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=== DNA/RNA ===

==== 提取 ====

===== DNA =====

====== 酚－氯仿抽提 ======
SDS和蛋白酶K裂解细胞并降解蛋白质 加入苯酚/氯仿/异戊醇混合物后离心 分为三层

上层（水相）：DNA＆RNA

中层（白色的一坨）：变性的蛋白质

下层（有机相）：细胞碎片＆脂质

将水相转移并加入乙醇/异丙醇 DNA会形成白色絮状沉淀

酚用于变形并抽提DNA白纸 氯仿增强去蛋白效果并抽提氯仿 同时促进相分离

'''注：这个方法里涉及到异戊醇和异丙醇两个长得挺像的东西 前者用作消泡剂 后者用来沉淀DNA'''

====== 柱层析法 ======
高盐条件下裂解细胞并上柱 DNA带负点的磷酸骨架会通过盐桥（也有说疏水作用？）吸附在硅胶膜上 用乙醇缓冲液洗去杂质 再用TE缓冲液/水洗脱 得到DNA

====== 碱裂解法 ======
试剂一：Tris－HCl和葡萄糖（也可以是水 有时会有EDTA和RNaseI）重悬菌体

试剂二：NaOH和SDS 用来裂解细胞 变性 不能剧烈震荡 会把基因组DNA打碎 导致后续质粒混入基因组DNA

试剂三：KAc＆HAc 缓冲液 使碱性环境变为中性 质粒复性 而较为复杂的基因组DNA来不及复性 形成白色絮状沉淀

不过试剂一里不用特意加RNase 毕竟这玩意哪都有

转染的话我们要超螺旋的质粒

===== RNA =====

====== TRIzol法 ======
TRIzol试剂含有异硫氰酸胍和苯酚 异硫氰酸胍是变性剂 灭活RNase 苯酚溶解蛋白质 加入氯仿后分层

上层（水相）：RNA

中层（也是白的一坨）：DNA 蛋白质

下层（有机相）：蛋白质 脂质

提取水相加入乙醇/异丙醇 沉淀RNA

和酚－氯仿的区别在于环境pH 酚－氯仿为中性环境 此时DNA结构稳定且可溶 倾向于留在水相里；而TRIzol法环境为较强的酸性 DNA亲水性下降并发生酸变性 碱基暴露 疏水性增强（一个小小的知识点：嘌呤碱对酸更敏感）

====== 柱层析法 ======
和DNA柱层析法类似 裂解液里会加入异硫氰酸胍或DEPC抑制RNase的活性 通常还会在柱上加上DNase

==== PCR（及其衍生操作） ====

* T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性 高浓度下表现聚合酶活性 应用于3'末端标记 同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
** 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记 现在多用于测序

* 引物设计原则（老生常谈系列）
** 长度18－30
** 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
** 碱基最好随机分布 同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
** Tm在55－80
** 3'端最好以G/C结尾 两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
** 5'端可以灵活修饰 影响没有那么大
** 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
* 甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键 进而打开二级结构 提高产量
* RT－PCR的ct法要看本底基因 本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照 用于排除RNA提取效率 反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差

===== 一些奇怪的PCR =====

====== 巢式PCR ======
两对引物 第一轮扩增后要对产物进行稀释 避免外引物产生干扰 可以极大提高反应的特异性

====== 5'/3'RACE ======
适用于RNA一端已知一端未知

先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴 然后利用已知片段和尾巴进行PCR

用两对引物增强特异性

====== 甲基化特异性PCR（MSP） ======
亚硫酸盐处理时非甲基化的C会脱氨转化为尿嘧啶 对此设计两组引物 一种是T 一种是C（用于确保亚硫酸盐处理完全） 引物要覆盖GpC

==== 测序 ====

* sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳 琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
* 一代末端终止 二代边合成边测序 三代单分子合成测序
** 准确率上1＞2＞3
** 读长3＞1＞2
** 效率3＞2＞1
** 现在最常用的是二代
* 某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA

==== 一些重组 ====

* 枯草芽孢杆菌不致病…
* Gateway：利用位点特异性重组 模仿λ噬菌体整合进大肠杆菌基因组的机制 优点是高度模块化和通用性 效率接近100％；缺点是初始构建入门克隆需要时间且无法做到无缝克隆 基因两侧会留下疤痕 是专利系统 贵
* GoldenGate（看到我去吃麦麦）：大名鼎鼎的II S型限制性内切酶 见下文 优点是高效且酶切连接在同一个管子里反应 可以做到无缝 一般合成生物学用这个；缺点是引物设计比较烦
* Gibson Assembly：原理是同源序列重组 让相邻DNA片段末端拥有20－40bp的同源重组末端 在管子里同时有5'核酸外切酶（暴露出3'末端 形成重叠）DNA聚合酶（利用重叠区作为模板 填补外切酶产生的缺口）DNA连接酶 优点是简单快捷且组装效率很高；缺点是引物成本较高 片段多的时候效率会低
* In－Fushion：类似Gibson的前身 原理同样是同源序列重组 使用In－Fushion酶（一种专有的DNA聚合酶 有5'→3'外切酶活性和链置换酶活性）形成开环分子 再转入大肠杆菌中由细胞内修复系统完成缺口填补和连接 优点是简单快速 对线性化载体和PCR片段的组装非常高效；缺点是这玩意同样是有专利的 贵

==== 一些电泳相关 ====

* 众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
* 核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
* 硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸 比较脆；后者靠共价键结合核酸 比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）

==== 检测 ====

* 280吸光
* 福尔根反应 特异性染DNA

==== 基因编辑！ ====

* ZFN：利用锌指蛋白识别碱基 一个模块可以特定识别三个碱基 利用多个模块的串联来识别一段较长的特异性序列；利用FokI作为内切酶 二聚体有活性（所以需要设计一对ZFN 且结合位点有一定距离 让两个单体能相遇并形成有活性的剪刀）
* TALEN：定位系统是TALE蛋白序列（来自植物病原菌） 一个模块识别一个碱基 同样使用FokI作为剪刀
* CRISPR－Cas（全体起立！）：用RNA定位 分子剪刀是Cas蛋白 向导RNA和Cas蛋白形成复合物 通过碱基互补配对找到目标位点（旁边还要有NGG） 由Cas9执行切割（结构域HNH切割和sgRNA互补配对的链 RuvC切割非互补链）

==== 一些奇奇怪怪…… ====

* 四种限制性内切酶
** I型：切割位点和识别位点不同 切割位点不确定 需要ATP SAM和镁离子
** II型：识别回文序列 切割位点和识别位点一致（除了II S型）不依赖ATP 只要镁离子就行
** II S型：GoldenGate里会用到 在识别位点的下游 切割位点确定
** III型：大致和I型相同
** IV型：切割位点仅限甲基化和羟甲基化的C 切割位点和识别位点相同 多用于表观遗传的检测
** 在高盐 甘油 DMSO Mn<sup>2＋</sup> 酶量过多的情况下限制酶会出现星活性开始乱切
* 染色体构象捕获
** 先用甲醛处理细胞让DNA片段交联 再将DNA切割成片段 接着进行连接反应（原本三维空间中靠的很近的DNA有更高的概率被连接在一起 形成嵌合DNA分子） 解除交联 纯化DNA 接着测序
** 3C：通过特异性引物PCR来验证一对特定的基因座之间是否存在交互 单点对单点
** 4C：在3C的基础上将连接产物环化 针对一个特定位点的引物去扩增所有和它交互的偏酸 单点对多点
** 5C：针对一个感兴趣的大区域设计大量覆盖该区域的引物 对3C文库进行多重PCR 多点对多点
** Hi－C：连接前对DNA片段进行末端标记 富集并坚定所有连接产物
* 基因工程/分子里的洋文序列
** SD序列：原核生物特有 为核糖体定位起始密码子提供条件 真核生物起类似作用的是帽子
** Kozak序列：真核生物翻译起始处环绕起始密码子的序列 优化翻译其实效率
** Pribow序列：原核 转录起始时RNAP结合的区域
** Goldberg－Hogness序列：其实就是TATAbox…这玩意儿应该不咋会考
* 一些启动子：
** SV40：哺乳 强启动子
** CaMV：花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子 常用于植物 强启动子
** U6：由RNAP III转录 由RNAP III转录的启动子特点一般就是表达量中等且稳定
** H1：也是由RNAP III转录 稳定且表达量不高 常常用于shRNA来表达KD基因（注意不是KO 无法完全抑制基因表达）

=== 蛋白质（氨基酸） ===

==== 一些电泳相关 ====

* 如果是免疫法的话直接考马斯亮蓝染胶 不用blot转膜
* PAGE胶的制备：化学催化剂AP由TEMED催化产生硫酸自由基 激活Acr（丙烯酰胺）形成长链 由Bis（甲叉双丙烯酰胺）交联形成凝胶；光催化剂核黄素在TEMED和光照条件下还原再被氧化形成自由基进而聚合
** 化学聚合的启动需要TEMED推动 光聚合不需要（光聚合法中没有TEMED也能凝固 不过会比较慢）
** 光催化一开始需要氧气 聚合过程中氧气必须隔绝 因为氧分子会阻止碳链的延长和聚合
** Acr和Bis有神经毒性 凝固后毒性基本没有但仍然不建议食用（啊喂）
* 使用SDS时加热可以使其结合更加充分 可以使蛋白质转变成线性棒状结构
* PG－PAGE：梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 越往下孔径越小
* 火箭电泳（单向径向免疫扩散电泳）：在制胶的时候加入一定浓度梯度的抗体 胶凝固后打孔 在孔里加入抗原沉淀 抗原抗体只有在恰当的浓度下才能形成沉淀 抗原过多或抗体过多都比较可溶 所以只有前段有沉淀线
** 可以用于检测特定抗原的含量 抗原浓度越高 沉淀峰也越高

==== 一些层析相关 ====

* 离子交换
* 疏水
* 凝胶过滤/尺寸排阻
* 亲和
* 薄层
** 根据原理不同可以分为吸附层析 分配层析 离子交换层析
** 吸附：固定相为吸附剂 根据组分与吸附剂表面活性微店吸附能力强弱来分离 一般极性越强的组分吸附作用越强 Rf值越大 如植物色素的分离就是用的吸附层析
** 分配：固定相为液态！由于我们不能让一层水在玻璃板/塑料薄板上稳定存在 一般我们会把液体负载在一个固体支撑物上（比如硅胶板/氧化铝板）其表面覆盖着一层液体膜 为试剂的固相 分离原理是组分在流动性和固定相间溶解度不同 我们跑的氨基酸薄膜层析就是这种
** 离子交换：顾名思义 参考柱层析里的离子交换

==== 结构检测 ====

===== 一级 =====
* Sanger法：2'4'二硝基氟苯和蛋白质α－氨基反应然后用酸水解（一般肽链会被完全水解）得到DNP－氨基酸 黄色 也可以和别的氨基反应 不一定测出的是N端蛋白质 反应条件弱碱性
* Edman法：PITC在碱性条件下和α－氨基反应得到PTC－肽链 在无水强酸中被切割下来得到PTH－氨基酸和新的肽链 可以自动化 有读长限制 反应条件弱碱性
* 矩阵也用 PAM和BLOSUM 相对而言BLOSUM更有生理意义一点

===== 二级 =====

* Chou－Fasman GOR PHD NNSSP（一串神秘字母）

===== 三级 =====

* X晶体衍射：优点是分辨率极高 对分子量无限制 缺点是有些蛋白没法结晶 且结晶中的结构是静态的 无法反应动态变化 结构也可能扭曲
* 核磁共振：可以研究生物大分子的动态过程 也能用来研究膜蛋白 缺点是有分子量限制 特别大的蛋白用不了 且分辨率一般较低
* 冷冻电镜：分单颗粒和电子断层成像
** 低温电镜单颗粒分析：对包被在冰膜中的相同的 分散的 随机取向的大量颗粒性样品拍照
** 电子断层成像：对样品中同一物体在不同倾角下连续拍照
* 对于预测：如果同源性＞50％则直接同源建模法（SATSS－MODEL）如果＜30％且有已知结构的同源蛋白质模板则用穿线法 如果没有就从头分析（Rosetta de novo）<s><sub>（不过现在一般扔给AlphaFold2）</sub></s>

==== 检测（和一些特异反应） ====

* 260吸光
* ELISA
** 直接法：抗原吸附在固相载体上 仅使用酶标一抗 优点是方便快速 交叉反应性低；缺点是成本高 信号不够强 灵敏度差
** 间接法：抗原吸附在固相载体上 加入含有待测一抗的样本 洗板后加酶标二抗 用来检测抗体 优点是高灵敏度和高灵活度；缺点是有非特异性结合的风险 比直接法麻烦
** 夹心法：抗体吸附在板上 加待测样本 加检测抗体 形成抗体－抗原－抗体的三明治结构 洗板 加酶标二抗 洗板 加显色底物
*** 分为直接和间接法 直接法不用加酶标二抗
*** 优点是灵敏度高特异性高 适用于复杂样本；缺点是对抗体要求高
** 竞争法：分参考臂和检测臂 把抗原包被在孔板上 加待测样本（含有未知浓度的游离抗原）和固定量的酶标抗体 抗原浓度高则信号弱 抗原浓度低则信号强
* 考马斯 R250更灵敏 比G250多两个甲基 G250更常用 定量用G250 抗干扰性好 灵敏度高 会被去垢剂干扰 受蛋白质种类影响大
* 凯氏定氮法 一堆奇妙的试剂得到氨然后滴定 结果×8 三氯氰胺.jpg
* 双缩脲：肽键在碱性环境下和Cu<sup>2＋</sup>离子结合形成紫色络合物 可以定量检测 灵敏度较低
** 氢氧化钠先加入再加入硫酸铜 制造碱性环境 可以分液长期保存 常温反应
** 注意和斐林区分 斐林的氢氧化钠和硫酸铜先混合 生成氢氧化铜 因此要现用现配 反应要加热
* BCA：在碱性环境下肽键把Cu<sup>2＋</sup>还原成Cu<sup>＋</sup> Cu<sup>＋</sup>再和BCA反应生成紫色络合物 562nm最大吸光 复合物稳定 灵敏度高 会被强还原剂干扰 受蛋白质种类影响大
** 我知道这很怪 但是 这个反应实际上是肽键旁边的α－碳院子发生一次去质子化－电子转移－得到质子的过程 其结果可以看作生成了一个烯醇式结构作为中间过渡态 真正的电子供体是α－碳上那个氢原子
* lowry：双缩脲plus版 先双缩脲再加folin－酚 产生深蓝色物质 比双缩脲灵敏但繁琐耗时长 易被干扰
* 荧光法：不常考 顾名思义用荧光染料染 灵敏度/特异性高 成本高 需要标准曲线
* 茚三酮：和α－氨基反应 蛋白质的游离氨基不支持产生明显实验结果 用来检测氨基酸 其他氨基酸为紫色 脯氨酸为黄色
* ellman反应：（别和edman搞混）二硝基苯甲酸 弱碱条件下和巯基反应 产物412nm有吸光 拿来判断游离巯基含量
* 黄色反应：芳香族和浓硝酸反应变黄 再加浓碱液变橙黄
* 坂口反应：精氨酸特异性反应 α－萘酚和次氯酸钠反应产生红色产物

==== 互作检测 ====

*酵母双杂交 BD结合DNA 一般诱饵蛋白和BD融合；AD和猎物蛋白融合
*FRET：用来检测直接互作 难以显示瞬时互作 假阴性率更高
*BiFC：两个蛋白上带一个荧光分子的N端和C端 可以显示瞬时互作 时间轴上所有的互作都会显示 假阳性率更高 也是显示直接互作的
*免疫共沉淀：体内实验 相对酵母双杂交更自然一点
*GST－pulldown：体外实验 但可以说明直接互作
*SRP：一个很物理的东西 具体是先把一种蛋白偶练在金膜传感芯片上 再加入另一种分子 如果互作那么通过各种光学元件后会有参数改变 可以计算解离常数 无需标记蛋白质 可以较大程度地还原生物内的环境（不止蛋白质 其他大分子的互作也可以）
*EMSA（不知道扔哪我就扔这里了）老生常谈系列 可以在反应中加入特异性抗体 电泳迁移率更慢 称为超迁移 用来进一步检验 确保蛋白质没有加错

=== 样品处理 ===

* 组织匀浆器更适合软材料
* 研钵适合硬材料 但软的材料也能用 加个液氮
* 自溶法适用于肝脏这种富含酶的组织
* 甲醛固定的可以很大程度地保留蛋白质的抗原表位 所以依赖免疫原理的荧光组织固定常用甲醛

==== 染色 ====

===== 染料 =====

* 酸碱染料指染料本身成酸性/碱性或它带负电/正电 缓冲液的pH可以起到一定作用 比如改变物质的解离状态
** 常见碱性染料：苏木精 杨红 番红 结晶紫 硫堇 甲苯胺蓝 甲基绿 美蓝 孔雀铜绿 焦油紫
** 常见酸性染料：曙红 亮绿 橘黄G 酸性品红 苦味酸 水溶性苯胺蓝

=== 细胞 ===

==== 分选 ====

* 流式：前向散射角（FSC）反映细胞大小 侧向散射角（SSC）反映细胞颗粒度/复杂程度
* 关于密度梯度离心（速率区带）＆平衡密度梯度离心（等密度区带）
** 原理：沉降速度＆浮力密度
** 介质：甘油/蔗糖＆CsCl
** 需预制梯度＆可自成梯度
** 依赖于时间＆不依赖时间

==== 一些特异反应不好往前面放的 ====

* 联苯胺：检测过氧化氢酶 过氧化氢酶催化过氧化氢分解成水和氧气 氧气氧化联苯胺生成联苯胺蓝 强氧化性试剂会导致假阳性
* 中性红：活细胞只有液泡染上；刚死的细胞全部染色；死了很久的细胞全部染不上