Sanger测序

Sanger测序即双脱氧链终止法、一代测序技术。

在HGP中被广泛使用。

基本原理

Sanger测序基于DNA复制的原理，通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。

测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、引物和DNA聚合酶。

• ddNTP由于缺少3'-OH基团，无法与下一个dNTP形成磷酸二酯键，导致DNA链在此位置终止，ddNTP成为该肽段的末端。
• 向体系中加入不同类型的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP），使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止，形成一系列不同长度的DNA片段。

反应过程

构建反应系统

每个反应体系包含四种dNTP，用于正常DNA合成。

每个反应体系加入一种特定的ddNTP，使其在特定碱基处终止DNA链。

为了方便定位，ddNTP通常会被荧光或同位素标记。

反应体系还包括目标DNA片段、DNA聚合酶和引物。

扩增目的片段

以目标DNA片段为模板，在DNA聚合酶的催化下，从引物处开始复制DNA。

当遇到ddNTP时，反应停止，产生一系列具有共同起始点但不同终止点的DNA片段。

通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度，可以控制链终止的位置和频率。

电泳

通过电泳将不同长度的DNA片段分开。

一般有四个泳道，每个泳道对应一种碱基（A、G、C、T）。

电泳结束后，通过放射自显影或紫外显影读取凝胶影像，确定每个片段的终止位置。

从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列，从而推知待测模板链的序列。

应用实例

乙型肝炎病毒耐药基因突变检测

一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒（HBV）DNA拷贝数大于1k的患者血清进行测序。

结果显示，40例（18.6%）患者检测到耐药基因突变，其中21例（9.77%）具有对应参考价值。<cite>2</cite>

研究还发现，LAM药物（拉米夫定）的耐药发生率较高，为9.77%。

肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测

一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的CDA基因突变情况。

检测成功率高达98.04%，敏感度和特异度分别为92.50%和99.52%。

胶质瘤IDH突变检测

一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。

结果显示，237例（35.9%）样本检测到IDH1基因突变，9例（1.4%）样本检测到IDH2基因突变。

IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸，最常见的突变类型是IDH1R132H，占总突变的94%。

感音神经性聋患者常见聋病基因检测

一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。

研究选择了GJB2基因的第二个外显子、SLC26A4基因的p8和p18两个外显子、mtDNA的两个常见突变位点进行测序。

优势和局限性

优势

高准确性: Sanger测序法的准确率非常高，通常在99.99%左右。

长读长: 可以产生超过500个核苷酸的读长，适用于较长的DNA片段测序。

广泛使用： 由于其可靠性和准确性，Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。

局限性

成本较高： 对于大规模、自动化基因组分析，Sanger测序的成本较高。

通量较低: 相比于下一代测序技术（如Illumina），Sanger测序的通量较低，不适合处理大量样本。

灵敏度限制: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上，这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。

与其他技术的比较

焦磷酸测序法

焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术，与Sanger测序法相比，焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。

例如，一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用，结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。

ADx-ARMS法

ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术，具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。

一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用，结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法（51.0% vs 25.3%）。

蓝白斑筛选联合Sanger测序技术

通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度，达到千分之一的水平。

该技术操作简便，成本低廉，适合在基层医院推广，可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测，提供预后信息。