Sanger测序:修订间差异

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创建页面,内容为“Sanger测序,也称为双脱氧链终止法,是一种广泛使用的DNA测序技术。这项技术由英国生物化学家弗雷德里克·桑格(Frederick Sanger)于1977年发明,并因其高准确性和可靠性,成为基因检测的金标准。以下是对Sanger测序的详细介绍: - **基本原理**Sanger测序基于DNA复制的原理,通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。 - 测序反应体系中包括目标DNA片…”
 
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Sanger测序,也称为双脱氧链终止法,是一种广泛使用的DNA测序技术。这项技术由英国生物化学家弗雷德里克·桑格(Frederick Sanger)于1977年发明,并因其高准确性和可靠性,成为基因检测的金标准。以下是对Sanger测序的详细介绍:
Sanger测序即双脱氧链终止法、一代测序技术。


- **基本原理**Sanger测序基于DNA复制的原理,通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。 - 测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、测序引物和DNA聚合酶。
在HGP中被广泛使用。


- ddNTP由于缺少3'-OH基团,无法与下一个dNTP形成磷酸二酯键,导致DNA链在特定位置终止。
== 基本原理 ==
Sanger测序基于DNA复制的原理,通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。


- 每个反应体系中加入不同类型的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP),使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止,形成一系列不同长度的DNA片段。
测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、引物和DNA聚合酶。


- **反应过程**
* ddNTP由于缺少3'-OH基团,无法与下一个dNTP形成磷酸二酯键,导致DNA链在此位置终止,ddNTP成为该肽段的末端。
* 向体系中加入不同类型的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP),使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止,形成一系列不同长度的DNA片段。


- **构建反应系统**
== 反应过程 ==


- 每个反应体系包含四种dNTP,用于正常DNA合成。<nowiki><cite>5</cite></nowiki>
=== 构建反应系统 ===
每个反应体系包含四种dNTP,用于正常DNA合成。


- 每个反应体系加入一种特定的ddNTP,使其在特定碱基处终止DNA链。
每个反应体系加入一种特定的ddNTP,使其在特定碱基处终止DNA链。


- 为了方便定位,ddNTP通常会被荧光或同位素标记。
为了方便定位,ddNTP通常会被荧光或同位素标记。


- 反应体系还包括目标DNA片段、DNA聚合酶和引物。
反应体系还包括目标DNA片段、DNA聚合酶和引物。


- **扩增目的片段**以目标DNA片段为模板,在DNA聚合酶的催化下,从引物处开始复制DNA。
=== 扩增目的片段 ===
以目标DNA片段为模板,在DNA聚合酶的催化下,从引物处开始复制DNA。


- 当遇到ddNTP时,反应停止,产生一系列具有共同起始点但不同终止点的DNA片段。
当遇到ddNTP时,反应停止,产生一系列具有共同起始点但不同终止点的DNA片段。


- 通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度,可以控制链终止的位置和频率。
通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度,可以控制链终止的位置和频率。


- **凝胶电泳**
=== 电泳 ===
通过电泳将不同长度的DNA片段分开。


- 使用高分辨率变性丙烯酰胺凝胶电泳将不同长度的DNA片段分开。
一般有四个泳道,每个泳道对应一种碱基(A、G、C、T)。


- 凝胶电泳有四个泳道,每个泳道对应一种碱基(A、G、C、T)。<nowiki><cite>5</cite></nowiki>
电泳结束后,通过放射自显影或紫外显影读取凝胶影像,确定每个片段的终止位置。


- 电泳结束后,通过放射自显影或紫外显影读取凝胶影像,确定每个片段的终止位置。
从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列,从而推知待测模板链的序列。


- 从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列,从而推知待测模板链的序列。
== 应用实例 ==


- **应用实例**
=== 乙型肝炎病毒耐药基因突变检测 ===
一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒(HBV)DNA拷贝数大于1k的患者血清进行测序。


- **乙型肝炎病毒耐药基因突变检测**
结果显示,40例(18.6%)患者检测到耐药基因突变,其中21例(9.77%)具有对应参考价值。<nowiki><cite>2</cite></nowiki>


- 一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒(HBV)DNA拷贝数大于10^3的患者血清进行测序。
研究还发现,LAM药物(拉米夫定)的耐药发生率较高,为9.77%。


- 结果显示,40例(18.6%)患者检测到耐药基因突变,其中21例(9.77%)具有对应参考价值。<nowiki><cite>2</cite></nowiki>
=== 肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测 ===
一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的CDA基因突变情况。


- 研究还发现,LAM药物(拉米夫定)的耐药发生率较高,为9.77%。
检测成功率高达98.04%,敏感度和特异度分别为92.50%和99.52%。


- **肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测**
=== 胶质瘤IDH突变检测 ===
一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。


- 一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的CDA基因突变情况。
结果显示,237例(35.9%)样本检测到IDH1基因突变,9例(1.4%)样本检测到IDH2基因突变。


- 检测成功率高达98.04%,敏感度和特异度分别为92.50%和99.52%。
IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸,最常见的突变类型是IDH1R132H,占总突变的94%。


- 研究表明,Sanger测序法可以有效地检测CDA基因突变,为临床用药提供参考。
=== 感音神经性聋患者常见聋病基因检测 ===
一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。


- **胶质瘤IDH突变检测**
研究选择了GJB2基因的第二个外显子、SLC26A4基因的p8和p18两个外显子、mtDNA的两个常见突变位点进行测序。


- 一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。
== 优势和局限性 ==


- 结果显示,237例(35.9%)样本检测到IDH1基因突变,9例(1.4%)样本检测到IDH2基因突变。
=== 优势 ===
高准确性: Sanger测序法的准确率非常高,通常在99.99%左右。


- IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸,最常见的突变类型是IDH1R132H,占总突变的94%。
长读长: 可以产生超过500个核苷酸的读长,适用于较长的DNA片段测序。


- **感音神经性聋患者常见聋病基因检测**
广泛使用: 由于其可靠性和准确性,Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。


- 一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。
=== 局限性 ===
成本较高: 对于大规模、自动化基因组分析,Sanger测序的成本较高。


- 研究选择了GJB2基因的第二个外显子、SLC26A4基因的p8和p18两个外显子、mtDNA的两个常见突变位点进行测序。
通量较低: 相比于下一代测序技术(如Illumina),Sanger测序的通量较低,不适合处理大量样本。


- 结果显示,Sanger测序法可以成功检测这些基因的突变,为临床诊断提供依据。
灵敏度限制: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上,这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。


- **优势和局限性**
== 与其他技术的比较 ==


- **优势**
=== 焦磷酸测序法 ===
焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术,与Sanger测序法相比,焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。


- **高准确性**: Sanger测序法的准确率非常高,通常在99.99%左右。
例如,一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用,结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。


- **长读长**: 可以产生超过500个核苷酸的读长,适用于较长的DNA片段测序。
=== ADx-ARMS法 ===
ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术,具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。


- **广泛使用**: 由于其可靠性和准确性,Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。
一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用,结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法(51.0% vs 25.3%)。


- **局限性**
=== 蓝白斑筛选联合Sanger测序技术 ===
通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度,达到千分之一的水平。


- **成本较高**: 对于大规模、自动化基因组分析,Sanger测序的成本较高。
该技术操作简便,成本低廉,适合在基层医院推广,可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测,提供预后信息。
 
- **通量较低**: 相比于下一代测序技术(如Illumina),Sanger测序的通量较低,不适合处理大量样本。
 
- **灵敏度限制**: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上,这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。
 
- **与其他技术的比较**
 
- **焦磷酸测序法**
 
- 焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术,与Sanger测序法相比,焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。
 
- 例如,一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用,结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。
 
- **ADx-ARMS法**
 
- ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术,具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。
 
- 一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用,结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法(51.0% vs 25.3%)。
 
- **蓝白斑筛选联合Sanger测序技术**
 
- 通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度,达到千分之一的水平。
 
- 该技术操作简便,成本低廉,适合在基层医院推广,可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测,提供预后信息。

2025年1月24日 (五) 14:35的最新版本

Sanger测序即双脱氧链终止法、一代测序技术。

在HGP中被广泛使用。

基本原理

Sanger测序基于DNA复制的原理,通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。

测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、引物和DNA聚合酶。

  • ddNTP由于缺少3'-OH基团,无法与下一个dNTP形成磷酸二酯键,导致DNA链在此位置终止,ddNTP成为该肽段的末端。
  • 向体系中加入不同类型的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP),使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止,形成一系列不同长度的DNA片段。

反应过程

构建反应系统

每个反应体系包含四种dNTP,用于正常DNA合成。

每个反应体系加入一种特定的ddNTP,使其在特定碱基处终止DNA链。

为了方便定位,ddNTP通常会被荧光或同位素标记。

反应体系还包括目标DNA片段、DNA聚合酶和引物。

扩增目的片段

以目标DNA片段为模板,在DNA聚合酶的催化下,从引物处开始复制DNA。

当遇到ddNTP时,反应停止,产生一系列具有共同起始点但不同终止点的DNA片段。

通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度,可以控制链终止的位置和频率。

电泳

通过电泳将不同长度的DNA片段分开。

一般有四个泳道,每个泳道对应一种碱基(A、G、C、T)。

电泳结束后,通过放射自显影或紫外显影读取凝胶影像,确定每个片段的终止位置。

从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列,从而推知待测模板链的序列。

应用实例

乙型肝炎病毒耐药基因突变检测

一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒(HBV)DNA拷贝数大于1k的患者血清进行测序。

结果显示,40例(18.6%)患者检测到耐药基因突变,其中21例(9.77%)具有对应参考价值。<cite>2</cite>

研究还发现,LAM药物(拉米夫定)的耐药发生率较高,为9.77%。

肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测

一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的CDA基因突变情况。

检测成功率高达98.04%,敏感度和特异度分别为92.50%和99.52%。

胶质瘤IDH突变检测

一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。

结果显示,237例(35.9%)样本检测到IDH1基因突变,9例(1.4%)样本检测到IDH2基因突变。

IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸,最常见的突变类型是IDH1R132H,占总突变的94%。

感音神经性聋患者常见聋病基因检测

一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。

研究选择了GJB2基因的第二个外显子、SLC26A4基因的p8和p18两个外显子、mtDNA的两个常见突变位点进行测序。

优势和局限性

优势

高准确性: Sanger测序法的准确率非常高,通常在99.99%左右。

长读长: 可以产生超过500个核苷酸的读长,适用于较长的DNA片段测序。

广泛使用: 由于其可靠性和准确性,Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。

局限性

成本较高: 对于大规模、自动化基因组分析,Sanger测序的成本较高。

通量较低: 相比于下一代测序技术(如Illumina),Sanger测序的通量较低,不适合处理大量样本。

灵敏度限制: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上,这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。

与其他技术的比较

焦磷酸测序法

焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术,与Sanger测序法相比,焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。

例如,一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用,结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。

ADx-ARMS法

ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术,具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。

一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用,结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法(51.0% vs 25.3%)。

蓝白斑筛选联合Sanger测序技术

通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度,达到千分之一的水平。

该技术操作简便,成本低廉,适合在基层医院推广,可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测,提供预后信息。