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== 13.1 简介 ==
氯离子通道 (CLC) 家族的成员都具有进化保守的同型二聚体结构和对阴离子的选择性。尽管名称如此，但许多 CLC 实际上并不是通道，而是次级活性转运蛋白，它们催化两个 Cl– 以相反方向跨细胞膜与一个 H+ 进行化学计量交换。也就是说，它们利用一个离子沿其电化学梯度向下流动的能量将另一个离子电化学泵送上坡。除了失去将转运蛋白与通道分开的化学计量底物偶联外，单个 CLC 同源物还表现出令人惊讶的生物物理特性多样性，包括电压依赖性、辅助亚基和对 H+、Cl– 和 Ca2+ 的敏感性的差异。这些不同特征背后的分子原理才刚刚开始阐明，并可能为 CLC 在体内如何进行功能调节提供进一步的见解。

CLC 存在于所有门类中。在人类（和大多数其他哺乳动物）中，有九个同源物（图 13.1）。CLC 通道在质膜上表达，而 CLC 转运蛋白位于细胞内的内体、溶酶体、突触小泡和各种特殊位置，例如破骨细胞褶皱边界。除了亚细胞定位的差异外，CLC 通道和转运蛋白在特定细胞类型和组织中表达不同，从而导致不同的生理功能。

== 13.2 生理作用 ==
本章将简要讨论每种哺乳动物 CLC 亚型的生理学，作为 Bretag 等人的序言。在卷 III，第 11 章。还将讨论选定的非哺乳动物

CLC。可以在

Jentsch 和 Pusch (2018) 中找到有关 CLC 生理学的全面回顾。

13.2.1 CLC 通道

CLC-0 是 CLC 家族的创始成员，在鱼雷电器官中高度表达，鱼雷电器官是一堆细胞，它们一起形成用于电击猎物的高电流电池。在这里，CLC-0 为阴离子电流流动提供了低电阻通路 (Miller, 2014)。

CLC-0 也在鱼雷骨骼肌中表达，据推测它在那里起着类似于哺乳动物 CLC-1 的作用，如下所述。

图 13.1

CLC 家族树。九个人类同源物（在左侧的图中用实线表示）具有广泛的生理功能。 CLC 家族的创始成员是来自鱼雷鳐的 CLC-0，与哺乳动物骨骼肌同源物 CLC-1 最为密切相关。来自大肠杆菌的 CLC-ec1 是第一个被发现为反向转运蛋白的 CLC（Accardi 和 Miller，2004 年），并已成为该家族的典范。（艺术作品版权归 Anna Koster 所有，2021 年；经许可使用。）

CLC-1 通道主要存在于骨骼肌中。与其他可兴奋组织相比，骨骼肌还采用电压依赖性 CLC-1 通道的开放，而其他组织的动作电位复极化仅依赖于 K+ 通道的开放。这种机制可防止肌肉纤维在 T 小管狭窄管腔中过度积累 K+ 时发生的过度兴奋。 CLC-1 在运动过程中根据细胞代谢进行动态调节。该通道被细胞内 ATP 抑制，这种效应在低细胞内 pH 值时被放大。基于这些体外观察，有人提出，在剧烈运动期间肌肉中酸的积累会降低 Cl- 电流，并在缺氧肌肉进行无氧呼吸时在短期内维持动作电位激发。相反，持续运动期间 ATP 的消耗可能会降低 CLC-1 抑制，导致动作电位激发减少并与肌肉疲劳相关（Pedersen 等人，2016 年；Altamura 等人，2020 年）。CLC-1 的转录水平在发育和衰老过程中表现出不同的表达模式，出生后急剧增加，在衰老过程中降低。快肌和慢肌表型之间的转录水平也不同，快肌纤维的表达水平较高。

CLC-2 在多种组织中广泛表达。在肺和肠的上皮膜中，CLC-2 位于基底侧膜，参与 Cl– 的吸收。在肾上腺中，已从肾小球细胞中记录到 CLC-2 电流。虽然其生理功能尚不完全清楚，但人类 CLC-2 的功能获得性突变会导致醛固酮增多症（见第 III 卷第 11 章），可能是通过促进细胞去极化导致下游醛固酮释放。

在中枢神经系统 (CNS) 中，CLC-2 在神经元和神经胶质细胞中表达。在神经元中，

CLC-2 在快速放电抑制性突触中发挥作用，促进 Cl- 流出，从而

防止长时间同步期间 Cl- 过载zed 网络振荡。也有人提出 CLC-2 在神经元中具有非突触功能。更彻底地表征 CLC-2 在不同神经元群体中的亚细胞定位对于阐明特定的神经元功能至关重要。在神经胶质细胞中，CLC-2 与一种称为 GlialCAM 的粘附分子结合（Jeworutzki 等人，2014 年）。GlialCAM 消除了通道电压依赖性，并且是 CLC-2 在细胞间接触和血管周围星形胶质细胞末端定位所必需的。CLC-2 与 GlialCAM 的结合可以促进这些细胞连接处显着的电压非依赖性 Cl- 通量，从而帮助神经元活动后快速清除 K+。CLC-Ka 和 CLC-Kb 在肾脏和内耳中表达（Fahlke 和 Fischer，2010 年）。这两种蛋白质都与一种称为 barttin (BSND) 的 β 亚基相关，而 barttin 对于运输和插入质膜是必不可少的。在肾脏内，CLC-Ka 和 CLC-Kb 分别在亨利环的细 (t) 和粗 (T) 升支 (AL) 中表达。定位到 tAL 表明通过 CLC-Ka 的 Cl- 通量有助于在肾髓质中建立陡峭的溶质浓度梯度，从而驱动集合管中的水吸收。支持这一机制的是，在限制水分的情况下，小鼠体内 CLC-Ka 的损失会增加尿量。在 TAL 中，CLC-Kb 有助于大量 NaCl 的重吸收。在内耳中，CLC-Ka 和 CLC-Kb 在耳蜗血管纹的边缘上皮细胞和前庭器官的暗细胞中表达。在这里，它们具有相互冗余的功能，以实现 K+ 分泌（通过 Cl– 的平行移动），这对于驱动毛细胞机械转导所需的电化学梯度是必要的。

=== 13.2.2 CLC 转运蛋白 ===
人们对 CLC-3、CLC-4 和 CLC-6 的生理作用知之甚少，它们在细胞内膜中广泛表达（Jentsch 和 Pusch，2018 年）。CLC-3 位于晚期内体、突触小泡和突触样微泡中。基因敲除小鼠模型显示这些隔室的酸化减少，但 CLC-3 的具体生理功能尚不确定。尽管如此，基因敲除小鼠的表型（包括出生后严重的神经退化）暗示了核心中枢神经系统功能。

CLC-4 与 CLC-3 密切相关，也广泛表达，包括大脑。

CLC-4 的生理作用几乎完全未知，但人类中罕见的功能丧失

CLC-4 突变与学习和行为缺陷以及

癫痫症有关。相反，CLC-4 基因敲除小鼠不会表现出相同的表型

并且大脑中没有明显的形态变化。CLC-6 与 CLC-7 的关系比与 CLC-3 和 CLC-4 的关系更密切。CLC-6 转录本存在于多种组织中，包括肠道、胰腺、肺和气管的上皮细胞，以及

睾丸、大脑、脊髓、眼睛和三叉神经/背根神经节。尽管在转录水平上广泛表达，但 CLC-6 蛋白的检测主要限于大脑，并且似乎局限于晚期内体。CLC-6 基因敲除动物表现出溶酶体储存异常，海马和背根神经节神经元的轴突肿胀。CLC-5 主要在肾脏的内体中表达，在那里它在内吞作用中起着关键作用 (Zifarelli, 2015; Gianesello 等人，2020)。它在近端小管细胞中高度表达，这是大多数小蛋白吸收发生的地方。相应地，CLC-5 基因敲除小鼠和人类疾病突变（见第 III 卷，第 11 章）与低分子量蛋白尿有关。对 CLC-5 基因敲除小鼠的系统分析揭示了 CLC-5 在影响肽激素水平方面的生理重要性，这可导致广泛的生理效应，最显著的是磷酸盐和钙调节。在发现 CLC-5 是一种转运蛋白而非通道之前，人们假设该蛋白质充当 Cl- 分流器，中和 H+ 通过 V 型 H+-ATPase 移动而产生的正电荷积累，从而促进内体区室的酸化。旨在去除 H+ 转运（同时保留 Cl- 跨内体膜移动）的 CLC-5 敲入突变体表明，反向转运功能对于 CLC-5 在内吞作用中的作用至关重要，但对于正常的内体酸化则并非如此。CLC-5 在调节 Cl- 和/或 H+ 水平方面的详细作用仍有待阐明。 CLC-7 是一种普遍存在的转运蛋白，位于溶酶体 (Zifarelli, 2015)。在破骨细胞中，CLC-7 存在于溶酶体和质膜的褶皱边界中，

这是一个与骨骼接触的高酸性区域，对骨吸收至关重要。鉴于

普遍表达CLC-7 离子的组成型敲除动物不出所料地表现出许多缺陷（包括严重的视网膜和中枢神经系统退化），并且它们在出生后不久死亡。CLC-7 在溶酶体中的作用是调节 Cl– 浓度还是 pH 值一直存在争议。与溶酶体过酸化相关的人类功能获得突变体支持了其在维持溶酶体 pH 值方面的作用（Nicoli 等人，2019 年）。在植物中，CLC 在模式生物拟南芥 (At) 中得到了最广泛的研究。七个 AtCLC 同源物在细胞内膜中表达，可能充当转运蛋白。AtCLC-a 在阴离子渗透途径中发生突变，使其对 NO3– 的选择性超过 Cl–，并且该同源物负责 NO3– 转运到液泡中。由于氮通常是一种限制性营养物质，因此这种运输和储存对植物生理学至关重要。其他 AtCLC 同源物参与耐盐性和气孔开放。

在大肠杆菌中，有两个 CLC 同源物似乎起着相互冗余的作用。需要对两个同源物进行双重敲除，以揭示它们在使大肠杆菌在极端酸性冲击下存活方面的作用。CLC 还被认为对专性微生物嗜酸菌的日常生活很重要。

== 13.3 亚基多样性和基本结构组织 ==
所有 CLC 都具有相同的基本同二聚体结构组织 (Jentsch 和 Pusch,

2018)，并且通常不能仅根据结构将 CLC 通道与转运蛋白区分开来。与许多离子通道不同，CLC Cl– 和 H+ 渗透途径包含在单个亚基内（图 13.2A），其中多个亚基聚集在一起形成对称孔。高度保守的谷氨酸残基（Gluex）位于 Cl– 和 H+ 渗透途径的交汇处。Gluex 对转运蛋白中的 H+ 移动至关重要，并充当转运蛋白和通道中 Cl– 转运的门。CLC 亚基在功能上是独立的，当发生突变以破坏二聚体界面时可以作为单体运行。然而，亚基之间的相互作用

图 13.2

CLC 结构组织。（A）CLC-ec1 结构，突出显示同型二聚体每个亚基内的 Cl– 和 H+ 渗透途径。这些途径沿着细胞外入口共享，并在 Gluex 处分歧，Gluex 是 H+ 转运所必需的关键残基。 Gluex 控制 CLC 转运蛋白和一些 CLC 通道中的阴离子途径（见右侧对齐）。（B）牛 CLC-K (bCLC-K) 结构。CBS 结构域存在于所有真核生物和一些原核生物同源物中。（C）CLC 倒置重复结构域。左图：单个亚基的侧面和顶视图，以不同的灰色显示倒置重复域。中间：重复域的拓扑图，颜色表示同源螺旋。螺旋 D–H（重复 1）位于膜的细胞内侧，而相应的螺旋 L–P（重复 2）位于膜的细胞外侧。右图：重复的结构同源性。结构在重复 2 围绕与膜平行的轴旋转后对齐。螺旋颜色与拓扑图中所示的颜色相匹配。 

似乎对正常的生物物理和生理功能至关重要。CLC 二聚体界面的突变通常会影响常见的门控（稍后介绍）。CLC 异二聚化的能力已在 CLC-1/CLC-2 和 CLC-4 与 CLC-3 和 CLC-5 中得到证实。CLC 异二聚化的生理后果尚未得到充分探索。

所有真核生物和一些原核生物 CLC 都具有一对细胞内胱硫醚 β-合酶 (CBS) 结构域。该蛋白质区域在几种 CLC 结构中以高分辨率可见，形成与跨膜结构域细胞内表面相邻的二聚体复合物（图 13.2B）。 CLC CBS 结构域的确切功能尚未完全了解，但这些结构域的生理重要性已由该区域（CLC-Kb、CLC-1、CLC-5 和 CLC-7）中的大量致病突变证明。

其中许多突变会改变门控动力学和电压依赖性，这表明这些结构域在通道/转运蛋白调节中起着作用。在膜内，CLC 同型二聚体的每个亚基包含 16 个螺旋，许多螺旋仅部分穿过膜。这些螺旋由两个同源结构域组成，以倒置拓扑排列（图 13.2C）。这种倒置重复对称性是许多类转运蛋白的特征。 13.4 门控

=== 13.4.1 CLC 通道 ===
Chris Miller 对鱼雷电鳐 CLC-0 氯离子通道的开创性研究

（Miller，2014）为我们了解 CLC 通道门控奠定了基础。CLC-0

有两种主要门控模式。第一种模式称为“快速”或“原孔”门控ng，发生在毫秒时间尺度上，并独立地作用于同型二聚体的每个孔。

第二种模式称为“慢”或“公共”门控，发生速度要慢几个数量级，涉及同时关闭两个孔的亚基间合作。当公共门打开时，原孔会独立打开和关闭。在单通道记录中，这可以可视化为具有三个不同且等距的电导水平的活动爆发，对应于关闭的通道、一个孔打开或两个孔都打开，当慢门关闭时，中间穿插着较长的静默期（图 13.3）。

CLC-0 是电压门控的。原孔门通过去极化打开，而公共门通过超极化打开。这两个过程都具有相对较浅的电压依赖性，门控电荷约为 1。由于两个过程的时间尺度差异很大，因此可以将 CLC-0 原孔门控与普通门控分开研究。在 Thomas Jentsch 克隆 CLC-0 后，Pusch 等人在异源表达系统中研究了 CLC-0 门控。通过研究电压依赖性如何受到 Cl– 和其他阴离子浓度变化的影响，他们得出了一个惊人的结论：CLC-0 门控电荷可能不是来自蛋白质本身，而是来自渗透离子 (Cl–) 通过蛋白质的运动 (Jentsch 和 Pusch，2018)。因此，CLC-0 中的电压依赖性门控与电压门控阳离子通道的门控有着根本的不同。在哺乳动物 CLC 通道同源物中，CLC-1 和 CLC-2 与 CLC-0 具有许多共同的特征，包括由渗透离子（Cl– 或 H+，稍后讨论）的移动引起的电压依赖性。相反，CLC-K 具有独特的门控特性，缺乏电压依赖性。接下来，我们比较和对比 CLC-0、CLC-1 和 CLC-2 的门控特性，然后描述 CLC-K 同源物的独特门控。CLC-0、CLC-1 和 CLC-2 原孔门控的核心参与者是 Gluex（图 13.2A）。去质子化后，该残基占据 Cl– 结合位点，从而阻断离子渗透途径。通过质子化中和 Gluex 会降低其对带正电孔的亲和力，从而为 Cl– 的进入让路。将 Gluex 突变为中性残基会产生缺乏电压依赖性的组成性开放通道。在低细胞外 pH 条件下，Gluex 质子化会产生类似的门控表型。这些结果表明，Gluex 侧链运动可能完全负责原孔门控。然而，使用小分子抑制剂探针的研究表明，原孔门控可能涉及额外的蛋白质构象变化（Accardi 和 Pusch，2003 年）。虽然细节尚未完全阐明，但这一提议与 CLC 转运蛋白外门打开期间整体构象变化的观察结果一致（参见第 13.4.2 节）。原孔门控的电压依赖性受 H+ 调节（Miller，2006 年）。在发现某些 CLC 充当 Cl–/H+ 交换器后，H+ 调节通道门控的机制引起了更深入的研究。对文献的深刻评估和巧妙的实验产生了令人信服的提议，即 H+（从细胞内侧移动到 Gluex 位点）可能是 CLC-0 中的门控电荷（Miller，2006 年；Traverso 等人，2006 年）。在这种情况下，细胞外 Cl– 会诱导构象变化，使细胞内质子能够进入 Gluex，就像它在转运体中所做的那样（参见图 13.2 和以下讨论）。跨膜 H+ 梯度驱动 CLC-0 门控不对称（表明 H+ 运输发生在每个门控周期）的发现为 CLC-0 门控的“降解转运蛋白”模型提供了强有力的支持（Lisal 和 Maduke，2008 年）。与原孔门控相比，公共门控涉及相隔数十埃的孔的协调打开和关闭。CLC 公共门控的分子细节尚不清楚，但据推测涉及大规模构象变化。与此想法一致，分散在整个蛋白质中的突变会影响公共门控。许多这些突变聚集在二聚体界面。这一观察结果与 Cd2+ 介导抑制的生物物理研究（Yu 等人，2015 年）强烈表明在公共门控期间亚基界面发生了构象重排。荧光共振能量转移研究重点关注共同门控过程中 C 端区域的运动，这为大构象变化提供了进一步的证据。

初步估计，CLC-1 和 CLC-2 门控过程与 CLC 0 的门控过程平行，表现出受 H+ 和 Cl– 强烈调节的电压依赖性以及 ~1 的门控电荷。然而，这些过程也有显著的差异。在 CLC-1，公共门控比 CLC-0 中的要快得多，因此公共门控和原孔门控不能在动力学上分离。此外，CLC-1 的公共门控由去极化激活，而不是像 CLC-0 中的超极化激活。在 CLC-2 中，公共门控和原孔门控也不能在动力学上分离，但两者都比 CLC-1 中的等效过程慢得多，并且两者都由超极化激活（Zuniga 等人，2004 年）。净效应是 CLC-1 和 CLC-2 的电生理电流轨迹看起来非常不同（图 13.3）。这些差异至少部分源于通道与离子（Cl– 和 H+）之间相互作用的差异以及这些离子如何调节电压依赖性（Traverso 等，2006；De Jesus-Perez 等，2016）。与 CLC-1 和 CLC-2 不同，CLC-K 通道基本上没有电压依赖性，这一特性可以通过缬氨酸代替 Gluex 来解释。质子对 CLC-K 通道的门控是通过细胞外 His 和 Lys 残基的质子化/去质子化发生的，与 CLC-1 和 CLC-2 中 Gluex 介导的 pH 门控形成对比。在 CLC 中，CLC-K 通道独特地依赖于细胞外 Ca2+（Jentsch 和 Pusch，2018）。这些通道包含由跨二聚体界面相互作用的酸性残基组形成的细胞外 Ca2+ 结合位点。这些位点的模块化通过赋予 CLC-0 Ca2+ 敏感性来证明。

图 13.3

CLC 通道和转运蛋白的电生理学概述。CLC-0 数据是在 Maduke 实验室获得的，使用 Xenopus 卵母细胞的由内而外膜片钳记录。所有其他轨迹均由 Michael Pusch 提供。CLC-2、CLC-4 和 CLC-Ka 轨迹是使用 Xenopus 卵母细胞的双电极电压钳记录的。

CLC-1、CLC-5 和 CLC-7 轨迹来自 HEK293 细胞的全细胞膜片钳记录。在单通道轨迹中，顶部和中间轨迹下方的红色条表示的区域被扩展并分别显示在中间和底部轨迹中。

CLC 氯离子通道和转运蛋白 201

== 13.4.2 CLC 转运蛋白 ==
与通道不同，通道中的门控会导致孔径开放，而次级活性转运蛋白的门控必须避免这种开放，因为这种开放会抵消偶联。虽然众所周知，转运蛋白门控必须涉及某种交替进入膜两侧的方式，但要了解 CLC 中这种情况的发生，需要一个新颖的框架。所有其他已知转运蛋白都交换带同种电荷的底物，这些底物共享途径。相比之下，CLC 转运蛋白使用不同的途径将阴离子交换为阳离子。

大多数 CLC（包括原核生物、哺乳动物和植物同源物）的阴离子/质子交换的化学计量为 2:1。图 13.4 显示了用于理解 2:1 CLC 交换机制的工作模型。该模型基于大量功能数据以及高分辨率结构，揭示了 Gluex 侧链的四个不同位置：“中间”、“上”、“下”和“外”。CLC-ec1 转运蛋白突变体中观察到的上和外构象也分别在 CLC-1 和 CLC-7 的野生型结构中观察到，这证实了这些是通用 CLC 构象的想法。将 Gluex 突变为中性残基会消除所有 CLC 转运蛋白中的 H+ 转运，说明 Gluex 在转运循环中的核心作用。作为图 13.4 中所示模型类型的替代方案，多尺度动力学建模表明，多种构象途径（每种途径具有不同的化学计量）可以结合起来产生功能测量的 2:1 交换（Mayes 等人，2018 年）。 CLC 转运蛋白的电生理记录显示出不同的特性。

哺乳动物 CLC（图 13.3 中显示的代表性轨迹）显示出强烈的外向整流。相比之下，CLC-ec1 仅显示出轻微的整流。CLC-7 的缓慢门控动力学允许尾电流分析，这表明整流是一种门控现象；也就是说，CLC-7 是一种门控转运蛋白。诱变结果间接表明，这种现象

可能类似于 CLC 通道同源物中发生的常见门控（Ludwig 等人，2013 年）。CLC-3 到 CLC-6 的整流可能反映了门控过程、电压依赖性 H+ 阻断或这些因素的某种组合（Picollo 等人，2010 年；De Stefano 等人，2013 年）。

== 13.5 离子通透性 ==
CLC 对阳离子（H+ 除外）不具有通透性，这一点在门控部分进行了讨论。在卤化物中，CLC 表现出 Cl– > Br– > I– 选择性（Jentsch 和 Pusch，2018 年）。这种选择性与其他阴离子通道家族相反，包括 Ca2+ 激活的 Cl– 通道（第 14 章）；囊性纤维化跨膜传导调节器 (CFTR；第 III 卷，第 10 章）；以及体积调节的阴离子通道，它们表现出 I– >Br– > Cl– 选择性。CLC 通道对 Cl– 的选择性高于 t较大的 Br– 可能反映出这些通道具有较窄的渗透途径，这一观点与 CLC 通道相对较低的单通道电导率（CLC-1 约为 1 pS，CLC K 约为 20 pS）和结构中可见的较窄孔径相一致。尽管如此，对 CLC 渗透性（CLC-1）的最彻底研究表明，较大的有机阳离子苯甲酸盐具有相当大的渗透性（相对于 Cl– 为 0.15）（Rychkov 等人，1998 年）。这一结果表明，在 CLC 通道结构中，可能存在伴随通道开放的构象变化，而这些变化尚未观察到。CLC 转运蛋白通常表现出与通道相同的阴离子选择性。如第 13.2 节所述，某些植物同源物通过选择性过滤器细胞内侧的突变进化为 NO3–/H+ 反向转运蛋白。另一种选择性

202 离子通道教科书第二卷

图 13.4

Gluex 构象和 CLC Cl–

/H+ 交换循环。 (A) 不同晶体结构中看到的四种 Gluex 构象的图示，每个结构描述下方都有卡通表示（蛋白质数据库：

1OTS、1OTU、3ORG 和 6V2J）。 E148Q 和“QQQ”CLC-ec1 突变体模拟转运蛋白的不同质子化状态（Dutzler 等人，2003 年；Chavan 等人，2020 年）。 cmCLC 是一种来自红藻的转运蛋白（Feng 等人，

2010 年）。 QQQ 结构（Gluex“out”）表现出打开细胞外阴离子渗透途径的骨架变化，而所有其他 Gluex 变体的骨架结构都与 WT CLC-ec1 相似。 (B) CLC 运输循环的工作模型，显示了通过四种 Gluex 构象的转变如何与 Cl–/H+ 运动协调，实现 2:1 Cl–/H+ 反向转运。该机制在两个方向上产生 2:1 反向转运；为清晰起见，仅描绘了一个方向。在“向下”和“中间”状态的描绘中，内门上的虚线表示内门打开机制的不确定性，这可能涉及尚未见过的构象变化（Basilio 等人，2014 年；Accardi，2015 年）或静态动力学屏障（Feng 等人，2010 年）。水到 Gluex 的通路（在“出”图中显示为浅蓝色分子）在结构中看不到，但已由几个小组在分子动力学模拟中观察到。 CLC-ec1 的“Gluin”残基强烈影响 CLC-ec1 中水通路的形成，但在 CLC 转运蛋白中并非普遍需要，因此未在此处描述。

CLC 氯离子通道和转运蛋白 203

变体见于远亲原核 CLC 亚类，这些亚类在选择性过滤器的细胞内区域缺乏保守性。这些 CLC 与其他 CLC 转运蛋白具有相同的结构，但充当 F–/H+ 反向转运蛋白，具有 1:1 化学计量 (Last 等人，2018)。

== 13.6 药理学 ==
许多经典的阴离子通道抑制剂以非选择性而闻名，但在高微摩尔浓度下对 CLC 有效。这些抑制剂可分为两大类：二苯乙烯二磺酸盐衍生物和各种有机羧酸盐（图 13.5）。这些化合物在带负电荷的形式下具有活性，在生理 pH 下占主导地位。

图 13.5

CLC 药理学。文中讨论的抑制剂的结构。所有化合物均以其活性（带负电荷）形式显示，在生理 pH 下占主导地位。

二苯乙烯二磺酸盐，例如 DIDS（4,4-二异硫氰酸二苯乙烯-2,2-二磺酸盐），几十年来一直被用作阴离子电流的通用阻滞剂，并且对 CLC-0、

CLC-Ka、CLC-7 和 CLC-ec1 有效。DIDS 支架的不稳定性使其难以进行进一步的构效关系研究；然而，它被用作开发 OADS 的基础，OADS 是一种抑制 CLC-ec1 转运体的稳定分子。

有机羧酸盐对 CLC-0、

CLC-1 和 CLC-Ka 通道的影响研究最为广泛。9-蒽甲酸 (9-AC) 和氯贝特酸衍生物（如 CPA 和 CPP）从细胞内抑制 CLC-1。CLC-0 也被氯贝特酸衍生物抑制，巧妙的机制研究表明，

这些化合物是状态依赖性的。也就是说，它们对通道的关闭和打开状态具有不同的表观亲和力（Accardi 和 Pusch，2003），使它们

可用于 CLC-0 门控的生物物理研究。虽然 CPA 和 CPP 对 CLC-K 通道没有效果，但对 CPP 支架的修改导致了两种 CLC-Ka 抑制剂的开发：3-苯基-CPP 和苯并呋喃杂环化合物 MT-189。与 3-苯基-CPP 相比，MT-189 对 CLC-Ka 的效力有所提高（IC50 = 7 μM），尽管这些同源物之间的序列同一性为 90%，但对 CLC-Ka 的选择性比对 CLC-Kb 的选择性高出三倍（Liantonio 等人，2008 年；Gradogna 和 Pusch，2010 年）。与细胞内 m苯并呋喃羧酸盐通过氯贝特酸衍生物介导抑制 CLC-0 和 CLC-1，从细胞外侧抑制 CLC-K 通道。以 MT-189 的分子几何形状为模型，开发了一类新型苯并咪唑磺酸盐 (BIM)。BIM 保留了 MT-189 的低微摩尔效力 (IC50 = 9 μM)，但 CLC-Ka 的选择性比 CLC-Kb 的选择性高出 20 倍以上 (Koster 等人，2018)。

另一类作用于 CLC 通道的有机羧酸盐属于非甾体抗炎药家族，称为芬那酸酯。未经精心设计的芬那酸酯骨架二苯胺-2-羧酸盐 (DPC) 长期以来一直被用作阴离子电流的通用阻滞剂。对于 CLC-K 通道，芬那酸酯被认为与苯并呋喃、BIMS 和氯贝特类药物在相同的细胞外前庭结合。该类药物中的另一种非特异性阻滞剂是尼氟灭酸 (NFA)。NFA 抑制中微摩尔范围内的 CLC-1 电流，并且对至少 120 μM 以下的 CLC-2 没有影响。有趣的是，NFA 在浓度低于 1 mM 时增强而不是抑制 CLC-Ka 电流，并且通过与抑制结合位点不同的未知机制起作用 (Gradogna and Pusch, 2010)。目前尚不清楚其他直接的小分子 CLC 激活剂。从一种名为甲氯芬那酸酯 (MCFA) 的芬那酸酯命中化合物开始，最近开发了 CLC 家族的第一个低纳摩尔效力小分子抑制剂。这种化合物 AK-42 对 CLC-2 的 IC50 为 17 nM，与下一个最接近的同源物 (CLC-1) 相比，其对 CLC-2 的效力约高出 10,000 倍，并且已针对 CA1 海马神经元中的内源性 CLC-2 电流进行了验证 (Koster 等人，2020 年)。

与电压门控阳离子通道不同，各种原核生物和有毒动物为其提供了丰富的特定毒素抑制剂和激活剂来源，而生物衍生的 CLC 功能调节剂仍然普遍缺乏。唯一的例外是从蝎子毒液中鉴定出的肽 GaTx2，它以约 20 pM 的效力抑制 CLC-2 (Thompson 等人，2009 年)。然而，GaTx2 的抑制在约 50% 时达到饱和。

许多 CLC 对低至中微摩尔范围内的 Zn2+ 或 Cd2+ 敏感。Zn2+ 和

Cd2+ 通过变构关闭 CLC 通道中的慢门起作用（-0、-1、-2、-Ka/Kb）。

CLC-4 转运蛋白也受到 Zn2+ 的抑制，可能是通过通道中未保守的细胞外组氨酸残基

抑制的。目前缺乏针对哺乳动物

CLC 转运蛋白的小分子调节剂。CLC-7 是最具药理学特征的哺乳动物转运蛋白，在测试的 16 种经典（非选择性）Cl-通道抑制剂中，有 4 种可以抑制 CLC-7（Schulz 等人，2010 年）。

CLC 氯离子通道和转运蛋白 205

== 13.7 调节 ==
CLC 受到磷酸化、棕榈酰化、核苷酸 (ATP) 与 CBS 结构域结合以及辅助亚基的不同调节。此外，CLC-1 受细胞氧化还原环境和 NAD+ 调节。尚未证明 CLC 具有脂质调节作用，但对与 CLC-7 结合的磷脂酰肌醇 3-磷酸 (PI3P) 的结构观察 (Schrecker 等人，2020) 表明可能存在这种调节。

已知 CLC-2、CLC-K 和 CLC-7 具有辅助亚基。CLC-2 在许多没有辅助亚基的细胞类型中表达，但与神经胶质细胞中称为 GlialCAM 的粘附分子相关，如第 13.2 节所述。相反，CLC-K 辅助亚基 barttin 总是与 CLC-K 通道亚基共表达。Barttin 是一种跨膜蛋白，对 CLC-K 运输至关重要，对通道的功能特性影响相对较小。CLC-7 辅助亚基 Ostm1 不是 CLC-7 定位所必需的，但其重度糖基化似乎可以保护 CLC-7 免受溶酶体蛋白酶的侵害。

== 13.8 细胞生物学 ==
亚细胞分选对大多数（如果不是全部）CLC 都至关重要。在上皮细胞中，CLC-2 通过第一个 CBS 域中的二亮氨酸基序与网格蛋白接头 AP-1 之间的相互作用被分选到基底侧膜。在肾元和内耳中，barttin 对将 CLC-K 通道运输到适当的膜至关重要。在骨骼肌中，CLC-1 在 t 小管或肌膜内的定位存在争议，但鉴于这些区域的独特结构，其定位可能很重要。对于细胞内 CLC，已鉴定出与衔接蛋白相互作用并直接亚细胞定位的各种分选基序（Stauber 和 Jentsch，2010 年）。反过来，细胞内 CLC 转运蛋白会影响囊泡运输和功能（Stauber 和 Jentsch，2013 年）。

== 13.9 通道病和疾病 ==
CLC 中的功能丧失和显性负突变是导致多种人类疾病的原因，包括先天性肌强直 (CLC-1)、Bartter 综合征 (CLC-Kb)、神经和内分泌疾病（CLC-2、CLC-3、CLC-4、CLC-6、CLC-7）和齿状病毒病（CLC-5）。这些在第三卷第 11 章中有详细介绍。

== 13.10 结论 ==
CLC 是一个迷人的双管阴离子通道和转运蛋白家族。对 CLC 蛋白的研究揭示了新的门控机制，并阐明了单一结构支架的变体如何发挥热力学上不同的功能。此外，CLC 对生理学至关重要——从赋予食源性致病微生物极端的耐酸性到驱动高等生物的复杂生理途径。揭示这些功能细节的机制研究将继续进行，为可预见的未来提供关键的生命见解。