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=== DNA/RNA ===

==== 一些电泳相关 ====

* 众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
* 核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
* 硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸 比较脆；后者靠共价键结合核酸 比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）

==== PCR（及其衍生操作） ====

* T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性 高浓度下表现聚合酶活性 应用于3'末端标记 同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
** 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记 现在多用于测序

* 引物设计原则（老生常谈系列）
** 长度18－30
** 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
** 碱基最好随机分布 同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
** Tm在55－80
** 3'端最好以G/C结尾 两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
** 5'端可以灵活修饰 影响没有那么大
** 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
* 甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键 进而打开二级结构 提高产量
* RT－PCR的ct法要看本底基因 本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照 用于排除RNA提取效率 反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差

===== 一些奇怪的PCR =====

====== 巢式PCR ======
两对引物 第一轮扩增后要对产物进行稀释 避免外引物产生干扰 可以极大提高反应的特异性

====== 5'/3'RACE ======
适用于RNA一端已知一端未知

先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴 然后利用已知片段和尾巴进行PCR

用两对引物增强特异性

==== 提取 ====

===== DNA =====

====== 酚－氯仿抽提 ======
SDS和蛋白酶K裂解细胞并降解蛋白质 加入苯酚/氯仿/异戊醇混合物后离心 分为三层

上层（水相）：DNA＆RNA

中层（白色的一坨）：变性的蛋白质

下层（有机相）：细胞碎片＆脂质

将水相转移并加入乙醇/异丙醇 DNA会形成白色絮状沉淀

酚用于变形并抽提DNA白纸 氯仿增强去蛋白效果并抽提氯仿 同时促进相分离

'''注：这个方法里涉及到异戊醇和异丙醇两个长得挺像的东西 前者用作消泡剂 后者用来沉淀DNA'''

====== 柱层析法 ======
高盐条件下裂解细胞并上柱 DNA带负点的磷酸骨架会通过盐桥（也有说疏水作用？）吸附在硅胶膜上 用乙醇缓冲液洗去杂质 再用TE缓冲液/水洗脱 得到DNA

====== 碱裂解法 ======
试剂一：Tris－HCl和葡萄糖（也可以是水 有时会有EDTA和RNaseI）重悬菌体

试剂二：NaOH和SDS 用来裂解细胞 变性 不能剧烈震荡 会把基因组DNA打碎 导致后续质粒混入基因组DNA

试剂三：KAc＆HAc 缓冲液 使碱性环境变为中性 质粒复性 而较为复杂的基因组DNA来不及复性 形成白色絮状沉淀

不过试剂一里不用特意加RNase 毕竟这玩意哪都有

===== RNA =====

====== TRIzol法 ======
TRIzol试剂含有异硫氰酸胍和苯酚 异硫氰酸胍是变性剂 灭活RNase 苯酚溶解蛋白质 加入氯仿后分层

上层（水相）：RNA

中层（也是白的一坨）：DNA 蛋白质

下层（有机相）：蛋白质 脂质

提取水相加入乙醇/异丙醇 沉淀RNA

和酚－氯仿的区别在于环境pH 酚－氯仿为中性环境 此时DNA结构稳定且可溶 倾向于留在水相里；而TRIzol法环境为较强的酸性 DNA亲水性下降并发生酸变性 碱基暴露 疏水性增强（一个小小的知识点：嘌呤碱对酸更敏感）

====== 柱层析法 ======
和DNA柱层析法类似 裂解液里会加入异硫氰酸胍或DEPC抑制RNase的活性 通常还会在柱上加上DNase

==== 测序 ====

* sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳 琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
* 一代末端终止 二代边合成边测序 三代单分子合成测序
** 准确率上1＞2＞3
** 读长3＞1＞2
** 效率3＞2＞1
** 现在最常用的是二代
* 某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA

==== 检测 ====

* 280吸光

=== 蛋白质（氨基酸） ===

==== 一些电泳相关 ====

* 如果是免疫法的话直接考马斯亮蓝染胶 不用blot转膜
* PAGE胶的制备：化学催化剂AP由TEMED催化产生硫酸自由基 激活Acr（丙烯酰胺）形成长链 由Bis（甲叉双丙烯酰胺）交联形成凝胶；光催化剂核黄素在TEMED和光照条件下还原再被氧化形成自由基进而聚合
** 化学聚合的启动需要TEMED推动 光聚合不需要（光聚合法中没有TEMED也能凝固 不过会比较慢）
** 光催化一开始需要氧气 聚合过程中氧气必须隔绝 因为氧分子会阻止碳链的延长和聚合
** Acr和Bis有神经毒性 凝固后毒性基本没有但仍然不建议食用（啊喂）
* 使用SDS时加热可以使其结合更加充分 可以使蛋白质转变成线性棒状结构
* PG－PAGE：梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 越往下孔径越小
* 火箭电泳（单向径向免疫扩散电泳）：在制胶的时候加入一定浓度梯度的抗体 胶凝固后打孔 在孔里加入抗原沉淀 抗原抗体只有在恰当的浓度下才能形成沉淀 抗原过多或抗体过多都比较可溶 所以只有前段有沉淀线
** 可以用于检测特定抗原的含量 抗原浓度越高 沉淀峰也越高

==== 一些层析相关 ====

==== 测序 ====

* Sanger法：2'4'二硝基氟苯和蛋白质α－氨基反应然后用酸水解（一般肽链会被完全水解）得到DNP－氨基酸 黄色 也可以和别的氨基反应 不一定测出的是N端蛋白质 反应条件弱碱性
* Edman法：PITC在碱性条件下和α－氨基反应得到PTC－肽链 在无水强酸中被切割下来得到PTH－氨基酸和新的肽链 可以自动化 有读长限制 反应条件弱碱性

==== 提取 ====

==== 检测（和一些特异反应） ====

* 260吸光
* ELISA
** 直接法：抗原吸附在固相载体上 仅使用酶标一抗 优点是方便快速 交叉反应性低；缺点是成本高 信号不够强 灵敏度差
** 间接法：抗原吸附在固相载体上 加入含有待测一抗的样本 洗板后加酶标二抗 用来检测抗体 优点是高灵敏度和高灵活度；缺点是有非特异性结合的风险 比直接法麻烦
** 夹心法：抗体吸附在板上 加待测样本 加检测抗体 形成抗体－抗原－抗体的三明治结构 洗板 加酶标二抗 洗板 加显色底物
*** 分为直接和间接法 直接法不用加酶标二抗
*** 优点是灵敏度高特异性高 适用于复杂样本；缺点是对抗体要求高
** 竞争法：分参考臂和检测臂 把抗原包被在孔板上 加待测样本（含有未知浓度的游离抗原）和固定量的酶标抗体 抗原浓度高则信号弱 抗原浓度低则信号强
* 考马斯 R250更灵敏 比G250多两个甲基 G250更常用 定量用G250 抗干扰性好 灵敏度高 会被去垢剂干扰 受蛋白质种类影响大
* 凯氏定氮法 一堆奇妙的试剂得到氨然后滴定 结果×8 三氯氰胺.jpg
* 双缩脲：肽键在碱性环境下和Cu<sup>2＋</sup>离子结合形成紫色络合物 可以定量检测 灵敏度较低
* BCA：在碱性环境下肽键把Cu<sup>2＋</sup>还原成Cu<sup>＋</sup> Cu<sup>＋</sup>再和BCA反应生成紫色络合物 562nm最大吸光 复合物稳定 灵敏度高 会被强还原剂干扰 受蛋白质种类影响大
** 我知道这很怪 但是 这个反应实际上是肽键旁边的α－碳院子发生一次去质子化－电子转移－得到质子的过程 其结果可以看作生成了一个烯醇式结构作为中间过渡态 真正的电子供体是α－碳上那个氢原子
* lowry：双缩脲plus版 先双缩脲再加folin－酚 产生深蓝色物质 比双缩脲灵敏但繁琐耗时长 易被干扰
* 荧光法：不常考 顾名思义用荧光染料染 灵敏度/特异性高 成本高 需要标准曲线
* 茚三酮：和α－氨基反应 蛋白质的游离氨基不支持产生明显实验结果 用来检测氨基酸 其他氨基酸为紫色 脯氨酸为黄色
* ellman反应：（别和edman搞混）二硝基苯甲酸 弱碱条件下和巯基反应 产物412nm有吸光 拿来判断游离巯基含量
* 黄色反应：芳香族和浓硝酸反应变黄 再加浓碱液变橙黄
* 坂口反应：精氨酸特异性反应 α－萘酚和次氯酸钠反应产生红色产物

==== 互作检测 ====

*酵母双杂交 BD结合DNA 一般诱饵蛋白和BD融合；AD和猎物蛋白融合