讨论:跨膜运输蛋白

总论

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图1：各类物质自由跨膜能力

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图2：细胞内外的离子浓度

• 各类物质自由跨膜的情况如图1所示。
• 细胞内外的离子浓度如图2所示。
• 细胞内的所有膜上都有跨膜运输器（Membrane Transporter）帮助难以跨膜的物质通过。
• 大部分跨膜运输器是蛋白质，少部分是缩酚肽（Depsipeptide）或其它物质。
• 所有跨膜运输蛋白都是多次跨膜蛋白（Multipass Transmembrane Protein）。
• TCDB数据库（全称Transporter Classification Database）收录各种跨膜运输蛋白的资料。
• TCDB对跨膜运输器的分类：
  1. 协助运输（利用被运输物质自身的电化学势能）；
  2. 初级主动运输：
     1. 利用高能磷酸键；
     2. 利用脱羧反应；
     3. 利用转甲基反应；
     4. 利用氧化还原反应；
     5. 利用光能；
  3. 利用另一种物质的电化学势能；
  4. 基团转移体；
  5. 电子转移蛋白。
• 大多数使用化学能的跨膜运输器可以反向运行，即把被运输物质的电化学梯度转化为化学能。

协助运输蛋白

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图3：水孔蛋白

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图4：Nernst方程

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图5：Goldman方程

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图6：细菌K⁺通道的结构

• 协助运输蛋白又叫通道（Channel）。

水孔蛋白（Aquaporin）

• 细菌、古菌、真核生物都有水孔蛋白。
• 肾上皮细胞、外分泌细胞的水孔蛋白最多。
• 水孔蛋白只允许水通过，不允许任何溶质通过。
• 水孔蛋白只能处于开启状态。
• 水孔蛋白用于加速水跨膜运输。
• 水孔蛋白的结构如图3。
• 离子不能通过水孔蛋白的原因：
  1. 水孔蛋白的通道宽度决定水合离子不能通过。
  2. 水合离子脱水所需的能量不能由离子与氨基酸残基形成非共价键提供。
  3. 两个天冬氨酸残基与水分子形成氢键，阻止H⁺与之形成氢键，进而阻止H⁺通过。

离子通道（Ion Channel）

• 病毒、细菌、古菌、真核生物都有离子通道。
• 大部分离子通道只允许一种离子通过，少部分允许多种离子通过。
• 离子通道只允许一种离子通过的原因：
  • 细菌K⁺通道的结构见图6。
  • 高度选择性的机制类似于水孔蛋白。
  • 水合离子通过通道时，需脱去所有水分子。
  • 脱去水分子所需的能量由离子与氨基酸残基之间形成氢键提供。
  • Na⁺太小，不能产生足够多的氢键，不能获得足够能量脱去水分子，进而无法通过。
• 离子通道可以处于三种状态：开放（Open）、关闭（Closed）、失活（Inactivated）。
• 一般情况下离子通道处于关闭状态。
• 受到某种刺激时，离子通道进入开放状态。
• 大部分离子通道受膜两侧的电压控制，称为电压门离子通道（Voltage-gated Ion Channel）。
• 其它类型的离子通道：
  1. 机械门离子通道（Mechanically-gated Ion Channel）受压力控制；
  2. 配体门离子通道（Ligand-gated Ion Channel）受特定配体控制：
     1. 神经递质门离子通道（Transmitter-gated）；
     2. 离子门离子通道（Ion-gated）；
     3. 核苷酸门离子通道（Nucleotide-gated）。
• 离子通道因连续刺激长时间开放后，进入失活状态，通道关闭。
• 只有刺激解除后，失活离子通道才能进入关闭状态，进而重新开放。
• 钾漏通道（K⁺ Leaking Channel）一般情况下处于开放状态。
• 膜两侧某种离子达到电化学平衡时，该离子产生的电压可用Nernst方程计算。（图4）
• 膜两侧多种离子达到电化学平衡时，产生的总电压可用Goldman方程计算。（图5）

ABC运输器（ATP-binding Cassette）

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图7：ABC运输器

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图8：ABC运输器NBD亚基的结构

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图9：ABC运输器的Switch模型

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图10：ABC运输器的Constant Contact模型

• ABC运输器是最大的初级主动运输蛋白家族，可细分为3个家族。
• 细菌、古菌、真核生物都有ABC运输器。
• 可以由ABC运输器运输的物质：无机离子、氨基酸、多肽、糖类、药物。
• 比ABC运输器大的物质也可以通过ABC运输器。
• 真核生物的ABC运输器，绝大部分用于：细胞质→细胞外、细胞质→细胞器内（内质网、溶酶体）、线粒体基质→细胞质。
• 每个ABC运输器有2个跨膜TMD亚基和2个细胞质中的NBD亚基。
• 线粒体、叶绿体膜上的ABC运输器的细胞质亚基在细胞器基质内。
• TMD亚基含底物结合位点，NBD亚基含ATP结合位点。
• ABC运输器工作方式的两种可能模型：
  1. Switch模型（图9）：
     1. 两个NBD同时结合ATP；
     2. 它们形成二聚体；
     3. 两个ATP依次水解，二聚体分离，物质被泵出细胞。
  2. Constant Contact模型（图10）：
     1. 一个NBD结合ATP时，另一个对ATP的亲和力低；
     2. 结合ATP的NBD水解ATP，使另一个NBD对ATP的亲和力变高；
     3. 另一个NBD结合ATP，引起第一个NBD释放ATP。
• 多种药物抵抗蛋白（Multidrug-resistance Protein）：
  • MDR是最早发现的ABC运输器。
  • 最常见的MDR是MDR1，出现于动物、真菌、细菌。
  • 其它生物也有其它类型的MDR。
  • MDR1是一种糖蛋白，因而又名Permease-glycoprotein。
  • MDR的选择性较弱，能将多种药物泵出细胞。
  • MDR1提高肿瘤细胞的耐药性。
  • Pfmdr1（另一种MDR）提高疟原虫的耐氯喹性。
• TAP运输器：
  • TAP运输器出现于脊椎动物。
  • TAP运输器将蛋白质酶体产生的多肽泵入内质网。
  • 泵入内质网的多肽随后运至细胞表面。
  • 胞毒T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte）检查这些多肽是否来自病原体。
• CFTR蛋白（又名ABCC7蛋白）：
  • CFTR蛋白出现于动物的上皮细胞。
  • CFTR允许氯离子、硫氰根离子、谷胱甘肽通过。
  • CFTR由cAMP激活。
  • CFTR主要控制肺部细胞外液的氯离子浓度。
  • CFTR在结构上属于ABC运输器，在功能上不属于主动运输蛋白。（水解ATP是用于调节通道大小）
  • CFTR变异主要引起囊性纤维化，次要引起I型糖尿病（胰岛分泌不足）。
• CERP蛋白（又名ABCA1蛋白）：
  • CERP出现于动物、植物。
  • CERP辅助磷脂、胆固醇与载脂蛋白（Apolipoprotein）结合。
  • CERP变异引起丹吉尔病（Tangier Disease），属于高密度α脂蛋白缺乏症（Hypoalphalipoproteinemia）。

V型、A型、F型ATP泵（ATPase）

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图11：V型ATP泵的结构

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图12：V型ATP泵的功能

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图13：F型ATP泵的结构

• F型ATP泵出现于细菌、线粒体、叶绿体。
• A型ATP泵出现于古菌。
• V型ATP泵出现于细菌、动物、植物。

V型ATP泵（V-ATPase）

• V型ATP泵运输氢离子。
• 有些细菌的V型ATp泵运输钠离子。
• V型ATP泵由V₀和V₁两部分组成。（图11）
  • V₁部分完全由非膜亚基组成。
  • V₀部分除d亚基外都嵌入细胞膜。
  • V₀部分的c,c',c''亚基疏水性极强，称为“蛋白脂亚基”（Proteolipid subunit），可用氯仿-甲醇溶液提取。
  • 每个蛋白脂亚基含一个谷氨酸残基，其羧基是氢离子通过时的结合位点。
  • 亚基a有一个精氨酸残基，是氢离子通过时的结合位点。
• V型ATP泵酸化溶酶体和植物的液泡。
• V型ATP泵参与感受器介导的内吞。
  • 大量信号分子与受体结合后，受体聚集。
  • 受体聚集的部分细胞膜内陷形成内体。
  • 内体的膜上有V型ATP泵，它用氢离子酸化内体。
  • 酸性环境使信号分子与受体分离。
  • 受体回到细胞膜，信号分子进入溶酶体被分解。
• V型ATP泵参与酶向溶酶体的运输。
  • 高尔基体反面形成内体小泡。
  • 酶与6-磷酸甘露糖感受器结合，被装入内体小泡。
  • V型ATP泵酸化内体小泡，使酶与感受器分离。
  • 酶被送入溶酶体。
• V型ATP泵参与毒素和病毒的入侵。
  • 毒素与病毒与细胞表面结合，通过胞吞进入内体。
  • V型ATP泵酸化内体。
  • 酸性环境使病毒的膜与内体膜结合，释放核酸；使毒素构象变化，在内体膜上钻孔，释放毒素。
• V型ATP泵控制血液和尿液的pH。
• 昆虫的小肠上皮细胞使用V型ATP泵创造氢离子的电化学梯度，以吸收钾离子。
• 破骨细胞使用V型ATP泵溶解骨的无机物。
• 生精小管使用V型ATP泵创造生精所需的酸性环境。
• 巨噬细胞和嗜中性粒细胞使用V型ATP泵创造中性环境。
• 肿瘤细胞使用V型ATP泵酸化胞外基质，同时用溶酶体的酶溶解胞外基质，帮助肿瘤转移。
• 某些条件下，cAMP→PKA→Ras控制V型ATP泵的两部分解离，从而抑制V型ATP泵。
• 某些条件下，亚基A的半胱氨酸形成二硫键，从而抑制V型ATP泵。

F型ATP泵（F-ATPase）

• F型ATP泵运输氢离子，但通常反向运行，生成ATP。
• F型ATP泵是细菌呼吸膜、线粒体内膜、叶绿体外膜上的ATP合成酶。
• 细菌和叶绿体的F型ATP泵结构较简单；线粒体的较复杂。
• F型ATP泵由F_o和F₁两部分构成，类似于V型ATP泵的F₀和F₁两部分。（F_o表示对寡霉素（Oligomycin）敏感。）
• F_o有8~15个c亚基，是氢离子的通过时的结合位点。
  1. 动物的有8个c亚基；
  2. 植物、真菌的有10个c亚基；
  3. 大部分细菌的有11~13个c亚基；
  4. 植物叶绿体的有14个c亚基；
  5. 蓝细菌的有15个c亚基。
• 氢离子的电化学梯度低时，ADP与F型ATP泵结合，抑制F型ATP泵。
• 黑暗中，叶绿体的F型ATP泵与ADP形成二硫键。
• 光下，二硫键由硫氧还蛋白（Thioredoxin）氧化断裂。
• 线粒体中的pH较低时，F型ATP泵与IF₁蛋白结合，抑制F型ATP泵。
• 原核生物中与IF₁功能相同的蛋白是ζ亚基，但二者结构上无关。

A型ATP泵（A-ATPase）

• A型ATP泵是古菌的ATP合成酶。
• A型ATP泵既可运输氢离子，也可运输钠离子。
• A型ATP泵的结构类似于V型ATP泵。（因此有时归为V型ATP泵）

旋转运输机制

• 三类ATP泵的运输机制都是“旋转运输”（Rotatory Catalysis）。

下以F型ATP泵为例说明旋转运输机制。

• 氢离子首先通过a亚基上长度为膜的厚度的一半的通道，进入一个c亚基。
• 前一个c亚基的谷氨酸携带的氢离子与a亚基的一个精氨酸残基结合，推动c亚基环旋转。
• 与精氨酸残基结合的氢离子通过a亚基上另一个长度为膜的厚度的一半的通道，实现跨膜。
• c亚基环的旋转引起F₁亚基构象变化，催化ATP的合成。
• c亚基越多，平均产生1个ATP所需通过的氢离子越多。
• 动物的产生1个ATP约需2.7个氢离子通过；蓝细菌的（含15个c亚基）产生1个ATP约需5.0个氢离子通过。
• ATP-ADP交换体和磷酸-质子共运体一共还需1个氢离子的电化学势能。
• 所以，动物的线粒体释放1个ATP需3.7≈4个氢离子。

呼吸链质子泵

呼吸链质子泵的运输机制尚未阐明，参阅电子传递链

P型ATP泵

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图14：Ca²⁺泵（一种P型ATP泵）的结构

• P型ATP泵出现于细菌、古菌、真核生物。
• P型ATP泵运输各种金属离子、磷脂。
• 动物肌肉细胞的细胞膜和内质网用Ca²⁺泵富集钙离子。
  • 细胞内的钙离子浓度远低于胞外。
  • 细胞内的钙离子大部分集中于内质网。
• 动物细胞膜用Na⁺/K⁺泵建立电化学梯度。
  • 细胞内高钾低钠，细胞外高钠低钾。
  • 每消耗1个ATP，Na⁺/K⁺泵可泵出3个钠离子，泵入2个钾离子。
• 胃壁细胞用H+/K+泵分泌胃酸。

基团转移体（Group Translocator）

• 基团转移体利用化学能同时运输并修饰底物。
• 基团转移体不属于初级主动运输蛋白。
• PEP：糖磷酸基团转移体（Phosphoenopyruvate:surgar Phosphotransferase）只出现于细菌。
• 该基团转移体断裂PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）的高能磷酸键，同时运入并磷酸化细胞外的糖类物质。
• 能通过PEP：糖磷酸基团转移体运输的物质：葡萄糖、葡糖醇、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、葡糖苷、果糖、甘露糖、甘露醇、甘露酰甘油酸、半乳糖醇、塔格糖、N-乙酰胞壁酸、抗坏血酸、多种寡糖及其衍生物。
• 大部分PEP：果糖磷酸基团转移体磷酸化果糖的C1，少部分磷酸化果糖的C6。
• 真核生物的液泡和酸钙体（Acidocalcisome）上有V-PPP酶，可利用细胞质中的ATP的化学能，将细胞器外的聚磷酸（Polyphosphate）运入细胞器，同时加上一个磷酸基团。