是，多样化选择这一术语有时用来表示基因座的多等位基因平衡选择（例如，Foxe 和 Wright 2009）或整个系统发育中的快速蛋白质进化（例如，Murrell 等人 2012）。关键信息应该是，自然选择有很多种形式，描述每种形式的术语也有很多，有时必须小心谨慎，以便清楚地传达在任何特定情况下调用的模型。

=== 迁移模型 ===
种群遗传学中的迁移模型在很大程度上只是种群populations（也称为demes or subpopulations）在环境中的结构模型（有关种群定义的更多讨论可参见第 5 章）。这些模型几乎不需要关于个体如何进化的细节,人类实际上也在种群之间移动并进行杂交，一般来说，人们只对交换的等位基因的数量和类型感兴趣。然而，在所有迁移模型中，迁移过程有几个重要的细节是共同的。这些细节对于理解我们如何推断一个物种的基因流动模式至关重要。

'''迁移率 m''' 被定义为<u>当前一代种群中来自上一代不同种群的所有个体（或染色体）的比例。</u>也就是说，迁移率代表了种群中每代移民个体的比例。这些移民<u>被认为是来自源种群的随机个体样本，并且假设源种群和接收种群的规模都不会因迁移而发生变化</u>。第一个假设意味着我们可以根据来源和接受者群体中的等位基因频率（以及迁移率）轻松计算出由于迁移而导致的等位基因频率的预期变化。第二个假设也使得跟踪等位基因频率的预期变化变得更加容易：因为任何特定群体都可以是移民的来源和接受者，所以我们不必考虑每个人的移动。
[[文件:MPG1.4.png|缩略图|图 1.4 迁移模型。 (A) 无限岛模型假设有无限数量的人口大小相等，彼此之间交换相等数量的移民。虚线表示看不见的人口的迁移。 (B) 有限岛模型假设人口数量有限，每个人口都有自己的规模，并且有特定数量的移民进入和离开。箭头的粗细表示迁移率的差异。 (C) 垫脚石模型假设人口大小相等，只能与邻近人口交换移民。 (d) 二维垫脚石模型也只允许邻近人口之间的迁移。]]
大量迁移模型涉及离散组织的群体，其中每个群体内发生随机交配，并且移民可以在群体之间交换。这些“岛屿”模型与突变模型有着有趣的相似之处，最明显的是，我们可以拥有'''无限岛屿模型 infinite island models（图 1.4A）和有限岛屿模型 finite island models （图 1.4B）'''。其中假设较多的是无限岛模型（一般来说归因于 Wright 1931），规定有<u>无数个大小相同的种群，每个种群都以相同的速率与其他种群交换移民，并假设没有选择，也没有突变。</u>这些假设意味着该模型'''没有地理结构'''，因为空间上接近的种群交换移民的可能性并不比彼此相距较远的种群更大。<u>无限岛模型假设种群处于迁移漂移平衡状态，因此种群之间也不存在非最近迁移导致的共同祖先痕迹。</u>由于所有这些原因，'''它被称为“梦幻岛”模型'''（Whitlock 和 McCauley 1999），尽管它的许多假设可以被违反，而不会对关于迁移的推断产生很大影响（Neigel 2002）。然而，更现实的迁移模型可以更精确地估计人口参数。

有限岛屿模型<u>仅包含有限数量的岛屿，每个岛屿都有自己的大小和迁移率</u>（图 1.4B）。最简单的模型涉及两个种群，大小为 N1、N2和两个迁移率 m1、m2。迁移率指定等位基因从种群 2 到种群 1（m1）以及从种群 1 到种群 2（m2）的移动。通常假设迁移率是对称的 - 即 m1=m2，因此只需要指定或估计一个参数。双岛模型的<u>其他版本假设两个种群的大小差异很大，因此只有从较大种群（“大陆”）迁移到较小种群（“岛屿”）才会对等位基因频率产生影响。</u>因此，这种大陆岛屿模型只是一个单向迁移的双岛模型。对于具有两个以上种群的有限岛屿模型，我们必须指定第 i 个种群的大小 Ni以及第 i 个和第 j 个种群之间的迁移率 mij，对于每一对 i 和 j。

继续将迁移和突变模型进行比较，正如逐步突变模型只允许变化以创建相邻的等位基因一样，迁移的'''踏脚石模型'''（Kimura 1953'''）只允许个体在相邻种群之间迁移'''（或'''假设这种迁移是最有可能）'''。垫脚石模型最常见的是一维（图 1.4C）或二维（图 1.4D），但可以容纳任意数量的维度。有限数量种群的垫脚石模型的一个问题是如何处理格子的末端——也就是说，当到达一串种群中的最后一个种群时该怎么做。对于一维模型，一个简单的解决办法是将种群排列成一个圆圈，这样所有种群都有两个邻居；对于二维模型，等效形状是圆环（实际上是一个甜甜圈）。然而，有趣的是，在模型中包含真正的边界可以深入了解一系列种群之间的多样性分配（例如，Wilkins 和 Wakeley 2002）。

最后，<u>一个通常更为现实的迁徙模型是假设一个连续分布的种群分布在一维或二维表面上</u>。这种模型通常与 Wright 的距离隔离 (isolation by distance，IBD; Wright 1943) 概念相关，尽管相同的 IBD 模式将由踏脚石模型产生。在这些连续分布的进化模型种群模型中（这种模型没有通用名称，尽管曾使用过连续模型这一术语；Felsenstein 1976），空间上接近的个体更有可能密切相关，因为分散是有限的，或者至少比栖息地的规模小得多。模型中的迁徙通常用从正态分布中得出的分散距离方差 s2 来描述。随着“景观遗传学”的出现（Manel 等人，2003 年），这些模型最近重新受到欢迎，并将在第 9 章中进一步讨论。

=== 交配模型 ===
许多种群遗传理论同样适用于单倍体和二倍体、有性和无性生物以及雄性和雌性。虽然这并不总是正确的——也有一些非常重要的例外——但细节往往对预测结果影响不大。细节很重要的一个相关领域是我们必须考虑有性生物中二倍体基因型的频率。因为我们经常根据观察到的不同基因型的频率推断进化过程（例如，在识别种群结构时；见第 5 章），所以我们必须有一个模型来描述在没有这些过程的情况下预期的基因型频率。此类模型中应用最广泛的是 '''Hardy-Weinberg 模型'''（Hardy 1908；Weinberg 1908）。

为了理解该模型及其预测，我们首先考虑一下我们要预测什么。对于具有两个等位基因 A1 的单个基因座，有三种可能的二倍体基因型 A1A1/A1A2/A2A2。第一个和第三个是纯合基因型，而第二个是杂合子。我们分别将等位基因 A1 的频率表示为 p 和 q，将三种基因型的频率表示为 pA1A1、pA1A2和 pA2A2。Hardy-Weinberg 模型为我们提供了一种计算预期基因型频率的方法，假设<u>没有选择、没有突变、没有迁移、没有漂移，并且两性之间随机交配。</u>根据这些假设，每种基因型的预期频率为：

[[文件:MPG--3.png|无框]]

这些预期基因型频率相当于从种群中选择等位基因以形成下一代的预期结果，有时被称为配子的随机结合。当一个种群与预期的基因型频率相匹配时，我们说它处于哈代-温伯格平衡（HWE）。

个体可以通过多种方式进行'''非随机交配'''。<u>个体可以选择具有相似表型的配偶，我们称之为'''正向选型交配 positive assortative mating'''；如果他们与不同的个体交配，则称为'''负向选配（或非选型）交配negative assortative (or disassortative) mating'''</u>。由于相似的表型很可能由相似的等位基因决定，因此<u>正向选择性交配会导致相关性状基因座上出现更多的纯合基因型，而基因组的大部分仍为 HWE</u>。影响所有基因座的选择性交配的一种极端形式是近亲繁殖，其中亲属之间的交配次数超过偶然预期。近亲繁殖系数 F (Wright 1922) 的范围从 0 到 1，表示由于亲属之间的交配而导致基因组中具有“血统相同”等位基因的基因座的比例。近亲繁殖通常表现为纯合基因型过剩，因此近亲繁殖越多（F 越大），群体中的纯合性就越高。近亲繁殖可能是由于多种过程引起的，包括亚种群内部的交配多于亚种群之间的交配（近亲繁殖系数表示为 FST）或同一亚种群内亲属之间的交配多于亚种群之间的交配（表示为 FIS）。第 5 章和公式 5.3 更详细地讨论了由于 FST 导致的纯合子过剩。

== 分子演化的模型 ==

=== 分子进化的中性理论 ===
相对而言，用于广泛解释分子变异模式的模型很少，只有一项工作能够上升到该领域的科学理论水平。这项工作——分子进化的中性理论——由 Motoo Kimura (1968) 和 Jack King 和 Thomas Jukes (1969) 独立提出，是'''现代分子数据研究的基石之一'''。Kimura 本人对中性理论进行了非常简洁的描述 (Kimura 1983，第 306 页)：<blockquote>中性理论声称，绝大多数进化突变替换不是由积极的达尔文选择引起的，而是由选择性中性或近中性突变体的随机固定引起的。该理论还断言，分子水平上的大部分种内遗传变异（如以蛋白质多态性形式表现出来的变异）是选择性中性的或接近中性的，并通过突变输入与等位基因的随机灭绝或固定之间的平衡在物种中维持。</blockquote>中性理论实际上对分子进化提出了'''两个主张'''：（1）<u>分子水平上物种之间的差异主要是由于一个等位基因被另一个适应度相当的等位基因所取代（即中性）；（2）物种内多态性的替代等位基因相对于彼此适应度是中性的，并且具有由突变漂移平衡主导的动态。</u>这两种主张的结果是，<u>多态性和分化只是同一过程的两个阶段，中性等位基因进入种群，最终因漂移而丢失或固定</u>（Kimura 和 Ohta 1971）。因此，中性理论是理解物种间分化原因和维持物种内变异的过程的框架。

中性理论有许多非常有价值的特点，确保了其持续使用。中性理论的一个关键见解是，它能够通过假设不同程度的选择约束来解释基因内位点、进化模型或基因组内基因之间的进化速度差异。尽管这一点常常被误解（正如我们将在下一节中看到的那样），<u>中性理论并不否认负选择的作用——事实上，负选择强度的变化被认为是进化速度的主要决定因素（而不是正选择强度或频率的变化）</u>。这一见解可以总结为以下等式：

[[文件:MPG--12.png|无框|195x195像素]]

这里，'''中性突变发生的速率（μ）由总突变率（ν）和所有突变中中性突变的比例（f0）决定。'''

<u>假设整个基因或基因组的总突变率恒定，中性理论认为，进'''化变化率的变化是由于中性突变比例的变化'''</u>。这个分数 f0代表约束量the amount of constraint，因此“'''功能约束越弱，选择性中性的突变比例越大，因此进化率越高'''”。考虑密码子内不同位置的多态性和发散水平。四重简并位点比双重简并位点进化得更快，而后者比非简并位点进化得更快（例如，Li 1997，图 7.2）。<u>同一密码子或同一基因内的各个位点之间的总（或“潜在”）突变率非常相似。位点之间的差异在于约束量（f0</u>），<u>这反过来又导致观察到的中性多态性或中性替换数量的差异</u>。

了解中性突变率 μ 的变化含义非常重要。按照 Kimura 的意图，中性突变率可能因位点、密码子、同一蛋白质的不同区域或不同蛋白质而异。中性突变率会有所不同，因为负选择在不同位点和基因之间的强度不同。密码子内的非简并位点（突变总是导致非同义变化的位点）可能具有与四重简并位点（突变永远不会导致非同义变化的位点）非常不同的中性突变率。单个基因的中性率本身很可能是基因内所有位点之间不同中性率的平均值，例如，对于蛋白质中功能更重要的部分中的密码子，f0 可能较低。四重简并位点通常被认为具有 f0 = 1 — 没有任何约束 — 因此被认为反映了潜在的突变率（有关此假设的更多讨论，请参阅第 7 章）。但每个基因和每个位点都有自己的中性突变突变率——这是中性等位基因出现的速率，无论多么罕见。<u>总突变率和中性突变率之间的区别对本书讨论的许多主题具有重要意义，也是我们理解分子变异的关键概念。</u>

中性理论的另一个主要贡献是它能够帮助解释物种和种群之间核苷酸多态性水平的变化。如果在物种内观察到的大多数多态性是中性的——不是保持在突变选择平衡中的轻微有害多态性，不是保持在中等频率的平衡多态性，也不是在固定过程中贯穿整个种群的有利突变——并且选择对连锁突变没有影响，那么种群内预期的变异量由中性突变和遗传漂变之间的平衡决定（图 1.5）。<u>多态性由（中性）突变增加，在完全丢失或固定后，由于漂移而被消除。假设中性突变率相等，较大的种群经历的漂移较少，因此可以保持更多的多态性（图 1.5）</u>。<u>漂移和突变的共同作用是我们认为乘积 Neμ 是多态性水平的决定因素（尽管不是唯一因素）的原因之一，同样也是我们在评估种群内重组水平（Nec）和迁移水平（Nem）时关注包括漂移贡献在内的其他复合参数的原因。</u>

如果中性理论的假设是正确的，并且种群处于突变-漂移平衡状态，那么我们就会有大量的工作来描述物种内多态性的预期水平和频率，其中大部分要归功于 Kimura 本人。中性理论为理解 DNA 变异提供了理论基础，它提供了清晰、可检验的假设，使得能够使用一系列统计工具来检测自然选择的作用。这个语料库推动了本书中解释的大部分期望，并确保了中性理论继续作为研究分子群体遗传学的框架。
[[文件:MPG1.5.png|缩略图|图 1.5 变异的平衡水平。当通过突变输入到种群中的变异（实线箭头）恰好等于通过丢失或固定新等位基因（虚线箭头）而产生的变异的总输出时，就达到了平衡。种群大小（由圆圈的大小表示）决定了漂移的影响，因此在小种群中（由较粗的箭头表示）有更多的丢失和更多的固定，这样小种群中的变异的平衡水平较低。请注意，等位基因的丢失率和固定率并不相等，但为简单起见，箭头的粗细相同。]]
然而，中性理论在解释越来越多的分子变异研究产生的大部分数据方面也存在很大困难。为了清楚地掌握这些问题，考虑中性理论的'''弱版本和强版本'''是有帮助的。<u>'''弱版本'''指出，在整个基因组中观察到的大多数替换实际上是中性的</u>，<u>并且是由随机过程固定的。</u>多态性也是如此：在整个基因组中，大多数都是中性的，代表最终会在种群中丢失或固定的相同等位基因。因为基因组中的大多数突变（至少在大的真核基因组）发生在非编码、无功能的位点，所以中性理论的弱版本继续被接受。'''强版本'''<u>认为大多数氨基酸替换也是中性的，突变漂移平衡是决定中性多态性水平和频率的主要力量。</u>即使整个基因组中的绝大多数替换都是中性的，大多数研究人员关心的是可能对适应性产生影响的替换——无论是编码区域的替换还是功能性非编码区域的替换。'''对于这些类型的替换，中性理论仍然被拒绝'''（Hahn 2008；Wright 和 Andolfatto 2008；Sella 等人 2009）。同样，即使所有观察到的多态性都是中性的——在编码、非编码和非功能位点——观察到的多态性模式也不符合突变漂移平衡的预期，甚至不符合这种平衡的人口扰动，这可能是由于对相关突变的选择。总之，'''中性理论的弱版本是正确的，而且很有价值；强版本几乎肯定是错误的，但有时仍然有用'''。拒绝这一理论与其剩余效用之间的紧张关系仍未得到令人满意的解决（Kreitman 1996；Hahn 2008）。

=== 中性理论的误解和误用 ===
与任何广泛使用的科学理论一样，中性理论不可避免地被误解，并因此被误用。这些问题中的许多甚至在分子群体遗传学中也反复出现，导致作者之间不必要的混淆和沟通不畅。大多数问题都是因为中性理论和术语''neutral''都被理解为“无选择”，<u>尽管 Kimura 强调“该理论并不假设所有突变在发生时都是选择性中性的”</u>（Kimura 1983，第 307 页）。

在制定中性理论时，Kimura 试图解释分子生物学早期积累的 DNA 和蛋白质序列数据，中性理论是他对世界如何运作的看法。<u>他并没有主张中性理论应该是进化的零模型null model，尽管他确实认为，与作为替代方案提出的泛适应论模型相比，中性理论的''ad hoc''较少。然而，现在中性模型通常被用作零模型的同义词，这意味着任何没有积极或平衡选择的模型都比包含这些选择的模型更简约。</u>当然，能够指定一个没有积极或平衡选择的模型是有用的，这种模型的常用短语包括标准中性模型或中性平衡模型。

更令人困惑的是，将通用的“中性模型”与没有任何选择的模型概念混为一谈。中性一词的这种含义从何而来？它可能始于数量性状模型，研究人员对突变和漂移对表型进化的贡献感兴趣，他们借用了选择性中性这一术语来表示不受选择的性状（Lande 1976）。这种理解甚至发展成为此类性状的通用模型，名为表型进化中性理论（Lynch and Hill 1986）。此后，这一绰号在许多领域被用于不包含任何选择形式的模型，包括生物多样性研究（Hubbell 2001）、基因表达研究（Khaitovich、Pääbo 和 Weiss 2005）和文化数据研究（Lansing 和 Cox 2011）。

类似的、也许更令人烦恼的混淆是突变中性与位点中性之间的混淆。需要明确的是，只有突变才能是中性的：该术语明确地说明了替代等位基因的相对适应性。没有所谓的中性或“严格中性的”基因座，但可以存在不受选择的基因座。不幸的是，该领域中常见的简写是使用中性基因座来指代仅产生中性突变（即不受约束）的基因座、与非中性多态性相关的中性多态性基因座或随机选择的未知与特定适应性特征有关的基因座。问题不是因为使用了这种有用的简写，而是因为许多研究人员不明白它只是一个更复杂概念的简写。将术语“中性”误用到基因座或序列中的位置不仅仅是该词的另一种用法，它还导致了大量关于种群遗传学数据和概念的误解。以下是文献中由于将术语“中性”应用于基因座和突变而经常看到的一些误解：

• 它使人们认为只有不受约束的位点才能发生中性突变。根据中性理论，所有位点都可以发生中性突变，因此所有位点都可以具有由突变和漂移的平衡维持的多态性。在受约束的位点，中性突变率可能较低，但多样性水平和替代率仍可由种群规模和突变率决定。理解 McDonald-Kreitman 检验（第 7 章）等所依据的期望取决于理解这一区别——不同类型的位点有不同的中性突变率。这似乎是比较基因组学研究中一种特别常见的混淆，这种研究旨在通过分析不受约束位点的替换率来估计没有选择的情况下的突变率。

• 它使人们认为不受约束的位点呈现出一种不受自然选择影响的核苷酸变异模式。这种混淆在人口统计学和系统地理学研究中很常见，在这些研究中，使用被认为不受直接选择的标记（例如微卫星、线粒体 D 环）导致研究人员认为他们正在研究不受选择影响的变异模式。相反，许多不受约束的基因座与受选择影响的基因座相关联这一事实离子意味着变异的水平和频率受选择的影响很大——并且可以是“非中性的”，因为它们不仅仅由突变漂移平衡驱动。不受约束的序列可能提供了检查突变过程的机会，而不受直接进化模型选择的阻碍（例如，Petrov，Lozovskaya和Hartl 1996），但这是数据的非常不同的用途。

•它使人们认为具有约束的基因或基因座始终是“非中性的”。我们将在本书中讨论许多中立性测试以及基因座可以中性（或非中性）进化的多种方式。但主要主题是我们几乎从未测试过负选择的作用——再次，这被假定作用于功能位点。相反，我们会问是否有证据表明存在正向选择、平衡选择或有害的分离多态性。中性进化的基因座不是没有负向选择而进化的基因座，而是没有证据表明存在这些替代选择形式之一的基因座。

• 它使人们认为具有 Ne s = 0 的分离多态性的基因座或大类突变没有受到选择。这类错误与上面描述的错误相反：如果我们估计当前多态性的选择（无论是非同义氨基酸、基因拷贝数变体还是转座因子）并发现它们都是中性的，一些研究人员错误地推断这些类型的任何突变都没有受到选择。显然，这种模式与中性理论的预期完全一致——中性理论认为我们观察到的多态性是中性的——但绝不意味着所有此类突变都是中性的。

=== 分子进化的替代模型 ===
如果中性理论无法解释当前的变异模式，那么什么可以解释呢？尽管对这个问题没有一致的答案，但我们至少可以开始考虑与数据一致的可能的替代模型。一个有用的起点可能不是可以解释数据的理论，而是可能不正确的替代模型。通过列举这些可能性，我们希望能够更好地了解一个好的理论是什么样子。

<u>一组几乎肯定是错误的相关模型是那些绝大多数多态性和替换都不是中性的</u>（即，它们<u>甚至与中性理论的弱版本不一致</u>）。这种类型有三种明显的模型。'''有害突变模型 deleterious mutation'''<u>认为，所有变异至少都具有轻微的有害性，并维持在突变选择平衡中。</u>多态性将由低频变异主导，物种间的所有替换将由少数能够固定的有害变异组成。'''有利突变模型advantageous mutation model''' 将假设有利突变不断涌入。在这个模型中，所有多态性（或至少是基因组中可能具有功能性位点的多态性）将代表适应性等位基因在固定过程中的变化，可能在种群中出现的频率很高。在这个模型中，物种间的所有替换都与有利等位基因的固定相对应。'''平衡突变模型balanced mutation model'''将提出在整个基因组中维持平衡的多态性。多态性将包括这些中频变异，替换由稀有的平衡等位基因组成，这些等位基因会漂移到固定状态。基于经验和理论依据，有许多理由怀疑这些模型中的每一个。

与当前数据基本一致的两个模型都认为选择对相关中性变异的影响起着重要作用（有关更多讨论，请参阅第 8 章）。虽然两者都没有达到通常伴随“理论”的理论结果和经验支持的临界质量，但两者都是完善的模型，可以提供有关分子变异的详细预测。'''背景选择模型 background selection model'''提出，必须从种群中去除的有害突变的不断涌入会降低链接位点的中性多态性。该模型与上面描述的有害突变模型不同，因为背景选择并不认为我们观察到的多态性本身是非中性的。尽管背景选择模型并不总是能很好地解释分化模式（Stephan 2010；但参见 McVicker 等人 2009），有害突变的普遍存在意味着它几乎肯定会影响所有基因组的变异水平(Charlesworth 2012)。搭便车模型（Maynard Smith 和 Haigh 1974；Kaplan、Hudson 和 Langley 1989）提出，有利等位基因的快速固定会降低链接位点的多态性。同样，该模型与有利突变模型完全不同，因为大多数多态性被认为是中性的；快速固定替换对链接中性多态性水平的影响是该模型的主要特征。此外，搭便车模型与在许多物种中观察到的高适应性替换率一致（Hahn 2008；Sella 等人 2009）。几乎可以肯定的是，背景选择和搭便车都在所有物种中起作用——尚待确定的是每个过程在基因组区域和物种之间的相对重要性。

最后，还值得简要提及'''分子进化的近中性理论nearly neutral theory of molecular evolution'''（Ohta 1972a、1972b），因为它通常被认为是中性理论的替代方案。近中性理论<u>假设存在大量略微有害（和/或略微有利）的突变，最初提出该理论是为了解释观察到的氨基酸替换率的意外恒定性（Ohta 1992）</u>。然而，现在已知氨基酸替换率在物种间差异很大，近中性理论无法解释观察到的基因组多样性水平的变化。虽然毫无疑问每代都会产生许多略微有害的突变，并且——正如近中性理论所预测的那样——蛋白质进化模式与种群规模的相关性较弱（Akashi、Osada 和 Ohta 2012），但该理论只能解释一小部分数据。

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第二十章 癌

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思源笔记

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第十九章 线虫动物：线虫动物门和线形动物门

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第十九章 线虫动物：线虫动物门和线形动物门

第五章 多孔动物门：海绵

第六章 溯祖

第三章 描述变异

第一章 进化的模型

第二十章癌

第十九章线虫动物：线虫动物门和线形动物门

第十九章线虫动物：线虫动物门和线形动物门

第五章多孔动物门：海绵

第六章溯祖

第三章描述变异

第一章进化的模型