CRISPR-Cas系统及相关技术 - 版本历史

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			{{学科分类}}

			[[Category:生物技术]]

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2025年5月12日 (一) 12:32 Kotodama

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			== CRISPR Cas13 技术——靶向RNA的CRISPR Cas ==

			CRISPR-Cas13 是一种以 RNA 为靶标的 CRISPR 系统，属于 CRISPR Class 2 Type VI 类别。该系统不同于 Cas9 等针对 DNA 的编辑工具，其功能在于特异性识别并切割单链 RNA，具有 RNA 靶向干扰、RNA 可视化、分子诊断和 RNA 编辑等多种生物技术应用前景。

			=== 基本原理 ===

			Cas13 系统的核心为 Cas13 蛋白和引导 RNA（crRNA）。Cas13 可与 crRNA 形成复合物，识别具有互补序列的目标 RNA。在结合目标 RNA 后，Cas13 被激活，展现出两种活性：

			* 特异性切割：精准切割目标 RNA 分子
			* 非特异性胶合切割（collateral cleavage）：激活状态下，Cas13 还会切割周围无关 RNA，形成“胶合剪切”效应，可用于信号放大等用途

			与 DNA 靶向系统如 Cas9 不同，Cas13 不依赖 PAM序列，使其靶标选择更灵活。

			=== Cas13 亚型 ===

			Cas13 蛋白家族包括多个亚型，各自具有不同来源和特性：

			* Cas13a（原名 C2c2）：最早发现，具有典型的胶合切割特性
			* Cas13b：靶向准确性更高，活性较强
			* Cas13c：研究较少，靶向宽容度较大
			* Cas13d：分子量较小，适合病毒载体包装，常用于体内应用
			* Cas13X/Y：新近发现，体积更小，适用于合成生物系统

			=== 工作机制 ===

			# crRNA 被设计为包含目标 RNA 的互补序列
			# crRNA 与 Cas13 蛋白结合，形成识别复合物
			# 复合物与目标 RNA 配对后，Cas13 被激活
			# 激活的 Cas13 对目标 RNA 进行精确切割，并同时触发胶合切割，对周围 RNA 造成降解

			=== 应用场景 ===

			==== RNA 靶向干扰 ====

			Cas13 可被用作精准 RNA 降解工具，用于研究基因功能或抑制特定 mRNA、lncRNA 等。相比传统 RNAi 技术，Cas13 更具特异性，且不依赖宿主细胞的 RNA 干扰通路。

			==== RNA 可视化 ====

			通过与荧光标签蛋白（如 GFP）融合，可实现对特定 RNA 分子的活细胞成像，用于观察 RNA 定位和时空表达。

			==== 分子诊断（SHERLOCK） ====

			Cas13 的胶合切割特性被应用于 SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）系统。在靶标 RNA 存在时，Cas13 被激活，切割人工设计的荧光探针，从而实现疾病 RNA 检测，如 SARS-CoV-2、寨卡病毒等。该系统灵敏度高、速度快、可用于便携诊断。

			==== RNA 编辑（REPAIR 系统） ====

			通过去活化 Cas13 切割能力并与腺苷脱氨酶（ADAR）融合，可实现 A→I 的可逆 RNA 编辑。该方法不涉及基因组永久变更，适用于需要暂时性基因调控的治疗策略。


	<references />		<references />

2025年5月9日 (五) 08:03 Kotodama

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第24行：		第24行：
	* 整个CRISPR阵列被转录为一条长的pre-crRNA（前体CRISPR RNA）。		* 整个CRISPR阵列被转录为一条长的pre-crRNA（前体CRISPR RNA）。
	* 加工方式因系统类型不同而异：		* 加工方式因系统类型不同而异：
	: ~~I类与III类系统：~~		: I类与III类系统：Cas6或其他内切酶（如Cas3）识别重复序列并剪切，生成多个成熟的crRNA，每条含一个间隔序列及部分重复序列。
	:~~: Cas6或其他内切酶（如Cas3）识别重复序列并剪切，生成多个成熟的crRNA，每条含一个间隔序列及部分重复序列。~~		: II类系统：缺乏Cas6，依赖tracrRNA（转录激活的crRNA）与重复序列互补配对。形成双链结构后由RNA酶III加工成成熟的crRNA，通常丢失约10个核苷酸。
	~~: II类系统：~~
	~~:: 缺乏Cas6，依赖tracrRNA（转录激活的crRNA）与重复序列互补配对。形成双链结构后由RNA酶III加工成成熟的crRNA，通常丢失约10个核苷酸。~~

	==== （3）外源核酸的识别与降解 ====		==== （3）外源核酸的识别与降解 ====

2025年5月9日 (五) 08:02 Kotodama

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	:: Cas6或其他内切酶（如Cas3）识别重复序列并剪切，生成多个成熟的crRNA，每条含一个间隔序列及部分重复序列。		:: Cas6或其他内切酶（如Cas3）识别重复序列并剪切，生成多个成熟的crRNA，每条含一个间隔序列及部分重复序列。
	: II类系统：		: II类系统：
	:: ~~缺乏Cas6，依赖tracrRNA（转录激活的crRNA）与重复序列互补配对。形成双链结构后由RNA酶III加工成成熟的crRNA，通常丢失约10个核苷酸。~~		:: 缺乏Cas6，依赖tracrRNA（转录激活的crRNA）与重复序列互补配对。形成双链结构后由RNA酶III加工成成熟的crRNA，通常丢失约10个核苷酸。

	==== （3）外源核酸的识别与降解 ====		==== （3）外源核酸的识别与降解 ====
第85行：		第85行：
	由于不引发DNA断裂，dCas9 被认为具有高度安全性，适合在活细胞或复杂组织中进行非破坏性调控。		由于不引发DNA断裂，dCas9 被认为具有高度安全性，适合在活细胞或复杂组织中进行非破坏性调控。

	=== ~~Cas9n（nickase Cas9，单链切口酶）~~ ===		=== Cas9n（Cas9 nickase，单链切口酶） ===

	Cas9n 是指通过突变使 Cas9 仅保留一个内切酶活性的变体，只能在 DNA 的一条链上造成单链切口（nick），而非双链断裂。根据保留的结构域不同，可分为：		Cas9n 是指通过突变使 Cas9 仅保留一个内切酶活性的变体，只能在 DNA 的一条链上造成单链切口（nick），而非双链断裂。根据保留的结构域不同，可分为：
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	=== 先导编辑 Prime Editing ===		=== <ref>除PE部分外，其余部分由Kotodama编辑</ref>先导编辑 Prime Editing ===

	先导编辑（Prime Editing）是一种无需产生DNA双链断裂（DSB）的高级定点基因编辑技术。其核心组件包括：		先导编辑（Prime Editing）是一种无需产生DNA双链断裂（DSB）的高级定点基因编辑技术。其核心组件包括：
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	[[文件:Primer Editing.png\|830x830像素]]		[[文件:Primer Editing.png\|830x830像素]]

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2025年5月9日 (五) 07:46 Kotodama

2025-05-09T07:46:50Z

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第85行：		第85行：
	由于不引发DNA断裂，dCas9 被认为具有高度安全性，适合在活细胞或复杂组织中进行非破坏性调控。		由于不引发DNA断裂，dCas9 被认为具有高度安全性，适合在活细胞或复杂组织中进行非破坏性调控。

	=== ~~nCas9（nickase~~ Cas9，单链切口酶） ===		=== Cas9n（nickase Cas9，单链切口酶） ===

	~~nCas9~~ 是指通过突变使 Cas9 仅保留一个内切酶活性的变体，只能在 DNA 的一条链上造成单链切口（nick），而非双链断裂。根据保留的结构域不同，可分为：		Cas9n 是指通过突变使 Cas9 仅保留一个内切酶活性的变体，只能在 DNA 的一条链上造成单链切口（nick），而非双链断裂。根据保留的结构域不同，可分为：

	* D10A 突变：RuvC结构域失活，HNH结构域保留，切割互补链（target strand）		* D10A 突变：RuvC结构域失活，HNH结构域保留，切割互补链（target strand）
	* H840A 突变：HNH结构域失活，RuvC结构域保留，切割非互补链（non-target strand）		* H840A 突变：HNH结构域失活，RuvC结构域保留，切割非互补链（non-target strand）

	~~nCas9~~ 的应用包括：		Cas9n 的应用包括：

	* 碱基编辑（Base ~~Editing）：nCas9~~ 融合脱氨酶（如APOBEC、TadA），在不造成DSB的前提下，实现碱基间的C→T或A→G转换。		* 碱基编辑（Base Editing）：Cas9n 融合脱氨酶（如APOBEC、TadA），在不造成DSB的前提下，实现碱基间的C→T或A→G转换。
	* 先导编辑（Prime ~~Editing）：nCas9~~ 融合逆转录酶（RT），与pegRNA配合，实现在基因组中特定位点的插入、缺失或精确突变。		* 先导编辑（Prime Editing）：Cas9n 融合逆转录酶（RT），与pegRNA配合，实现在基因组中特定位点的插入、缺失或精确突变。
	* ~~降低脱靶效应：相较于野生型Cas9的双链断裂，nCas9引发的单链切口对基因组稳定性影响更小，更安全。~~		* 降低脱靶效应：相较于野生型Cas9的双链断裂，Cas9n引发的单链切口对基因组稳定性影响更小，更安全。

	~~nCas9~~ 保留一定的编辑活性，同时具备更高的编辑精度和较低的毒性，是精准基因治疗的重要工具。		Cas9n 保留一定的编辑活性，同时具备更高的编辑精度和较低的毒性，是精准基因治疗的重要工具。

	== CRISPR Cas9 及其变体可以完成的技术 ==		== CRISPR Cas9 及其变体可以完成的技术 ==
第110行：		第110行：
	\| 表观调控 \|\| CRISPRi / CRISPRa via dCas9 \|\| 使用失活的Cas9（dCas9），无核酸酶活性，仅结合靶DNA，通过阻断转录或招募转录激活因子实现基因表达调控。		\| 表观调控 \|\| CRISPRi / CRISPRa via dCas9 \|\| 使用失活的Cas9（dCas9），无核酸酶活性，仅结合靶DNA，通过阻断转录或招募转录激活因子实现基因表达调控。
	\|-		\|-
	\| 碱基编辑 \|\| Base Editing, BE \|\| ~~dCas9或nCas9与脱氨酶融合，无需造成双链断裂，可实现单个碱基的精准转换（如C→T或A→G）。~~		\| 碱基编辑 \|\| Base Editing, BE \|\| dCas9或Cas9n与脱氨酶融合，无需造成双链断裂，可实现单个碱基的精准转换（如C→T或A→G）。
	\|-		\|-
	\| 先导编辑 \|\| Prime Editing, PE \|\| ~~基于nCas9、逆转录酶（RT）和pegRNA三元系统，可实现插入、删除和多种碱基替换，无需双链断裂或供体模板。~~		\| 先导编辑 \|\| Prime Editing, PE \|\| 基于Cas9n、逆转录酶（RT）和pegRNA三元系统，可实现插入、删除和多种碱基替换，无需双链断裂或供体模板。
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2025年5月9日 (五) 07:45 Kotodama

2025-05-09T07:45:06Z

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	* 非同源末端连接（NHEJ）：		* 非同源末端连接（NHEJ）：
	: 是一种快速但低保真的修复机制，常引入碱基缺失或插入（indels），可导致移码突变或基因功能丧失。适用于基因敲除或非精确修复。		: 是一种快速但低保真的修复机制，常引入碱基缺失或插入（indels），可导致移码突变或基因功能丧失。适用于基因敲除或非精确修复。

	* 同源重组修复（HDR）：		* 同源重组修复（HDR）：
	: 需提供一段外源同源模板（donor DNA），可用于高精度地插入、替换或修复基因。效率相对较低，但精确性更高，常用于治疗性基因编辑和疾病模型构建。		: 需提供一段外源同源模板（donor DNA），可用于高精度地插入、替换或修复基因。效率相对较低，但精确性更高，常用于治疗性基因编辑和疾病模型构建。

2025年5月9日 (五) 07:40 Kotodama

2025-05-09T07:40:22Z

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第37行：		第37行：

	CRISPR-Cas9是一种源于细菌的Type II类CRISPR系统，具有可编程的DNA编辑能力。其核心机制依赖于Cas9蛋白与sgRNA形成的复合体识别靶DNA，并进行双链断裂。该技术因其简洁、高效、特异性强，被广泛应用于基因编辑、功能基因筛选和治疗研究中。		CRISPR-Cas9是一种源于细菌的Type II类CRISPR系统，具有可编程的DNA编辑能力。其核心机制依赖于Cas9蛋白与sgRNA形成的复合体识别靶DNA，并进行双链断裂。该技术因其简洁、高效、特异性强，被广泛应用于基因编辑、功能基因筛选和治疗研究中。

			[[文件:CRISPR-Cas9.png\|830x830像素]]

	==== （1）Cas9蛋白结构与功能 ====		==== （1）Cas9蛋白结构与功能 ====

2025年5月9日 (五) 07:37 Kotodama

2025-05-09T07:37:42Z

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