Sanger测序
Sanger测序，也称为双脱氧链终止法，是一种广泛使用的DNA测序技术。这项技术由英国生物化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）于1977年发明，并因其高准确性和可靠性，成为基因检测的金标准。以下是对Sanger测序的详细介绍：
- **基本原理**Sanger测序基于DNA复制的原理，通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。 - 测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物和DNA聚合酶。
- ddNTP由于缺少3'-OH基团，无法与下一个dNTP形成磷酸二酯键，导致DNA链在特定位置终止。
- 每个反应体系中加入不同类型的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP），使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止，形成一系列不同长度的DNA片段。
- **反应过程**
- **构建反应系统**
- 每个反应体系包含四种dNTP，用于正常DNA合成。<cite>5</cite>
- 每个反应体系加入一种特定的ddNTP，使其在特定碱基处终止DNA链。
- 为了方便定位，ddNTP通常会被荧光或同位素标记。
- 反应体系还包括目标DNA片段、DNA聚合酶和引物。
- **扩增目的片段**以目标DNA片段为模板，在DNA聚合酶的催化下，从引物处开始复制DNA。
- 当遇到ddNTP时，反应停止，产生一系列具有共同起始点但不同终止点的DNA片段。
- 通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度，可以控制链终止的位置和频率。
- **凝胶电泳**
- 使用高分辨率变性丙烯酰胺凝胶电泳将不同长度的DNA片段分开。
- 凝胶电泳有四个泳道，每个泳道对应一种碱基（A、G、C、T）。<cite>5</cite>
- 电泳结束后，通过放射自显影或紫外显影读取凝胶影像，确定每个片段的终止位置。
- 从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列，从而推知待测模板链的序列。
- **应用实例**
- **乙型肝炎病毒耐药基因突变检测**
- 一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒（HBV）DNA拷贝数大于10^3的患者血清进行测序。
- 结果显示，40例（18.6%）患者检测到耐药基因突变，其中21例（9.77%）具有对应参考价值。<cite>2</cite>
- 研究还发现，LAM药物（拉米夫定）的耐药发生率较高，为9.77%。
- **肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测**
- 一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的CDA基因突变情况。
- 检测成功率高达98.04%，敏感度和特异度分别为92.50%和99.52%。
- 研究表明，Sanger测序法可以有效地检测CDA基因突变，为临床用药提供参考。
- **胶质瘤IDH突变检测**
- 一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。
- 结果显示，237例（35.9%）样本检测到IDH1基因突变，9例（1.4%）样本检测到IDH2基因突变。
- IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸，最常见的突变类型是IDH1R132H，占总突变的94%。
- **感音神经性聋患者常见聋病基因检测**
- 一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。
- 研究选择了GJB2基因的第二个外显子、SLC26A4基因的p8和p18两个外显子、mtDNA的两个常见突变位点进行测序。
- 结果显示，Sanger测序法可以成功检测这些基因的突变，为临床诊断提供依据。
- **优势和局限性**
- **优势**
- **高准确性**: Sanger测序法的准确率非常高，通常在99.99%左右。
- **长读长**: 可以产生超过500个核苷酸的读长，适用于较长的DNA片段测序。
- **广泛使用**: 由于其可靠性和准确性，Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。
- **局限性**
- **成本较高**: 对于大规模、自动化基因组分析，Sanger测序的成本较高。
- **通量较低**: 相比于下一代测序技术（如Illumina），Sanger测序的通量较低，不适合处理大量样本。
- **灵敏度限制**: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上，这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。
- **与其他技术的比较**
- **焦磷酸测序法**
- 焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术，与Sanger测序法相比，焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。
- 例如，一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用，结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。
- **ADx-ARMS法**
- ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术，具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。
- 一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用，结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法（51.0% vs 25.3%）。
- **蓝白斑筛选联合Sanger测序技术**
- 通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度，达到千分之一的水平。
- 该技术操作简便，成本低廉，适合在基层医院推广，可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测，提供预后信息。