生物技术：修订间差异

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2025年10月8日 (三) 16:05的版本

DNA/RNA

Blot

众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸比较脆；后者靠共价键结合核酸比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）

PCR（及其衍生操作）

T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性高浓度下表现聚合酶活性应用于3'末端标记同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
- 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记现在多用于测序

引物设计原则（老生常谈系列）
- 长度18－30
- 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
- 碱基最好随机分布同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
- Tm在55－80
- 3'端最好以G/C结尾两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
- 5'端可以灵活修饰影响没有那么大
- 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键进而打开二级结构提高产量
RT－PCR的ct法要看本底基因本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照用于排除RNA提取效率反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差

一些奇怪的PCR

巢式PCR

两对引物第一轮扩增后要对产物进行稀释避免外引物产生干扰可以极大提高反应的特异性

5'/3'RACE

适用于RNA一端已知一端未知

先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴然后利用已知片段和尾巴进行PCR

用两对引物增强特异性

提取

测序

sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
一代末端终止二代边合成边测序三代单分子合成测序
- 准确率上1＞2＞3
- 读长3＞1＞2
- 效率3＞2＞1
- 现在最常用的是二代
某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA

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-如题
+=== DNA/RNA ===
+==== Blot ====
+* 众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
+* 核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
+* 硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸 比较脆；后者靠共价键结合核酸 比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）
+==== PCR（及其衍生操作） ====
+* T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性 高浓度下表现聚合酶活性 应用于3'末端标记 同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
+** 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记 现在多用于测序
+* 引物设计原则（老生常谈系列）
+** 长度18－30
+** 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
+** 碱基最好随机分布 同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
+** Tm在55－80
+** 3'端最好以G/C结尾 两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
+** 5'端可以灵活修饰 影响没有那么大
+** 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
+* 甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键 进而打开二级结构 提高产量
+* RT－PCR的ct法要看本底基因 本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照 用于排除RNA提取效率 反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差
+===== 一些奇怪的PCR =====
+====== 巢式PCR ======
+两对引物 第一轮扩增后要对产物进行稀释 避免外引物产生干扰 可以极大提高反应的特异性
+====== 5'/3'RACE ======
+适用于RNA一端已知一端未知
+先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴 然后利用已知片段和尾巴进行PCR
+用两对引物增强特异性
+==== 提取 ====
+==== 测序 ====
+* sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳 琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
+* 一代末端终止 二代边合成边测序 三代单分子合成测序
+** 准确率上1＞2＞3
+** 读长3＞1＞2
+** 效率3＞2＞1
+** 现在最常用的是二代
+* 某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA