“Western blot条带结果分析整理”的版本间的差异

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* 蛋白上样量太少(小小的细微条带)。
* 蛋白上样量太少(小小的细微条带)。
* 一抗浓度过低(小小的细微条带)。
* 一抗浓度过低(小小的细微条带)。
* ECL发光液失效(小小的细微条带)。
* ECL发光液失效(小小的细微条带)。<br>
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[[文件:Wb 3.PNG|缩略图|无结果1]]
[[文件:Wb 2.PNG|缩略图|无结果2]]
[[文件:Wb 1.PNG|缩略图|无结果3]]
解决方案:
解决方案:
* 如果使用湿转法,则需增加转移时间。
* 如果使用湿转法,则需增加转移时间。
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* 避免对同一印迹膜进行多次重复再杂交。  
* 避免对同一印迹膜进行多次重复再杂交。  
* 蛋白质未转移→优化目标蛋白转移效率。
* 蛋白质未转移→优化目标蛋白转移效率。
== 高背景 ==
== 高背景 ==
目的条带单一清晰,但其他地方弥漫着连续性的单一背景。是WB最常见的问题之一,注意操作规范,不偷工减料,洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次,不要改成5min*3次,或者10min*2次。<br>
目的条带单一清晰,但其他地方弥漫着连续性的单一背景。是WB最常见的问题之一,注意操作规范,不偷工减料,洗膜按照规定来5min×5次或者10min×3次,不要改成5min×3次,或者10min×2次。<br>
出现原因:
出现原因:
* 为封闭不完善(脱脂牛奶多加点)。
* 为封闭不完善(脱脂牛奶多加点)。
* 一抗浓度过高导致出现了非特异性结合。
* 一抗浓度过高导致出现了非特异性结合。
* 洗膜的时间及次数不足导致未洗脱游离抗体。
* 洗膜的时间及次数不足导致未洗脱游离抗体。
== 出现异常的多个条带 ==
== 出现异常的多个条带 ==
[[文件:Wb 4.PNG|缩略图|多条带1]][[文件:Wb 5.PNG|缩略图|多条带2]]
出现原因:
出现原因:
* 可能是一抗与杂蛋白出现了非特异性结合。  
* 可能是一抗与杂蛋白出现了非特异性结合。  
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== 条带中出现圆圈 ==
== 条带中出现圆圈 ==
出现的原因是电转时PAGE胶与尼龙膜之间存在气泡。 出现气泡的原因基本上是在转膜过程中转移“三明治”组装不恰当。<br>  
出现的原因是电转时PAGE胶与尼龙膜之间存在气泡。 出现气泡的原因基本上是在转膜过程中转移“三明治”组装不恰当。<br>  
解决方法:
[[文件:Wb 7.PNG|缩略图|半干法]][[文件:Wb 8.PNG|缩略图|湿法]]解决方法:
* 在组装转移“三明治”的时候使用更多的转印缓冲液。  
* 在组装转移“三明治”的时候使用更多的转印缓冲液。  
* 确保在组装“三明治”的时候移除凝胶和印迹膜之间所有的气泡。  
* 确保在组装“三明治”的时候移除凝胶和印迹膜之间所有的气泡。  
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操作注意:<br>
操作注意:<br>
我们常常将电转液倒入一个盘子里,倒入的液体不能太多也不能太少,最好的高度是与放上第一层滤纸齐平,然后往滤纸上浇点转膜液,把电泳胶用清水清洗下,将电泳胶平铺到滤纸上,仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡,可以左右前后观察,不同方向观察之后确认无气泡,然后再往胶上面浇点电转液,用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间,使膜成U型,然后将U型的底部接触胶的中间,慢慢往两边放下膜,这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法,用玻璃棒稍微贴实下,然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡,这样反而会带入气泡。
我们常常将电转液倒入一个盘子里,倒入的液体不能太多也不能太少,最好的高度是与放上第一层滤纸齐平,然后往滤纸上浇点转膜液,把电泳胶用清水清洗下,将电泳胶平铺到滤纸上,仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡,可以左右前后观察,不同方向观察之后确认无气泡,然后再往胶上面浇点电转液,用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间,使膜成U型,然后将U型的底部接触胶的中间,慢慢往两边放下膜,这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法,用玻璃棒稍微贴实下,然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡,这样反而会带入气泡。
== 条带中出现浅色 ==
== 条带中出现浅色 ==
中心部位高浓度的辣根过氧化物酶(HRP)等消耗底物过快,使得胶片曝光时底物已消耗殆尽。解决方法是降低蛋白量,降低一抗和二抗浓度,加快X光片定影。  
中心部位高浓度的辣根过氧化物酶(HRP)等消耗底物过快,使得胶片曝光时底物已消耗殆尽。解决方法是降低蛋白量,降低一抗和二抗浓度,加快X光片定影。  
第84行: 第84行:
* 抗体聚合。  
* 抗体聚合。  
* 缓冲液污染。  
* 缓冲液污染。  
* 一抗与膜某些地方非特异性结合。 <br>
* 一抗与膜某些地方非特异性结合。 <br>[[文件:Wb 6.PNG|缩略图|黑点和黑斑]]
解决方案:
解决方案:
* 将印迹膜表面残留的丙烯酰胺凝胶碎片移除。
* 将印迹膜表面残留的丙烯酰胺凝胶碎片移除。
第93行: 第93行:
* 使用新的缓冲液或使用0.2μm的过滤器过滤缓冲液。
* 使用新的缓冲液或使用0.2μm的过滤器过滤缓冲液。
* 封闭牛奶一定要纯,封闭结束之后要洗,如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上,会导致很多不溶性颗粒附着在膜上,这就会导致发光时候膜上的黑点。
* 封闭牛奶一定要纯,封闭结束之后要洗,如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上,会导致很多不溶性颗粒附着在膜上,这就会导致发光时候膜上的黑点。
== 条带拖尾 ==
== 条带拖尾 ==
蛋白量过大,一抗的浓度过大,加入的时间过长,洗一抗和洗二抗不要凑活,一定要5min×5次。样品溶解度不佳。
蛋白量过大,一抗的浓度过大,加入的时间过长,洗一抗和洗二抗不要凑活,一定要5min×5次。样品溶解度不佳。
== 出现重影 ==
== 出现重影 ==
荧光强度较高,压片曝光时,胶片放好后又移动了一段距离。不要瞎动,放歪了也不要调整。
荧光强度较高,压片曝光时,胶片放好后又移动了一段距离。不要瞎动,放歪了也不要调整。(有的时候出现重新刚好在上下位置,并且重影会相对弱一些,不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。)
== 出现非均一性背景 ==
== 出现非均一性背景 ==
可能的原因是膜干了失水皱缩,所以多加点水。  
可能的原因是膜干了失水皱缩,所以多加点水。  
== 某个条带变形 ==
== 某个条带变形 ==
PAGE胶中可能存在气泡或不溶性颗粒,故配胶时要小心,使用无杂质液体。制作“三明治”时也要压紧。
PAGE胶中可能存在气泡或不溶性颗粒,故配胶时要小心,使用无杂质液体。制作“三明治”时也要压紧。更换陈年老用的海绵垫。
== 条带哑铃型 ==
== 条带哑铃型 ==
更换更高品质的PAGE胶。  
更换更高品质的PAGE胶。  
== 最边缘的条带弯曲 ==
== 最边缘的条带弯曲 ==
电泳电流不均一,可换用新的电泳槽,也可不使用两边的泳道
电泳电流不均一,可换用新的电泳槽,不使用两边的泳道。
== 蛋白质分子量过高或过低 ==
== 蛋白质分子量过高或过低 ==
出现原因:
出现原因:
第118行: 第116行:
蛋白质降解,下方产生的模糊不清的小条带是其碎片。提取蛋白的时候PMSF(苯甲基磺酰氟,蛋白酶抑制剂)多加点。  
蛋白质降解,下方产生的模糊不清的小条带是其碎片。提取蛋白的时候PMSF(苯甲基磺酰氟,蛋白酶抑制剂)多加点。  
== 条带“╰╯”笑脸状(U 形状) ==
== 条带“╰╯”笑脸状(U 形状) ==
凝胶冷却不均一,电泳槽老化,在上样的时候没有吹打干净、跑胶电压过大造成拖尾。  
凝胶冷却不均一,电泳槽老化,在上样的时候没有吹打干净、跑胶电压过大造成拖尾。 [[文件:Wb 9.PNG|缩略图|笑脸]]
== 条带“╭╮”哭脸状 ==
== 条带“╭╮”哭脸状 ==
凝胶的左右两头没有固定好。  
凝胶的左右两头没有固定好。  
第130行: 第128行:
缓冲液pH不正确,或者SDS加的太少。  
缓冲液pH不正确,或者SDS加的太少。  
== 边缘效应 ==
== 边缘效应 ==
出现于胶图的两端最靠边的条带,会发现跑出来的带不是水平直线。<br>  
出现于胶图的两端最靠边的条带,会发现跑出来的带不是水平直线。<br> [[文件:Wb 12.PNG|缩略图|边缘效应]]
解决方案:<br>宁可将Loading buffer加到两边也不要将样品加到两边。  
解决方案:<br>宁可将Loading buffer加到两边也不要将样品加到两边。  
== 脏……全屏条带 ==  
== 脏……全屏条带 ==  
第140行: 第138行:
* 曝光时间过长。  
* 曝光时间过长。  
* 印迹过程中印迹膜变干。  
* 印迹过程中印迹膜变干。  
* 缓冲液重复利用导致污染。 <br>
* 缓冲液重复利用导致污染。<br>
解决方案:<br>
解决方案:<br>[[文件:Wb 11.PNG|缩略图|全屏黑]]
* 稀释一抗和/或二抗浓度。
* 稀释一抗和/或二抗浓度。
* 提高封闭剂浓度,如3~5% 的牛血清蛋白、酪蛋白、脱脂牛奶.
* 提高封闭剂浓度,如3~5% 的牛血清蛋白、酪蛋白、脱脂牛奶.
第152行: 第150行:
* 减少成像曝光时间。
* 减少成像曝光时间。
* 确保印迹膜保持湿润,覆盖有足够液体以防止其变干。
* 确保印迹膜保持湿润,覆盖有足够液体以防止其变干。
* 使用新制缓冲液。  
* 使用新制缓冲液。
== 脏……区域性黑屏 ==
== 脏……区域性黑屏 ==
出现原因:
出现原因:
第159行: 第157行:
* 洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足。
* 洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足。
* 印迹膜污染。<br>
* 印迹膜污染。<br>
解决方案:
解决方案:[[文件:Wb 10.PNG|缩略图|局域黑]]
* 确保印迹膜保持湿润,一直覆盖有足够液体以防止其变干。
* 确保印迹膜保持湿润,一直覆盖有足够液体以防止其变干。
* 增加洗涤缓冲液用量。
* 增加洗涤缓冲液用量。
第167行: 第165行:
<ref>本文档由拟态章鱼编写,由恺凌、Eric校对审核。</ref>
<ref>本文档由拟态章鱼编写,由恺凌、Eric校对审核。</ref>
<ref>[https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/41165994]Western Blot 原理、protocol--及条带常见问题分析.与你畅游世界</ref>
<ref>[https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/41165994]Western Blot 原理、protocol--及条带常见问题分析.与你畅游世界</ref>
<references />

2020年6月3日 (三) 19:05的最新版本

Western Blot条带结果分析

未检测到任何结果

出现原因:

  • 加错了抗体,如一抗加的是小鼠抗人,二抗加的是山羊抗兔。
  • 提取的总蛋白中压根没有目的蛋白,如用改变离子强度的方式提取膜蛋白(所以做Input很重要啊)。当然,梦想总是要有的,说不定你也可以在五车酵母上清中提到Cyt c;转移时间过短。
  • 转移电场过弱;转移缓冲液未优化。
  • 凝胶选择不恰当。
  • 转膜时膜放反了(真是个小机灵鬼)。
  • 蛋白上样量太少(小小的细微条带)。
  • 一抗浓度过低(小小的细微条带)。
  • ECL发光液失效(小小的细微条带)。
无结果1
无结果2
无结果3

解决方案:

  • 如果使用湿转法,则需增加转移时间。
  • 增加转移电压或电流。
  • 在转移缓冲液中加入0.01~0.05%的SDS。
  • 将转移缓冲液中的甲醇浓度减少至5%或更少。
  • 使用更低百分比的丙烯酰胺凝胶。
  • 检查上样的量、抗体和反光液的量(小小的细微条带)

其他原因及解决办法:

  • 转移时间过长→减少转印时间。
  • 转移电场过强→降低转印电压或电流。
  • 转移缓冲液未优化→组装“三明治”之前,在转印缓冲液中平衡凝胶20分钟以降低凝胶中SDS浓度,从而避免小分子量蛋白的过度转移。将转印缓冲液中的甲醇浓度增加至40%提高其极性有助于从蛋白质中移除残留SDS。
  • 凝胶选择不恰当→使用更高百分比的丙烯酰胺凝胶当目标蛋白分子量小于10KD时使用Tris/tricine 凝胶。
  • 使用0.2μm的印迹膜解决小蛋白转印过度的情况。
  • 小蛋白会穿过大孔径的印迹膜→使用0.2 μm的印迹膜检测小蛋白转印过度情况

抗体问题:
低活性或低浓度,低亲和力的一抗,错配的一抗和二抗结合比率提高。
抗体浓度:

  • 抗体可能已经丧失活性;进行斑点杂交以确定其活性和最佳浓度。
  • 测试不同一抗和/或一抗/二抗组合。
  • 同时使用阳性对照和阴性对照。
  • 抗原提呈不足增加凝胶中每个样品的总蛋白上样量。
  • 检查样品的完整性;确保蛋白未降解。
  • 抗原被封闭缓冲液封闭尝试不同的封闭液(比如,在检测磷蛋白时避免使用牛奶)。
  • 优化封闭液浓度→建议使用浓度为3~5%的牛血清白蛋白或脱脂奶粉
  • 化学发光底物性能不佳→增加底物孵育时间。
  • 准备少量工作液以确定底物是否已经丧失活性。暗室内,在底物工作液中加入少量HPR偶联物则应该会出现蓝光。如果没有的话,必定是底物或HRP偶联物已丧失活性。
  • 确保底物试剂盒中的两个瓶子之间没有发生交叉污染。两种试剂之间如果发生交叉污染,则会引起试剂活性下降。
  • 叠氮化物是HRP的抑制剂,所以不要在二抗缓冲液中使用叠氮化物。
  • 印迹膜抗体剥离和再杂交优化抗体剥离条件。
  • 仅在必要时进行再杂交检测。
  • 避免对同一印迹膜进行多次重复再杂交。
  • 蛋白质未转移→优化目标蛋白转移效率。

高背景

目的条带单一清晰,但其他地方弥漫着连续性的单一背景。是WB最常见的问题之一,注意操作规范,不偷工减料,洗膜按照规定来5min×5次或者10min×3次,不要改成5min×3次,或者10min×2次。
出现原因:

  • 为封闭不完善(脱脂牛奶多加点)。
  • 一抗浓度过高导致出现了非特异性结合。
  • 洗膜的时间及次数不足导致未洗脱游离抗体。

出现异常的多个条带

多条带1
多条带2

出现原因:

  • 可能是一抗与杂蛋白出现了非特异性结合。
  • 抗体浓度过高。
  • 非特异位点封闭不足。
  • 向封闭缓冲溶液中加入0.05%的Tween®20。
  • SDS使抗体和固定的蛋白条带发生非特异性结合。

解决方案:

  • 可尝试更换一抗(你的一抗实在是太屎了花点钱重买一个吧)。
  • 降低抗体浓度。
  • 提高封闭剂浓度,如从5%提高到7%。
  • 增加封闭时间和/或提高温度。
  • 抗体稀释液采用相同的封闭缓冲液(加入0.05%的 Tween®20)。
  • 转移后洗涤印迹膜。
  • 在免疫检测过程中不要使用SDS。
  • 抗体质量尝试使用不同抗体。

条带中出现圆圈

出现的原因是电转时PAGE胶与尼龙膜之间存在气泡。 出现气泡的原因基本上是在转膜过程中转移“三明治”组装不恰当。

半干法
湿法

解决方法:

  • 在组装转移“三明治”的时候使用更多的转印缓冲液。
  • 确保在组装“三明治”的时候移除凝胶和印迹膜之间所有的气泡。
  • 在抗体孵育前用丽春红S为印迹膜染色,以检查转移质量。
  • 尽量不要使用半干法(使用湿法转膜,即泡在整个的转移buffer溶液中)。
  • 将“三明治”压压紧。

操作注意:
我们常常将电转液倒入一个盘子里,倒入的液体不能太多也不能太少,最好的高度是与放上第一层滤纸齐平,然后往滤纸上浇点转膜液,把电泳胶用清水清洗下,将电泳胶平铺到滤纸上,仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡,可以左右前后观察,不同方向观察之后确认无气泡,然后再往胶上面浇点电转液,用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间,使膜成U型,然后将U型的底部接触胶的中间,慢慢往两边放下膜,这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法,用玻璃棒稍微贴实下,然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡,这样反而会带入气泡。

条带中出现浅色

中心部位高浓度的辣根过氧化物酶(HRP)等消耗底物过快,使得胶片曝光时底物已消耗殆尽。解决方法是降低蛋白量,降低一抗和二抗浓度,加快X光片定影。

出现黑点和黑斑

出现原因:

  • 凝胶碎片粘附于印迹膜之上;成块的封闭剂粘附于印迹膜之上。
  • 抗体聚合。
  • 缓冲液污染。
  • 一抗与膜某些地方非特异性结合。
    黑点和黑斑

解决方案:

  • 将印迹膜表面残留的丙烯酰胺凝胶碎片移除。
  • 确保封闭剂在使用前完全溶解。
  • 向封闭缓冲溶液中加入0.1%的Tween-20®。
  • 使用0.2μm的过滤器过滤抗体缓冲液。
  • 使用新鲜抗体、向抗体缓冲溶液中加入0.1%的 Tween-20®。
  • 使用新的缓冲液或使用0.2μm的过滤器过滤缓冲液。
  • 封闭牛奶一定要纯,封闭结束之后要洗,如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上,会导致很多不溶性颗粒附着在膜上,这就会导致发光时候膜上的黑点。

条带拖尾

蛋白量过大,一抗的浓度过大,加入的时间过长,洗一抗和洗二抗不要凑活,一定要5min×5次。样品溶解度不佳。

出现重影

荧光强度较高,压片曝光时,胶片放好后又移动了一段距离。不要瞎动,放歪了也不要调整。(有的时候出现重新刚好在上下位置,并且重影会相对弱一些,不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。)

出现非均一性背景

可能的原因是膜干了失水皱缩,所以多加点水。

某个条带变形

PAGE胶中可能存在气泡或不溶性颗粒,故配胶时要小心,使用无杂质液体。制作“三明治”时也要压紧。更换陈年老用的海绵垫。

条带哑铃型

更换更高品质的PAGE胶。

最边缘的条带弯曲

电泳电流不均一,可换用新的电泳槽,不使用两边的泳道。

蛋白质分子量过高或过低

出现原因:

  • 胶配置的浓度与蛋白质分子浓度不符。
  • 当然也有可能是蛋白质中碱性氨基酸过多导致SDS无法屏蔽这些正电荷,或者蛋白质中脯氨酸含量过高。
  • 抗体用错了,变性不彻底出现二聚体或者多聚体;
  • 蛋白修饰,蛋白剪切;
  • 非特异性的蛋白强于待检测的样品。

解决方案:
用特异性高的抗体检测,变性彻底。

在主条带下方出现条带

蛋白质降解,下方产生的模糊不清的小条带是其碎片。提取蛋白的时候PMSF(苯甲基磺酰氟,蛋白酶抑制剂)多加点。

条带“╰╯”笑脸状(U 形状)

凝胶冷却不均一,电泳槽老化,在上样的时候没有吹打干净、跑胶电压过大造成拖尾。

笑脸

条带“╭╮”哭脸状

凝胶的左右两头没有固定好。

溴酚蓝(前沿染料)拖尾

样品溶解度不好。

条带出现纵向纹理

上样样品中存在不溶性颗粒。

溴酚蓝占据的范围很粗

浓缩胶效果不好。

分离胶中条带无法分离

缓冲液pH不正确,或者SDS加的太少。

边缘效应

出现于胶图的两端最靠边的条带,会发现跑出来的带不是水平直线。

边缘效应

解决方案:
宁可将Loading buffer加到两边也不要将样品加到两边。

脏……全屏条带

出现原因:

  • 一抗和/或二抗浓度过高。
  • 非特异位点封闭不足。
  • 使用了错误的封闭缓冲溶液。
  • 洗涤不足增加洗涤次数和缓冲液用量(最少5×5分钟)。
  • 曝光时间过长。
  • 印迹过程中印迹膜变干。
  • 缓冲液重复利用导致污染。

解决方案:

全屏黑
  • 稀释一抗和/或二抗浓度。
  • 提高封闭剂浓度,如3~5% 的牛血清蛋白、酪蛋白、脱脂牛奶.
  • 降低封闭时间和/或温度。
  • 向封闭缓冲溶液中加入0.05%的Tween®-20。
  • 一抗和/或二抗与 封闭缓冲液中的蛋白相结合或者尝试其他封闭剂(白蛋白、酪蛋白、脱脂牛奶等)。
  • 在使用亲和素-生物素系统时不要使用牛奶来封闭印迹膜,因为牛奶含有生物素。
  • 增加洗涤次数和缓冲液用量(最少5×5分钟)。
  • 如果洗涤液中未含有0.1%的Tween®-20,请添加。
  • 减少成像曝光时间。
  • 确保印迹膜保持湿润,覆盖有足够液体以防止其变干。
  • 使用新制缓冲液。

脏……区域性黑屏

出现原因:

  • 部分印迹膜变干。
  • 洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足。
  • 洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足。
  • 印迹膜污染。

解决方案:

局域黑
  • 确保印迹膜保持湿润,一直覆盖有足够液体以防止其变干。
  • 增加洗涤缓冲液用量。
  • 避免过多印迹堆叠在一个孵育容器内。
  • 使用干净的或新的转移三明治;请勿用手直接接触印迹膜,一直配戴清洁手套或使用医用镊子。
  • 确保电泳设备、转移设备和孵育盘清洁,远离外部污染源。

[1] [2]

  1. 本文档由拟态章鱼编写,由恺凌、Eric校对审核。
  2. [1]Western Blot 原理、protocol--及条带常见问题分析.与你畅游世界