2026年3月1日 (日) 12:42 彧

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	cryo-EM 的飞速发展得益于许多技术的联合应用，包括在玻璃冰中进行样品制备/保存、电子光学、可增强电子图像对比度的相位板、电子检测器、改进的数据处理软件以及更快的计算机。在超大分子的组装研究中，越来越多地将 cryo-EM 数据与 X 射线晶体衍射，NMR 波谱，质谱，化学交联，荧光共振能量转移和各种计算技术相融合。事实证明，集成化的研究技术对多种分子结构(如核糖体、tRNA、蛋白因子、肌球蛋白)的研究非常有用。		cryo-EM 的飞速发展得益于许多技术的联合应用，包括在玻璃冰中进行样品制备/保存、电子光学、可增强电子图像对比度的相位板、电子检测器、改进的数据处理软件以及更快的计算机。在超大分子的组装研究中，越来越多地将 cryo-EM 数据与 X 射线晶体衍射，NMR 波谱，质谱，化学交联，荧光共振能量转移和各种计算技术相融合。事实证明，集成化的研究技术对多种分子结构(如核糖体、tRNA、蛋白因子、肌球蛋白)的研究非常有用。

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彧：创建页面，内容为“目前为止，能看到准确蛋白结构的，主要只有三种方法: 1. X 射线晶体衍射(X-ray crystallography) 2. 冷冻电镜(cryo-EM) 3. 核磁共振(NMR) 这三者的区别主要是: 1. NMR 可以看到蛋白的动力学，但只能看小蛋白。 2. EM 电镜能看很大的蛋白复合物，但是看不了小蛋白，而且(2013 年以前)分辨率低，看不太清楚，2020 年分辨率已达到原子级别。 …”

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创建页面，内容为“目前为止，能看到准确蛋白结构的，主要只有三种方法: 1. X 射线晶体衍射(X-ray crystallography) 2. 冷冻电镜(cryo-EM) 3. 核磁共振(NMR) 这三者的区别主要是: 1. NMR 可以看到蛋白的动力学，但只能看小蛋白。 2. EM 电镜能看很大的蛋白复合物，但是看不了小蛋白，而且(2013 年以前)分辨率低，看不太清楚，2020 年分辨率已达到原子级别。 …”

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目前为止，能看到准确蛋白结构的，主要只有三种方法:

1. X 射线晶体衍射(X-ray crystallography)

2. 冷冻电镜(cryo-EM)

3. 核磁共振(NMR)

这三者的区别主要是:

1. NMR 可以看到蛋白的动力学，但只能看小蛋白。

2. EM 电镜能看很大的蛋白复合物，但是看不了小蛋白，而且(2013 年以前)分辨率低，看不太清楚，2020 年分辨率已达到原子级别。

3. X-ray 晶体结构解析，大小都能看，而且(理论上)可以看得特别清楚，但结晶困难，尤其是膜蛋白(程亦凡-离子通道蛋白结构解析依靠的是冷冻电镜)和蛋白复合体(施一公-pre-mRNA 剪接体复合物结构解析依靠的也是冷冻电镜)。

通常通过 X 射线晶体衍射获得蛋白质晶体的衍射图案，通过核磁共振谱获得蛋白质的的局部构造信息和相邻原子之间的距离，通过电子显微镜获取分子的整体形状。但在大多数情况下，这些实验数据并不足以支持研究人员从头开始构建蛋白质的原子模型，因此，最终还需要结合氨基酸的序列、蛋白质的典型几何结构(键长和键角)等信息，才能绘制出蛋白质的原子结构模型。

下面具体介绍三种技术:

'''1. X 射线晶体衍射'''

PDB 中绝大多数结构的获得都使用了 X 射线晶体衍射技术，其步骤包括:

(1)将蛋白质提纯、结晶;

(2)使用高强度的 X 射线照射晶体，晶体中的蛋白质就可以将 X 射线光束衍射成多种图案形状，通过长期以来建立的分析方法，就可以分析出蛋白质的电子分布。通过对电子分布的研究，确定每个原子的位置。PDB 网站上提供两种类型的晶体结构数据，坐标文件包含了最终模型上每个原子的位置，数据文件则包含了用于确定结构信息的实验参数( 衍射图案中 X 射线斑点的强度和相位 )。

X 射线晶体衍射可以提供非常详细的原子信息，显示蛋白质或核酸中的每个原子，以及晶体中的配体、抑制剂、离子和其他分子的原子细节。但是，在结晶方面的困难限制了 X 射线晶体衍射方法在蛋白质结构研究中的应用。晶体学研究依赖于其中的大量分子以相同的取向排列，在结晶之后，刚性蛋白质分子会以相同的取向排列形成晶体，很适合使用 X 射线晶体衍射对其进行研究。但是，蛋白质中的柔性部分在晶体中往往采取不同的取向排列，导致这部分结构信息在最终的电子密度图中不可见，因此这部分结构信息也就无法解析。

另外，结晶后的晶体质量越高，获得原子模型的准确度也是越高。目前使用分辨率和 R 值(反应原子模型和实验数据的匹配程度)来描述原子模型的准确性。使用 X 射线自由电子激光器探索生物学结构和功能是一种新兴的技术。连续飞秒晶体衍射技术作为一种新技术彻底变革了 X 射线晶体衍射技术。自由电子 X 射线激光器用于创造飞秒级别的超强脉冲辐射，这可以帮助研究人员研究极短时间内的分子过程，例如生物发色团对光的瞬时吸收。

''' 2. 核磁共振波谱'''

核磁共振法确定蛋白质结构的一般步骤:纯化蛋白质，放置到强磁场中，然后用射频信号进行探测。观测到的共振信号可以反映相邻原子核之间的相互作用和成键原子之间的局部构象。汇总后得到的约束列表可以用来构建蛋白质原子模型。但由于大型蛋白质在 NMR 谱中存在重叠峰的问题，所以目前该技术仅限于小型或中型蛋白质的研究。

核磁共振法研究蛋白质结构的一大优势是:可以研究溶液中的蛋白质结构信息，因此 NMR 可以更好地反映出蛋白质在生理状态下的结构信息。上面介绍的 X 射线晶体衍射技术不能确认柔性蛋白质的结构信息，但 NMR 却非常适合柔性蛋白质的研究。

PDB 文件常常以两种方式来表示核磁共振结构。一种是在文件中包括所有的系综结构;另一种则只包含一个能量最低的平均结构。这些文件试图根据不同观察结果捕获分子的平均特性。您还可以找到由 NMR 实验确定的约束列表，其中包括氢键和二硫键，相邻氢原子之间的距离以及对链的局部构象和立体化学的限制。

''' 3. cryo-EM'''

3D 电子显微镜也被用于研究大分子组装体的 3D 结构。使用电子束和电子透镜系统直接对生物大分子进行成像研究，目前使用最多的设备是 cryo-EM。就分子和原子的细节而言，单粒子 3DEM 和电子衍射方法现在都可以产生分辨率与大分子晶体学相当的结构(例如可视化氨基酸侧链，表面水分子和非共价键合的配体)。低温电子断层扫描提供结构信息的分辨率较低(即蛋白质结构域和二级结构)。在 2016 年的统计中，PDB 库中 3DEM 结构信息首次超过了 NMR 谱的信息。

cryo-EM 的飞速发展得益于许多技术的联合应用，包括在玻璃冰中进行样品制备/保存、电子光学、可增强电子图像对比度的相位板、电子检测器、改进的数据处理软件以及更快的计算机。在超大分子的组装研究中，越来越多地将 cryo-EM 数据与 X 射线晶体衍射，NMR 波谱，质谱，化学交联，荧光共振能量转移和各种计算技术相融合。事实证明，集成化的研究技术对多种分子结构(如核糖体、tRNA、蛋白因子、肌球蛋白)的研究非常有用。

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