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Sanger测序即双脱氧链终止法、一代测序技术。 在HGP中被广泛使用。 == 基本原理 == Sanger测序基于DNA复制的原理,通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。 测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、引物和DNA聚合酶。 * ddNTP由于缺少3'-OH基团,无法与下一个dNTP形成磷酸二酯键,导致DNA链在此位置终止,ddNTP成为该肽段的末端。 * 向体系中加入不同类型的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP),使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止,形成一系列不同长度的DNA片段。 == 反应过程 == === 构建反应系统 === 每个反应体系包含四种dNTP,用于正常DNA合成。 每个反应体系加入一种特定的ddNTP,使其在特定碱基处终止DNA链。 为了方便定位,ddNTP通常会被荧光或同位素标记。 反应体系还包括目标DNA片段、DNA聚合酶和引物。 === 扩增目的片段 === 以目标DNA片段为模板,在DNA聚合酶的催化下,从引物处开始复制DNA。 当遇到ddNTP时,反应停止,产生一系列具有共同起始点但不同终止点的DNA片段。 通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度,可以控制链终止的位置和频率。 === 电泳 === 通过电泳将不同长度的DNA片段分开。 一般有四个泳道,每个泳道对应一种碱基(A、G、C、T)。 电泳结束后,通过放射自显影或紫外显影读取凝胶影像,确定每个片段的终止位置。 从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列,从而推知待测模板链的序列。 == 应用实例 == === 乙型肝炎病毒耐药基因突变检测 === 一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒(HBV)DNA拷贝数大于1k的患者血清进行测序。 结果显示,40例(18.6%)患者检测到耐药基因突变,其中21例(9.77%)具有对应参考价值。<nowiki><cite>2</cite></nowiki> 研究还发现,LAM药物(拉米夫定)的耐药发生率较高,为9.77%。 === 肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测 === 一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的CDA基因突变情况。 检测成功率高达98.04%,敏感度和特异度分别为92.50%和99.52%。 === 胶质瘤IDH突变检测 === 一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。 结果显示,237例(35.9%)样本检测到IDH1基因突变,9例(1.4%)样本检测到IDH2基因突变。 IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸,最常见的突变类型是IDH1R132H,占总突变的94%。 === 感音神经性聋患者常见聋病基因检测 === 一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。 研究选择了GJB2基因的第二个外显子、SLC26A4基因的p8和p18两个外显子、mtDNA的两个常见突变位点进行测序。 == 优势和局限性 == === 优势 === 高准确性: Sanger测序法的准确率非常高,通常在99.99%左右。 长读长: 可以产生超过500个核苷酸的读长,适用于较长的DNA片段测序。 广泛使用: 由于其可靠性和准确性,Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。 === 局限性 === 成本较高: 对于大规模、自动化基因组分析,Sanger测序的成本较高。 通量较低: 相比于下一代测序技术(如Illumina),Sanger测序的通量较低,不适合处理大量样本。 灵敏度限制: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上,这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。 == 与其他技术的比较 == === 焦磷酸测序法 === 焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术,与Sanger测序法相比,焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。 例如,一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用,结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。 === ADx-ARMS法 === ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术,具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。 一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用,结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法(51.0% vs 25.3%)。 === 蓝白斑筛选联合Sanger测序技术 === 通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度,达到千分之一的水平。 该技术操作简便,成本低廉,适合在基层医院推广,可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测,提供预后信息。
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