各种工具酶

限制性内切酶

限制性内切酶在各种细菌和古菌中都具有（大家都怕噬菌体）；限制-修饰系统将自身基因组中特定序列甲基化，然后切割没有甲基化的“入侵者”.

限制性内切酶的种类

Ⅰ型限制性内切酶

功能：切割无甲基化的外来DNA；修饰半甲基化的DNA（刚刚完成复制的基因组DNA）为全甲基化的DNA。

识别位点：有两段识别位点，中间隔着一段非特异序列。比如识别TGANNNNNNNNTGCT的EcoB。不是回文序列。

切割位点：这类酶结合位点后会在DNA链上开始移动，直到数kb外的随机位点切割。显然，他们对科研没什么用处。

组成：三个亚基，分别负责切割、甲基化等功能。

辅因子：SAM、ATP、Mg

Ⅱ型限制性内切酶

功能：只能切割，不能甲基化。

识别位点：回文序列（除了ⅡS类），多数是6bp，也有4和8的，甚至还有5(EcoRⅡ)和7(BbvCⅠ)的。

切割位点：在回文序列内部（除了ⅡS类），酶不会在DNA上迁移。最有用的一类

组成：同源二聚体

辅因子：仅Mg

Ⅲ型限制性内切酶

功能：切割和甲基化

识别：5~6bp的非回文序列

切割位点：序列旁边25~27bp的特定位点（就是说距识别位点距离是固定的，不像Ⅰ）。也没有什么用。

辅因子：SAM,ATP,Mg

ⅡS型限制性内切酶

识别非回文序列，切割位点紧邻非回文序列，可用于GoldenGate克隆。

限制性内切酶的命名

举个例子：EcoRⅠ

E，代表E.coli的属名，单字母，大写，斜体。

co，代表E.coli的种加词，两字母，小写，斜体。

R，代表来自大肠杆菌菌株R，一字母，正体，有时大写有时小写——如HindⅢ的d代表来自Rd菌株。

Ⅰ，代表是在该菌株中发现的第一种限制性内切酶。

同尾酶和同裂酶

同尾酶：切割后露出的粘性末端一致，但识别位点不相同的酶。两种酶切除的末端链接后，谁也不能再次切开。

同裂酶：识别序列相同，但切割位点和露出粘性末端的序列未必相同的酶

如何计算限制性内切酶的切割片段平均长度

如果识别一个六bp回文序列，那么平均4^6bp会有一个位点。

如果识别的序列中仅限制是嘌呤或者是嘧啶，比如识别ARGCYT，那就是4*2*4*4*2*4bp有一个。

• 好像很简单，但这里其实要绕一个弯子：在一条链上出现“AAATTT”的概率是每4^6bp一次，那另一条链上出现的概率也是4^6bp一次，加起来应该每4^6÷2bp出现一次啊？这是因为我们恰好计算了一个回文序列，如果一个位点是AAATTT，那么他的对面也应该是AAATTT.反过来，一个位点不是AAATTT，他的对面一定不是AAATTT。因此我们不用计算两条链。但如果我们计算了一个非回文序列，那么就要除以二了。以上是个人思考，没有在题目中见过，也没有佐证的材料，望谨慎看待。

几种限制性内切酶的介绍

• NotⅠ,识别GCGGCCGC，因此切割位点特别稀少，称为稀切点酶。有用处。
• dpnⅠ：识别GA/TC, 只有当A被甲基化时才能切割。可用于点突变时去除甲基化的未突变的内源质粒.

限制性内切酶的星号活性

星号活性指一定条件下限制性酶切开了序列类似但不同的位点。原因可能是：

• 甘油浓度过高。限制性内切酶都是在50%的甘油中保存的，最终反应体系甘油浓度不应超过5%（即酶不应超过10%）。
• 酶浓度过高。
• 离子强度过低。
• pH过高。
• 有机溶剂存在。
• 不合适的二价阳离子。

DNA连接酶

可以连接3-OH Pi-5的缺口，不能连接3-OH HO-5，也不连接3-Pi HO-5。

这个性质可用来防止载体的自环化。比如你有一条DNA序列和一条被切为线性的载体，现在要加入连接酶把二者连接。好巧不巧你使用了单酶切法，这导致载体和目标序列的粘性末端都是互补的，直接加入DNA连接酶的话，会产生很多载体自身环化的产物。他们进入细菌后，没有带来产物，却带来了抗性基因，使得能在选择培养基上生长。

为了避免这个情况，你可以先用碱性磷酸酶去除载体的磷酸，这样自环化时，就成了3-OH HO-5，不能发生；而与目标基因链接时，一条链是3-OH Pi-5，可以链接，一条链是3-OH HO-5，不能连接。这样产生有两个缺口的环状质粒，在转入大肠杆菌后，大肠杆菌会帮你连接上的。

常用的有两种：大肠杆菌连接酶和T4连接酶。关于他们的区别请看右图。

最重要的：大肠杆菌用NADH，T4噬菌体用ATP。大肠杆菌不能连接平末端，T4可以。

DNA聚合酶

DNA聚合酶Ⅰ

有三种活性：5→3外切酶。3→5外切酶。DNA聚合酶。

用途：一边切除5段，一边合成3段，令其使用放射性底物，就可以用放射性核苷酸置换普通核苷酸，产生有放射性的/被标记的探针。

Klenow片段

用枯草杆菌蛋白酶切割DNApolⅠ，产生一个小片段-有5→3切除活性和一个大片段-称为Klenow片段，具有合成酶和3→5切除活性——丧失了5→3外切酶活性不能用于探针标记。

用途：①补平3凹入-聚合活性②切除3凸出-3切活性③Sanger测序④没有发现taq酶时，PCR使用klenow片段。只不过每次加热变性后要重新加酶。

Taq酶

大名鼎鼎的taq酶，没有3外切酶活性，不能够校对。会在产物的末端额外加一个A,这个特殊的性质可用于TA克隆。

顺口一提，产生taq酶的水生栖热菌虽然生存在高温泉水中，却是一种细菌而非古菌。

Pfu酶

具有校对能力，同时还耐高温。确实来自古菌-火球菌。

各种核酸酶

DNaseⅠ

镁离子存在时切dsDNA一条链形成缺口，锰离子存在时切两条链成断段。

绿豆核酸酶

内切单链dna和rna，需要锌。

核酸酶s1

同样内切单链dna和rna，需要锌。

核酸酶H

内切杂交链中的RNA链。