生物技术：修订间差异

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2025年10月8日 (三) 21:20的版本

DNA/RNA

一些电泳相关

众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸比较脆；后者靠共价键结合核酸比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）

PCR（及其衍生操作）

T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性高浓度下表现聚合酶活性应用于3'末端标记同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
- 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记现在多用于测序

引物设计原则（老生常谈系列）
- 长度18－30
- 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
- 碱基最好随机分布同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
- Tm在55－80
- 3'端最好以G/C结尾两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
- 5'端可以灵活修饰影响没有那么大
- 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键进而打开二级结构提高产量
RT－PCR的ct法要看本底基因本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照用于排除RNA提取效率反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差

一些奇怪的PCR

巢式PCR

两对引物第一轮扩增后要对产物进行稀释避免外引物产生干扰可以极大提高反应的特异性

5'/3'RACE

适用于RNA一端已知一端未知

先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴然后利用已知片段和尾巴进行PCR

用两对引物增强特异性

提取

测序

sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
一代末端终止二代边合成边测序三代单分子合成测序
- 准确率上1＞2＞3
- 读长3＞1＞2
- 效率3＞2＞1
- 现在最常用的是二代
某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA

检测

280吸光

蛋白质（氨基酸）

一些电泳相关

如果是免疫法的话直接考马斯亮蓝染胶不用blot转膜
PAGE胶的制备：化学催化剂AP由TEMED催化产生硫酸自由基激活Acr（丙烯酰胺）形成长链由Bis（甲叉双丙烯酰胺）交联形成凝胶；光催化剂核黄素在TEMED和光照条件下还原再被氧化形成自由基进而聚合
- 化学聚合的启动需要TEMED推动光聚合不需要（光聚合法中没有TEMED也能凝固不过会比较慢）
- 光催化一开始需要氧气聚合过程中氧气必须隔绝因为氧分子会阻止碳链的延长和聚合
- Acr和Bis有神经毒性凝固后毒性基本没有但仍然不建议食用（啊喂）
使用SDS时加热可以使其结合更加充分可以使蛋白质转变成线性棒状结构

一些层析相关

测序

Sanger法：2'4'二硝基氟苯和蛋白质α－氨基反应然后用酸水解（一般肽链会被完全水解）得到DNP－氨基酸黄色也可以和别的氨基反应不一定测出的是N端蛋白质反应条件弱碱性
Edman法：PITC在碱性条件下和α－氨基反应得到PTC－肽链在无水强酸中被切割下来得到PTH－氨基酸和新的肽链可以自动化有读长限制反应条件弱碱性

提取

检测（和一些特异反应）

260吸光
ELISA
- 直接法：抗原吸附在固相载体上仅使用酶标一抗优点是方便快速交叉反应性低；缺点是成本高信号不够强灵敏度差
- 间接法：抗原吸附在固相载体上加入含有待测一抗的样本洗板后加酶标二抗用来检测抗体优点是高灵敏度和高灵活度；缺点是有非特异性结合的风险比直接法麻烦
- 夹心法：抗体吸附在板上加待测样本加检测抗体形成抗体－抗原－抗体的三明治结构洗板加酶标二抗洗板加显色底物
  - 分为直接和间接法直接法不用加酶标二抗
  - 优点是灵敏度高特异性高适用于复杂样本；缺点是对抗体要求高
- 竞争法：分参考臂和检测臂把抗原包被在孔板上加待测样本（含有未知浓度的游离抗原）和固定量的酶标抗体抗原浓度高则信号弱抗原浓度低则信号强
考马斯 R250更灵敏比G250多两个甲基 G250更常用定量用G250 抗干扰性好灵敏度高会被去垢剂干扰受蛋白质种类影响大
凯氏定氮法一堆奇妙的试剂得到氨然后滴定结果×8 三氯氰胺.jpg
双缩脲：肽键在碱性环境下和Cu^2＋离子结合形成紫色络合物可以定量检测灵敏度较低
BCA：在碱性环境下肽键把Cu^2＋还原成Cu^＋ Cu^＋再和BCA反应生成紫色络合物 562nm最大吸光复合物稳定灵敏度高会被强还原剂干扰受蛋白质种类影响大
- 我知道这很怪但是这个反应实际上是肽键旁边的α－碳院子发生一次去质子化－电子转移－得到质子的过程其结果可以看作生成了一个烯醇式结构作为中间过渡态真正的电子供体是α－碳上那个氢原子
lowry：双缩脲plus版先双缩脲再加folin－酚产生深蓝色物质比双缩脲灵敏但繁琐耗时长易被干扰
荧光法：不常考顾名思义用荧光染料染灵敏度/特异性高成本高需要标准曲线
茚三酮：和α－氨基反应蛋白质的游离氨基不支持产生明显实验结果用来检测氨基酸其他氨基酸为紫色脯氨酸为黄色
ellman反应：（别和edman搞混）二硝基苯甲酸弱碱条件下和巯基反应产物412nm有吸光拿来判断游离巯基含量
黄色反应：芳香族和浓硝酸反应变黄再加浓碱液变橙黄
坂口反应：精氨酸特异性反应 α－萘酚和次氯酸钠反应产生红色产物

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 === DNA/RNA ===
-==== Blot ====
+==== 一些电泳相关 ====
 * 众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
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 * 280吸光
-=== 蛋白质 ===
+=== 蛋白质（氨基酸） ===
-==== Blot ====
+==== 一些电泳相关 ====
 * 如果是免疫法的话直接考马斯亮蓝染胶 不用blot转膜
+* PAGE胶的制备：化学催化剂AP由TEMED催化产生硫酸自由基 激活Acr（丙烯酰胺）形成长链 由Bis（甲叉双丙烯酰胺）交联形成凝胶；光催化剂核黄素在TEMED和光照条件下还原再被氧化形成自由基进而聚合
+** 化学聚合的启动需要TEMED推动 光聚合不需要（光聚合法中没有TEMED也能凝固 不过会比较慢）
+** 光催化一开始需要氧气 聚合过程中氧气必须隔绝 因为氧分子会阻止碳链的延长和聚合
+** Acr和Bis有神经毒性 凝固后毒性基本没有但仍然不建议食用（啊喂）
+* 使用SDS时加热可以使其结合更加充分 可以使蛋白质转变成线性棒状结构
+==== 一些层析相关 ====
 ==== 测序 ====
+* Sanger法：2'4'二硝基氟苯和蛋白质α－氨基反应然后用酸水解（一般肽链会被完全水解）得到DNP－氨基酸 黄色 也可以和别的氨基反应 不一定测出的是N端蛋白质 反应条件弱碱性
+* Edman法：PITC在碱性条件下和α－氨基反应得到PTC－肽链 在无水强酸中被切割下来得到PTH－氨基酸和新的肽链 可以自动化 有读长限制 反应条件弱碱性
 ==== 提取 ====
-==== 检测 ====
+==== 检测（和一些特异反应） ====
 * 260吸光
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 *** 优点是灵敏度高特异性高 适用于复杂样本；缺点是对抗体要求高
 ** 竞争法：分参考臂和检测臂 把抗原包被在孔板上 加待测样本（含有未知浓度的游离抗原）和固定量的酶标抗体 抗原浓度高则信号弱 抗原浓度低则信号强
-* 考马斯 R250更灵敏 比G250多两个甲基 G250更常用 定量用G250
+* 考马斯 R250更灵敏 比G250多两个甲基 G250更常用 定量用G250 抗干扰性好 灵敏度高 会被去垢剂干扰 受蛋白质种类影响大
 * 凯氏定氮法 一堆奇妙的试剂得到氨然后滴定 结果×8 三氯氰胺.jpg
+* 双缩脲：肽键在碱性环境下和Cu<sup>2＋</sup>离子结合形成紫色络合物 可以定量检测 灵敏度较低
+* BCA：在碱性环境下肽键把Cu<sup>2＋</sup>还原成Cu<sup>＋</sup> Cu<sup>＋</sup>再和BCA反应生成紫色络合物 562nm最大吸光 复合物稳定 灵敏度高 会被强还原剂干扰 受蛋白质种类影响大
+** 我知道这很怪 但是 这个反应实际上是肽键旁边的α－碳院子发生一次去质子化－电子转移－得到质子的过程 其结果可以看作生成了一个烯醇式结构作为中间过渡态 真正的电子供体是α－碳上那个氢原子
+* lowry：双缩脲plus版 先双缩脲再加folin－酚 产生深蓝色物质 比双缩脲灵敏但繁琐耗时长 易被干扰
+* 荧光法：不常考 顾名思义用荧光染料染 灵敏度/特异性高 成本高 需要标准曲线
+* 茚三酮：和α－氨基反应 蛋白质的游离氨基不支持产生明显实验结果 用来检测氨基酸 其他氨基酸为紫色 脯氨酸为黄色
+* ellman反应：（别和edman搞混）二硝基苯甲酸 弱碱条件下和巯基反应 产物412nm有吸光 拿来判断游离巯基含量
+* 黄色反应：芳香族和浓硝酸反应变黄 再加浓碱液变橙黄
+* 坂口反应：精氨酸特异性反应 α－萘酚和次氯酸钠反应产生红色产物