细菌染色法
总论
- 细菌有多种染色方法，其中最重要的是革兰氏染色法（Gram's Stain）。
- 染色可分为正染（Positive Staining）和负染（Negative Staining）：
- 正染：对细菌的细胞进行染色，环境不被染色。
- 负染：对细菌生活的环境进行染色，细胞不被染色。
- 正染的染料与细胞可通过离子键、共价键、疏水键结合。
- 最常用的正染染料通过离子键与细胞结合，分为酸性染料、碱性染料。
- 酸性染料：伊红（Eosin）、二碘曙红（玫瑰红，Rose Bengal）、酸性品红（Acid Fuchsin）。
- 碱性染料：亚甲蓝（Methylene Blue）、碱性品红（Basic Fuchsin）、结晶紫（龙胆紫，Crystal Violet）、番红（Safranin）、品绿（孔雀绿，Malachite Green）。
- 只使用一种染料的染色方法称为简单染色（Simple Stain）。
- 使用多种染料分类染色的方法称为分化染色（Differential Stain）。
- 常见的分化染色：革兰氏染色、抗酸染色（Acid-fast Stain）。
- 有些染色方法专门用于染色特定结构：
- 荚膜染色法（Capsule Staining）：用墨汁（India Ink）或苯胺黑（Nigrosin）染色，背景比荚膜染色较深，属于负染。（观察硫细菌细胞内的硫颗粒亦可用此法）
- 芽孢染色法（Endospore Staining）：一般用Schaeffer-Fulton法。将细菌与品绿共热，用水脱染，用番红复染，属于正染，分化染色。
- 鞭毛染色法（Flagellate Staining）：用铝钾矾（硫酸铝钾）或鞣酸（Tannic Acid）包裹鞭毛（增粗），然后用副蔷薇苯胺（副玫瑰红，Pararosaniline）或碱性品红染色，属于正染。
固定细胞
- 给细菌染色的第一步是固定细胞。
- 固定细胞的方法有：热固定法（Heat Fixation）、化学固定法（Chemical Fixation）。
- 热固定法：将细胞薄层在本生灯（Bunsen Burner）上微热，会破坏细胞内部结构。（较常用）
- 化学固定法：在细胞薄层上滴加乙醇、乙酸、氯化汞、乙醛或戊二醛，不会破坏细胞内部结构。
革兰氏染色
由Gram发明，用于区别革兰氏阴性和阳性菌。
实验过程
- 用革兰氏阳性菌（如葡萄球菌）或革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）接种
- 等待载玻片风干。（约5-10分钟，不能加热，否则破坏细菌）
- 载玻片干后，用镊子夹住载玻片快速通过本生灯火焰2-3次，微热固定细菌。（载玻片底部摸起来不能烫）
- 初染：将载玻片用结晶紫完全覆盖，静置6-30 s，倒掉染料，用蒸馏水冲洗5秒。（细菌已被固定，不需担心细菌流失）
- 媒染：将载玻片用碘液完全覆盖，静置12-60 s，倒掉染料，用蒸馏水冲洗5秒。（革兰氏阳性菌中，碘和结晶紫组成复合体，卡在细胞壁和内膜之间）
- 脱染：将载玻片用镊子斜45°夹住，滴加丙酮或乙醇，至不再滴出紫色染料，立刻用蒸馏水冲洗。（本步时间很关键，最好1-2 s，最多5 s）
- 复染：将载玻片用番红或其它染料完全覆盖，静置10-30 s，倒掉染料，用蒸馏水冲洗。
- 用纸巾吸去载玻片上的水。（但不能擦拭）
- 在显微镜下观察结果。（最好用油浸润显微镜）
实验结果
- 被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌（Gram-positive Bacteria）。
- 被染成红色的细菌称为革兰氏阴性菌（Gram-negative Bacteria）。
- 大多数革兰氏阳性菌属于厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。
- 支原体（Mycoplasma）属于厚壁菌门，却是革兰氏阴性菌。
- 奇异球菌（Deinococcus）不属于上述两个门，却是革兰氏阳性菌。
- 实验结果错误的三个关键原因：
- 细菌培养时间过长，革兰氏阳性菌会变成阴性菌。（原因不明）
- 脱染时间过长，革兰氏阳性菌会呈现阴性菌。
- 被染色的细菌悬浮液过浓，染色会不均匀。（培养基中的悬浮液一般很稀，不用担心此问题）
抗酸染色法
实验过程
- 在载玻片上准备材料，参考革兰氏染色。
- 初染：将载玻片用碳酸复红（Carbofuchsin）覆盖3-5 min，不用加热，然后冲洗。
- 脱染：滴加酒精-HCl溶液，10-30 s后冲洗。
- 复染：滴加甲基蓝，20-30 s后冲洗。
- 干燥后在油浸润显微镜下观察。
实验结果
- 分枝杆菌、诺卡氏菌被染为粉红色，其它细菌被染为蓝色。
细菌细胞结构染色法
荚膜染色法
- 在载玻片上滴一滴细菌悬浮液，再滴一滴墨汁。
- 推片
- 在显微镜下寻找，可找到黑色背景下荚膜呈现白色。
- 因为这个过程不会杀死细菌，观察结束后要高温处理载玻片。
芽孢染色法
- 常规涂片，待干燥后，在火焰上过3次以固定。
- 滴加3-4滴A液于已固定的涂片上。
- 用木夹夹住载玻片在火焰上持续加热6-8s，使染液冒蒸汽且不会沸腾。
- 待玻片冷却后，倾去染液，水洗至不再褪色为止。
- 用B液复染1min，水洗至水为无色。待干燥后，至油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。