电泳染色方法 - 版本历史

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2025-08-23T08:27:53Z

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第100行：		第100行：
	*适用于PVDF膜、硝酸纤维素膜，支持高盐/去污剂样本（如细胞裂解液），但是不支持尼龙膜，因为尼龙膜带正电会导致背景噪声过大。		*适用于PVDF膜、硝酸纤维素膜，支持高盐/去污剂样本（如细胞裂解液），但是不支持尼龙膜，因为尼龙膜带正电会导致背景噪声过大。
	*灵敏度较低，检测下限约 250 ng/条带，低于银染和荧光染色。		*灵敏度较低，检测下限约 250 ng/条带，低于银染和荧光染色。

			{{学科分类}}

			[[Category:生物技术]]

2025年4月28日 (一) 04:42 MangoCat

2025-04-28T04:42:51Z

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第21行：		第21行：
	*染色强度与蛋白质浓度并非完全线性关系，蛋白质定量受到一定限制。		*染色强度与蛋白质浓度并非完全线性关系，蛋白质定量受到一定限制。
	*对实验操作要求较高，试剂刺激性强。		*对实验操作要求较高，试剂刺激性强。
			*可能干扰后续质谱
	==考马斯亮蓝染色法==		==考马斯亮蓝染色法==
	===原理===		===原理===
第38行：		第39行：
	*相对灵敏，0.2μg-0.5μg/条带。		*相对灵敏，0.2μg-0.5μg/条带。
	*成本低。		*成本低。
			*永久性染色，不能继续进行印记分析。

	==荧光染色==		==荧光染色==
第44行：		第46行：
	===试剂（以SYPRO Ruby为例）===		===试剂（以SYPRO Ruby为例）===
	*SYPRO Ruby：染色剂，最大激发光波长300/420nm，最大发射光波长618nm。		*SYPRO Ruby：染色剂，最大激发光波长300/420nm，最大发射光波长618nm。
	*40%甲醇+10%~~乙酸：固定剂，用于去除SDS和固定蛋白质。~~		*40%甲醇+10%乙酸：固定剂，作用同上。
	*2%乙酸水溶液（或蒸馏水）：脱色剂，用于去除未结合的染料。		*2%乙酸水溶液（或蒸馏水）：脱色剂，用于去除未结合的染料。
	*2%甘油溶液：保存剂，用于长期保存凝胶（可维持6个月荧光信号稳定）。		*2%甘油溶液：保存剂，用于长期保存凝胶（可维持6个月荧光信号稳定）。
第67行：		第69行：
	*去离子水或0.1%乙酸：洗涤剂，去除多余金属离子。		*去离子水或0.1%乙酸：洗涤剂，去除多余金属离子。
	===实验步骤===		===实验步骤===
	*~~固定：同上。~~		*固定：将凝胶浸入固定液中室温摇动30分钟。
	*洗涤：倒掉固定液，加入去离子水覆盖凝胶，摇动洗涤2次，每次15分钟以洗去残留的固定液。		*洗涤：倒掉固定液，加入去离子水覆盖凝胶，摇动洗涤2次，每次15分钟以洗去残留的固定液。
	*预处理：加入咪唑-SDS溶液（体积为凝胶2倍），摇床孵育15分钟。		*预处理：加入咪唑-SDS溶液（体积为凝胶2倍），摇床孵育15分钟。
第80行：		第82行：
	*单独使用检测限1-10 ng，低于荧光染色和银染法，但是高于考马斯亮蓝染色。		*单独使用检测限1-10 ng，低于荧光染色和银染法，但是高于考马斯亮蓝染色。
	*对实验操作要求高，pH和离子浓度要求苛刻，重复性差。		*对实验操作要求高，pH和离子浓度要求苛刻，重复性差。
			==丽春红染色==
			===原理===
			丽春红是酸性染料，可以与带正电的氨基酸残基结合，也可以通过疏水相互作用与蛋白质的非极性区域结合。
			===试剂===
			*5%三氯乙酸：固定剂，作用同上。
			*丽春红S：染色剂。
			*5%醋酸或去离子水：脱色剂。
			*PBS或TPBS：完全脱色剂，脱去条带上的染料以用于后续印记分析。
			===实验步骤===
			*固定：转膜后，将PVDF/硝酸纤维素膜浸入含5% TCA的溶液中5分钟。
			*染色：将膜完全浸没于丽春红染色液中，室温摇床孵育 3-10分钟（视膜厚度调整）。
			*脱色：用去离子水或 5%醋酸溶液漂洗膜3次（每次1分钟），直至背景透明、条带清晰。
			*成像：在白光透射扫描仪（波长520-540 nm）下观察，拍照保存结果。
			===特点===
			*全程仅需10-15分钟，远快于考马斯亮蓝（3小时）和银染（4-6小时）。
			*染色后染料可完全洗脱，不干扰抗体结合（对比考马斯亮蓝的永久性染色）。
			*适用于PVDF膜、硝酸纤维素膜，支持高盐/去污剂样本（如细胞裂解液），但是不支持尼龙膜，因为尼龙膜带正电会导致背景噪声过大。
			*灵敏度较低，检测下限约 250 ng/条带，低于银染和荧光染色。

2025年4月27日 (日) 23:58 MangoCat

2025-04-27T23:58:11Z

@@ 第19行： / 第19行： @@
 *灵敏度极高，可以检出低丰度（<1ng）蛋白质。
 *染色结果和蛋白质氨基酸组成有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
 ==考马斯亮蓝染色法==
 ===原理===
@@ 第57行： / 第59行： @@
 *染色和保存全程需避光，防止荧光猝灭。
 *染色不影响后续质谱分析，无需额外脱色步骤。

MangoCat：/* 特点 */

2025-04-27T23:41:16Z

特点

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第34行：		第34行：
	*保存：将凝胶浸泡于1%乙酸中，4℃可保存1周。		*保存：将凝胶浸泡于1%乙酸中，4℃可保存1周。
	===特点===		===特点===
	*~~高度灵敏，0~~.2μg-0.5μg/条带。		*相对灵敏，0.2μg-0.5μg/条带。
	*成本低。		*成本低。

	==荧光染色==		==荧光染色==
	===原理===		===原理===

MangoCat：/* 荧光染色 */

2025-04-27T23:40:49Z

荧光染色

@@ 第39行： / 第39行： @@
 ===原理===
 荧光染料（如SYPRO Ruby、Deep Purple）通过疏水作用结合蛋白质，紫外激发下发光。
-===试剂===
+===试剂（以SYPRO Ruby为例）===

2025年4月27日 (日) 13:00 MangoCat

2025-04-27T13:00:57Z

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第34行：		第34行：
	*保存：将凝胶浸泡于1%乙酸中，4℃可保存1周。		*保存：将凝胶浸泡于1%乙酸中，4℃可保存1周。
	===特点===		===特点===
	*~~高度灵敏。~~		*高度灵敏，0.2μg-0.5μg/条带。
	*成本低。		*成本低。
			==荧光染色==
			===原理===
			荧光染料（如SYPRO Ruby、Deep Purple）通过疏水作用结合蛋白质，紫外激发下发光。
			===试剂===

MangoCat：创建页面，内容为“=蛋白质电泳染色= ==银染法== ===原理=== 碱性环境下,甲醛等还原剂将蛋白质上结合的银离子还原为单质银颗粒，从而显现出棕黑色。不过确切原理还不是很清楚。 ===试剂=== 乙醇、冰醋酸：固定剂,稳定凝胶中的蛋白质并去除杂质。乙酸钠、硫代硫酸钠：致敏剂，使得银离子更容易结合在凝胶上。硝酸银溶液：提供银离子。甲醛溶液、碳酸钠：显色…”

2025-04-27T09:58:29Z

创建页面，内容为“=蛋白质电泳染色= ==银染法== ===原理=== 碱性环境下,甲醛等还原剂将蛋白质上结合的银离子还原为单质银颗粒，从而显现出棕黑色。不过确切原理还不是很清楚。 ===试剂=== *乙醇、冰醋酸：固定剂,稳定凝胶中的蛋白质并去除杂质。 *乙酸钠、硫代硫酸钠：致敏剂，使得银离子更容易结合在凝胶上。 *硝酸银溶液：提供银离子。 *甲醛溶液、碳酸钠：显色…”

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=蛋白质电泳染色=
==银染法==
===原理===
碱性环境下,甲醛等还原剂将蛋白质上结合的银离子还原为单质银颗粒，从而显现出棕黑色。不过确切原理还不是很清楚。
===试剂===
*乙醇、冰醋酸：固定剂,稳定凝胶中的蛋白质并去除杂质。
*乙酸钠、硫代硫酸钠：致敏剂，使得银离子更容易结合在凝胶上。
*硝酸银溶液：提供银离子。
*甲醛溶液、碳酸钠：显色剂，碳酸钠提供碱性环境，甲醛还原银离子。
*EDTA、甘氨酸溶液：终止液：终止显色反应。
===实验步骤===
*固定‌：使用含有乙醇和冰醋酸的固定液处理凝胶。
*致敏‌：加入乙酸钠和硫代硫酸钠。
*洗涤‌：使用纯水洗涤凝胶，去除多余的试剂。
*染色‌：将凝胶浸泡在含有硝酸银和甲醛的显色剂中进行反应。
*显色‌：显色剂使银离子还原成金属银，形成可见的染色效果，应当为棕黑色条带。
*终止‌：使用终止液停止显色反应，并固定染色结果。
===特点===
*灵敏度极高，可以检出低丰度（<1ng）蛋白质。
*染色结果和蛋白质氨基酸组成有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
==考马斯亮蓝染色法==
===原理===
考马斯亮蓝R-250分子中的芳香环可以通过范德华力与疏水氨基酸残基结合，而磺酸基则通过静电作用与带正电的氨基酸残基结合。游离状态下呈红色而与蛋白质结合后呈蓝色。
[[文件:考马斯亮蓝R-250和考马斯亮蓝G-250的分子结构.jpg|缩略图|考马斯亮蓝R-250和考马斯亮蓝G-250的分子结构]]
===试剂===
*50%甲醇+10%冰醋酸：固定剂，固定蛋白质，去除SDS和盐。
*0.1%考马斯亮蓝R-250+50%甲醇+10%冰醋酸：染色剂，显色。
*40%甲醇+10%冰醋酸：脱色剂，去除未结合染料，降低背景噪声。
*1%乙酸：保存剂，防止凝胶干燥和条带褪色。
===实验步骤===
*固定：将凝胶浸泡于固定液中，室温摇动30分钟至过夜。
*染色：倒弃固定液，加入染色液（液面需完全覆盖凝胶），室温摇床震荡染色12小时（或微波加热至95℃加速至20分钟，避免沸腾）。
*脱色：弃染色液，加入脱色液震荡脱色；每30分钟更换脱色液，直至背景透明（通常需3~4次）；若需低背景，可用纯水脱色过夜。
*保存：将凝胶浸泡于1%乙酸中，4℃可保存1周。
===特点===
*高度灵敏。
*成本低。