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== CRISPR Cas in 细菌 ==

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇规律间隔短回文重复序列）系统是一种来源于细菌和古菌的获得性免疫机制，能够识别并切割外来的遗传物质，如噬菌体DNA。该系统由两部分主要组成：CRISPR序列和与之相关联的Cas（CRISPR-associated）蛋白。

=== CRISPR序列 ===
CRISPR序列是一段DNA序列，包含短的直接重复序列和其间隔插入的间隔序列。重复序列通常是回文序列，能够形成发夹结构，有助于转录后crRNA的稳定性。间隔序列则源自曾感染该细菌的外源DNA（如病毒DNA），充当免疫记忆的信息库，用于后续识别同一类入侵者。

=== Cas蛋白 ===
Cas蛋白通常位于CRISPR序列上游，种类繁多，具有多种功能，包括核酸的识别、剪切和解链等。核心Cas蛋白包括：
* Cas1 与 Cas2：具有内切酶活性，Cas1还具核酸结合功能，在新间隔序列的整合中发挥关键作用。
* Cas3：具有DNA解链酶与核酸酶双重功能，是I类系统中的降解主力。
* Cas4 与 Cas6：也表现出内切酶活性，参与pre-crRNA的加工过程。
* Cas9：II类系统中的多功能蛋白，兼具DNA识别与切割功能，是目前基因编辑领域的核心工具。

=== CRISPR免疫过程 ===

CRISPR-Cas系统的免疫反应通常可分为三个阶段：获取（adaptation）、表达与加工（expression & processing）、干扰（interference）。

==== （1）间隔序列的获取 ====
* 外源DNA中含有特定的PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）作为识别标志。Cas1和Cas2蛋白被招募，剪切目标DNA，并识别CRISPR阵列前导序列（leader sequence），将新间隔序列插入第一个重复序列与原首个间隔之间。
* 缺口由DNA聚合酶催化合成短重复序列，完成修复和整合。

==== （2）CRISPR RNA (crRNA) 的表达与加工 ====
* 整个CRISPR阵列被转录为一条长的pre-crRNA（前体CRISPR RNA）。
* 加工方式因系统类型不同而异：
: I类与III类系统：Cas6或其他内切酶（如Cas3）识别重复序列并剪切，生成多个成熟的crRNA，每条含一个间隔序列及部分重复序列。
: II类系统：缺乏Cas6，依赖tracrRNA（转录激活的crRNA）与重复序列互补配对。形成双链结构后由RNA酶III加工成成熟的crRNA，通常丢失约10个核苷酸。

==== （3）外源核酸的识别与降解 ====
* 成熟的crRNA与Cas蛋白结合，形成crRNP复合物，能够识别并结合与其间隔序列互补的外源DNA。
* I类与III类系统：需要多个Cas蛋白组成复合体，由Cas3完成切割和降解。
* II类系统：仅需Cas9蛋白与crRNA、tracrRNA共同作用，即可识别PAM旁的靶DNA并进行双链断裂。

== CRISPR-Cas9技术：Type II系统 ==

CRISPR-Cas9是一种源于细菌的Type II类CRISPR系统，具有可编程的DNA编辑能力。其核心机制依赖于Cas9蛋白与sgRNA形成的复合体识别靶DNA，并进行双链断裂。该技术因其简洁、高效、特异性强，被广泛应用于基因编辑、功能基因筛选和治疗研究中。

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==== （1）Cas9蛋白结构与功能 ====
Cas9蛋白是一种多结构域的RNA引导核酸酶，具备识别、结合和剪切DNA的多重能力。主要结构包括：

* REC lobe（RNA识别域）：识别并稳定sgRNA的空间构象，确保其功能性结构完整。
* HNH结构域：负责切割与crRNA序列互补的DNA链（靶链）。
* RuvC结构域：切割非互补链，与HNH协同完成DNA双链的断裂。
* PAM识别结构域：专门识别目标DNA邻近的PAM序列（如5'-NGG-3'），是Cas9结合靶DNA的前提。

==== （2）sgRNA的结构与功能 ====
sgRNA（single-guide RNA）是crRNA与tracrRNA人工融合形成的单链引导RNA，简化了天然系统的双RNA结构。其功能包括：

* crRNA部分含有约20个碱基的引导序列，与靶DNA序列互补配对，决定编辑的靶点。
* tracrRNA部分与Cas9结合，保持sgRNA的稳定性和功能活性。

==== （3）机制：从识别到切割 ====
1）PAM识别：Cas9首先识别目标DNA上5'-NGG-3'的PAM序列。缺乏PAM的DNA不会被Cas9识别，防止系统自我切割。
2）DNA靶向配对：识别PAM后，Cas9解旋靶DNA，使sgRNA的引导序列与其互补配对。
3）DNA双链断裂：Cas9在识别完成后激活两种内切酶活性。RuvC结构域切割非互补链，HNH结构域切割互补链，最终在目标位点形成钝端双链断裂（DSB）。

==== （4）DNA断裂后的修复机制 ====
靶DNA被Cas9剪切后，细胞通过自身的DNA修复机制处理断裂，常见方式包括：

* 非同源末端连接（NHEJ）：
: 是一种快速但低保真的修复机制，常引入碱基缺失或插入（indels），可导致移码突变或基因功能丧失。适用于基因敲除或非精确修复。
* 同源重组修复（HDR）：
: 需提供一段外源同源模板（donor DNA），可用于高精度地插入、替换或修复基因。效率相对较低，但精确性更高，常用于治疗性基因编辑和疾病模型构建。

== Cas9 酶的变体 ==
=== dCas9（dead Cas9，失活型Cas9） ===

dCas9 是一种经突变获得的 Cas9 蛋白变体，通过同时失活其两个核酸内切酶活性位点（HNH 和 RuvC）而获得“失活”特性，无法切割DNA，但仍能高效结合目标DNA序列。

常见突变：
* D10A（RuvC结构域失活）
* H840A（HNH结构域失活）

dCas9 可用于以下几种功能：

* CRISPRi（基因表达抑制）：dCas9 静态结合于启动子区域或转录起始点，阻断RNA聚合酶结合，从而抑制目标基因转录。
* CRISPRa（基因激活）：将 dCas9 融合转录激活因子（如VP64、p65）引导至启动子上游，激活转录表达。
* 染色体定位与成像：dCas9 可融合荧光蛋白（如GFP）实现对特定染色位点的可视化追踪。
* 表观遗传修饰：可融合组蛋白乙酰转移酶、DNA甲基化酶等，实现DNA修饰或染色质状态调控。

由于不引发DNA断裂，dCas9 被认为具有高度安全性，适合在活细胞或复杂组织中进行非破坏性调控。

=== Cas9n（Cas9 nickase，单链切口酶） ===

Cas9n 是指通过突变使 Cas9 仅保留一个内切酶活性的变体，只能在 DNA 的一条链上造成单链切口（nick），而非双链断裂。根据保留的结构域不同，可分为：

* D10A 突变：RuvC结构域失活，HNH结构域保留，切割互补链（target strand）
* H840A 突变：HNH结构域失活，RuvC结构域保留，切割非互补链（non-target strand）

Cas9n 的应用包括：

* 碱基编辑（Base Editing）：Cas9n 融合脱氨酶（如APOBEC、TadA），在不造成DSB的前提下，实现碱基间的C→T或A→G转换。
* 先导编辑（Prime Editing）：Cas9n 融合逆转录酶（RT），与pegRNA配合，实现在基因组中特定位点的插入、缺失或精确突变。
* 降低脱靶效应：相较于野生型Cas9的双链断裂，Cas9n引发的单链切口对基因组稳定性影响更小，更安全。

Cas9n 保留一定的编辑活性，同时具备更高的编辑精度和较低的毒性，是精准基因治疗的重要工具。

== CRISPR Cas9 及其变体可以完成的技术 ==
{| class="wikitable"
! 技术 !! 名称 !! 机制
|-
| 基因敲除 || Gene Knockout || 引发双链断裂（DSB），通过非同源末端连接（NHEJ）修复，常导致基因功能丧失。
|-
| 基因敲入 || Gene Knock-in || 引发DSB，并提供含有同源臂的供体模板，依赖同源重组修复（HDR）实现特定序列的插入或替换。
|-
| 表观调控 || CRISPRi / CRISPRa via dCas9 || 使用失活的Cas9（dCas9），无核酸酶活性，仅结合靶DNA，通过阻断转录或招募转录激活因子实现基因表达调控。
|-
| 碱基编辑 || Base Editing, BE || dCas9或Cas9n与脱氨酶融合，无需造成双链断裂，可实现单个碱基的精准转换（如C→T或A→G）。
|-
| 先导编辑 || Prime Editing, PE || 基于Cas9n、逆转录酶（RT）和pegRNA三元系统，可实现插入、删除和多种碱基替换，无需双链断裂或供体模板。
|}

=== <ref>除PE部分外，其余部分由Kotodama编辑</ref>先导编辑 Prime Editing ===

先导编辑（Prime Editing）是一种无需产生DNA双链断裂（DSB）的高级定点基因编辑技术。其核心组件包括：

* Cas9 nickase（Cas9n）：只能对DNA的一条链产生单链切口（nick）
* 逆转录酶（RT）：与Cas9n融合，用于将RNA模板的信息转录进DNA
* pegRNA（prime editing guide RNA）

pegRNA 具备双重功能，其结构包括：

1. 一段与目标DNA序列互补的“引导序列”，用于将编辑系统准确定位；

2. 一段携带预期突变的“模板序列”，与目标DNA序列高度相似，但包含特定碱基替换、插入或缺失。

当编辑系统定位到目标DNA序列后，Cas9n在目标位点产生一个单链断裂。此切口处的DNA末端可被融合的逆转录酶识别，并作为引物启动逆转录，以pegRNA中的“模板序列”作为模板，合成一段含有突变的新DNA链。  

此过程并非绝对发生：在某些情形中，RT可能在未完成合成前即从DNA解离，导致编辑失败。

形成的新DNA链与原有的DNA互补链存在差异，二者会以一种被称为翼式结构（flap structure）的方式共存。细胞的DNA修复机制随后处理这一翼式结构：

* 如果原有互补链被移除，则突变链被保留，目标位点成功被编辑为pegRNA上设计的序列；
* 如果突变链被移除，则目标位点保持原样（即野生型）；
* 有时会形成碱基错配，在随后的修复过程中可能偏向保留突变型，也可能回归野生型。

这一过程表现出高度的可编程性，但也带来了不确定性。

优点：
* 不依赖双链断裂，减少脱靶效应及大范围结构性突变风险；
* 可实现多种类型的碱基替换、插入与缺失，编辑形式灵活。

缺点：
* 编辑效率受限，成功率受多因素影响，存在大量“可能失败”的步骤；
* 翼式结构及错配修复路径的不确定性使得结果较难预测。

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== CRISPR Cas13 技术——靶向RNA的CRISPR Cas ==

CRISPR-Cas13 是一种以 RNA 为靶标的 CRISPR 系统，属于 CRISPR Class 2 Type VI 类别。该系统不同于 Cas9 等针对 DNA 的编辑工具，其功能在于特异性识别并切割单链 RNA，具有 RNA 靶向干扰、RNA 可视化、分子诊断和 RNA 编辑等多种生物技术应用前景。

=== 基本原理 ===

Cas13 系统的核心为 Cas13 蛋白和引导 RNA（crRNA）。Cas13 可与 crRNA 形成复合物，识别具有互补序列的目标 RNA。在结合目标 RNA 后，Cas13 被激活，展现出两种活性：

* 特异性切割：精准切割目标 RNA 分子
* 非特异性胶合切割（collateral cleavage）：激活状态下，Cas13 还会切割周围无关 RNA，形成“胶合剪切”效应，可用于信号放大等用途

与 DNA 靶向系统如 Cas9 不同，Cas13 不依赖 PAM序列，使其靶标选择更灵活。

=== Cas13 亚型 ===

Cas13 蛋白家族包括多个亚型，各自具有不同来源和特性：

* Cas13a（原名 C2c2）：最早发现，具有典型的胶合切割特性
* Cas13b：靶向准确性更高，活性较强
* Cas13c：研究较少，靶向宽容度较大
* Cas13d：分子量较小，适合病毒载体包装，常用于体内应用
* Cas13X/Y：新近发现，体积更小，适用于合成生物系统

=== 工作机制 ===

# crRNA 被设计为包含目标 RNA 的互补序列
# crRNA 与 Cas13 蛋白结合，形成识别复合物
# 复合物与目标 RNA 配对后，Cas13 被激活
# 激活的 Cas13 对目标 RNA 进行精确切割，并同时触发胶合切割，对周围 RNA 造成降解

=== 应用场景 ===

==== RNA 靶向干扰 ====

Cas13 可被用作精准 RNA 降解工具，用于研究基因功能或抑制特定 mRNA、lncRNA 等。相比传统 RNAi 技术，Cas13 更具特异性，且不依赖宿主细胞的 RNA 干扰通路。

==== RNA 可视化 ====

通过与荧光标签蛋白（如 GFP）融合，可实现对特定 RNA 分子的活细胞成像，用于观察 RNA 定位和时空表达。

==== 分子诊断（SHERLOCK） ====

Cas13 的胶合切割特性被应用于 SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）系统。在靶标 RNA 存在时，Cas13 被激活，切割人工设计的荧光探针，从而实现疾病 RNA 检测，如 SARS-CoV-2、寨卡病毒等。该系统灵敏度高、速度快、可用于便携诊断。

==== RNA 编辑（REPAIR 系统） ====

通过去活化 Cas13 切割能力并与腺苷脱氨酶（ADAR）融合，可实现 A→I 的可逆 RNA 编辑。该方法不涉及基因组永久变更，适用于需要暂时性基因调控的治疗策略。


<references />