常用动物行为学实验方法

一、学习及记忆能力评估

Morris 水迷宫实验

简介

Morris 水迷宫实验装置（图源网络）

Morris 水迷宫实验通过强迫实验动物游泳，学习寻找水中隐藏平台以测试实验动物对空间位置感和方向感（空间定位）的学习记忆能力。测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。

• 定位航行试验(place navigation)历时数天,每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次,记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期,escape latency)。
• 空间探索试验(spatial probe)是在定位航行试验后去除平台,然后任选一个入水点将大鼠放入水池中,记录其在一定时间内的游泳轨迹,考察大鼠对原平台的记忆。

Morris水迷宫实验示意图

步骤

1. 将动物（大鼠或小鼠）头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间（s）。在前几次训练中，如果这个时间超过60s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10s.
2. 将动物移开、擦干。必要时将动物（尤其是大鼠）放在150W的白炽灯下烤5min，放回笼内。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔15~20min,连续训练5天。
3. 最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60s的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标.
4. 测定动物的工作记忆（working memory）。探查训练结束后的第二天，开始维持4天的对位训练。将平台放在原先平台所在象限的对侧象限，方法与获得性训练相同。每天训练4次。每次记录找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度。

巴恩斯迷宫实验

巴恩斯迷宫实验示意图

简介

这一实验装置通常由一个封闭的结构组成，形状可以是方形或圆形，地面上布置着一系列分支和死胡同。小鼠被放置在迷宫的起点，研究者观察其在迷宫中的运动轨迹、学习速度和对空间信息的记忆。关键的实验参数包括逃脱时间、错误次数、成功率等，这些数值可用于评估小鼠的学习和记忆表现。

• 错误洞： 在平台周围分布着19个错误洞，老鼠需要避免选择这些通道，以防止进入死胡同或产生错误。
• 正确洞： 在错误洞中间位置设有1个正确洞，是老鼠成功找到目标的通道。这个洞可能通向奖励区域，如食物，或是避免区域，如不受惩罚的安全区域。

• 起点： 老鼠开始实验的地方通常设在平台的某个固定位置。
• 正确通道： 实验的目标是让老鼠通过选择正确的通道找到目标洞，从而达到奖励或避免不愉快的后果。

巴恩斯迷宫实验装置

步骤

1. 准备工作：确保巴恩斯迷宫完好，设置正确和错误洞，准备奖励（食物）和惩罚（轻微电击）。
2. 动物适应：将实验动物适应环境，放置在巴恩斯迷宫外的适应箱中，适应时间为2-3天，每天10-15分钟。
3. 实验阶段：
   • 起点设置：将小鼠放置在迷宫起点，记录起始时间。
   • 导航任务：观察小鼠运动轨迹，记录选择通道、逃脱时间和错误次数。
   • 奖励和惩罚：在正确洞设置奖励激励学习，在错误洞引入轻微电击等惩罚测试避免性学习。
   • 重复试次：重复导航任务，每天多次试次，随机改变正确洞位置增加复杂性。
4. 数据记录与分析：使用视频记录或运动追踪系统记录小鼠运动轨迹，记录每次试次的逃脱时间、错误次数和成功率。分析小鼠在不同试次中的学习曲线，比较不同动物或实验条件下的学习表现。
   • 平均逃脱时间：评估小鼠学习速度，记录从起点到达正确洞的平均时间。
   • 错误次数：反映学习过程中的错误率，记录每次试次中小鼠选择错误通道的次数。
   • 成功率：评估学习和记忆能力，记录小鼠成功找到正确洞的频率。

洞板实验

简介

实验环境通常是一个正方形或长方形的平台，平台上有若干个孔洞，通常为16个或25个。每个孔洞的位置、直径和深度都是一样的。平台周围有高度约为20-30厘米的围栏，以防止小鼠跳出平台。平台上方有一定强度的光线照射，以提供一定的光照条件。小鼠被放置在平台中央，然后记录小鼠在一定时间内探索不同孔洞的行为。这些孔洞可能包括有或没有触发器的孔洞。通过观察小鼠进入或停留在不同的孔洞中，可以评估小鼠的活动能力、探索行为、认知能力等。

洞板实验装置（图源网络）

步骤

1. 预实验处理：在进行洞板实验之前，需要对小鼠进行一些处理。例如，在实验开始前，小鼠应该先进行适应处理，放置在实验室环境中进行适应。适应时间通常为1-2小时。此外，还需要给小鼠注射一定剂量的麻醉药物，以使其进入一定的安静状态。
2. 实验操作：将小鼠放置在平台中央，记录小鼠在一定时间内进入各个孔洞的次数和停留时间。孔洞通常分为四类：未触发孔洞、触发孔洞、触发后孔洞和中央区域。未触发孔洞和触发孔洞是在孔洞底部设置了一定的压力或光线或声音触发器，触发后孔洞是指未触发孔洞的下一层，中央区域则是指除孔洞外的平台中央区域。
3. 测试分析（使用VisuTrack动物行为分析软件自动记录）：记录小鼠的进入孔洞的次数和停留时间，进而分析小鼠的探索行为和认知能力。此外，还可以通过分析小鼠的活动轨迹，评估其活动范围和活动能力等。常见的参数包括：
   • 进入不同孔洞的次数和停留时间；
   • 进入触发器孔洞的次数和停留时间；
   • 孔洞探索顺序；
   • 孔洞探索时间；
   • 总体活动时间；
   • 运动速度；
   • 活动范围。

跳台实验

跳台实验装置

简介

在跳台实验中，小鼠位于一个无法逃脱的箱子里，箱内有一个带有电击的电网，电网上中间有一个站立平台。当小鼠从平台下来时，会受到来自电网的电击。该任务使用跳下潜伏期和保留潜伏期作为厌恶学习和记忆的测量指标，可以使用该装置轻松研究物质、神经退行性疾病和其他神经系统疾病对恶性学习和记忆的影响。

步骤

1. 训练：将小鼠轻轻放在室内的中央平台上。当小鼠用四只爪子跳下平台并踩到电网上时，会受到连续电击，直到它返回平台以逃避不愉快的刺激。记录跳下平台的潜伏时间和逃避潜伏时间。
2. 保留测试：保留测试通常在培训会话后的24小时进行。再次将小鼠放在中央平台上。记录踏下潜伏时间。观察小鼠直到截止时间。不论小鼠的活动如何，都将其放在室内的一个角落，尾巴朝向平台。然后输送电击，同时记录逃避潜伏时间。

Y 形迷宫实验装置（图源网络）

Y 形迷宫实验装置

简介

Y迷宫由三个等长的通道组成，这三个通道互相连接，形成一个“Y”形。实验过程中，研究人员会观察动物在迷宫中的行为，特别是它们如何探索和记忆通道。在一个典型的实验设置中，动物会被放置在Y迷宫的一个臂中，并被允许自由地探索所有的通道。研究人员会记录动物进入每个通道的次数和持续时间，以及它们重复进入同一通道的频率。这些数据可以提供关于动物空间记忆和认知能力的重要信息。

• Y迷宫实验的一个关键特点是它的非强制性质，即动物不会被强迫进入任何特定的通道。这使得实验更接近自然条件，能够更准确地反映动物的自然行为和认知状态。此外，由于Y迷宫的结构相对简单，动物不太可能因为迷宫的复杂性而产生应激反应，这有助于确保数据的可靠性

步骤

1. 环境准备与动物适应：确保实验室环境安静，光照适中。清洁迷宫，确保每个臂内部无异味或残留物。在实验前一天，让小鼠在Y迷宫中适应20-30分钟。
2. 动物选择与初始适应：选择健康的成年小鼠，随机分配至实验组。在实验当天，将小鼠单独放入Y迷宫中心，允许其自由探索5分钟以适应环境。
3. 实验记录：实验正式开始时，再次将小鼠放置在迷宫中心，实验总时长设置为5分钟。
   • 记录小鼠首次选择进入的臂（称为“起始臂”）。
   • 记录每个臂被进入的次数和持续时间。
4. 数据收集：使用视频记录设备或直接观察记录小鼠的行为。
5. 重复试验：为增加数据的可靠性，每只小鼠进行3-5次重复试验，每次试验间隔至少30分钟。
   • 臂访问频率：计算小鼠进入每个臂的次数比例。
   • 停留时间：记录小鼠在每个臂中的总停留时间。
   • 首选臂：分析小鼠是否偏好特定的臂。

T型迷宫实验

斑马鱼T迷宫

简介

该实验通过观察不同种类的动物在T型迷宫中的行为表现，揭示了动物的学习、记忆和空间认知等方面的特点，为研究动物的认知和行为机制提供了重要参考。

步骤

T型迷宫实验设计灵活性大，以下只列举一种基本实验设计。

1. 准备：将所有动物放入T迷宫中自由探索30分钟，让其熟悉环境。将动物随机分组，并在每组中选择10只动物作为实验对象。
2. 实验：将实验对象放入T迷宫起点，并记录其在T迷宫中的移动路径和时间。
3. 记录：当动物到达正确的出口时，立即将其取出并记录其所需的时间。
4. 重复：重复以上步骤多次，直至实验结束。

八臂迷宫实验

八臂迷宫实验

简介

八臂迷宫（8-Arm Maze）用来检测药物或大脑受损状态下学习和记忆方面的表现，它由八个完全相同的臂组成，这些臂从一个中央平台放射出来，所以又被称为放射迷宫（Radial Maze）。每个臂尽头有食物提供装置，根据分析动物取食的策略即进入每臂的次数、时间、正确次数、错误次数、路线等参数可以反映出实验动物的空间记忆能力。

步骤

1. 动物适应实验环境1周后，称重，禁食24小时。此后每天训练结束后限制性地给予正常食料（据体重不同，大鼠16-20g，小鼠2-3g），以使体重保持在正常进食大鼠的80%~85%。
2. 第二天，迷宫各臂及中央区分撒着食物颗粒（每只4~5粒，直径约3~4mm）。然后，同时将4只动物置于迷宫中央（通往各臂的门打开），让其自由摄食、探究10min。
3. 第三天，重复第二天的训练。这一过程让动物在没有很强的应激条件下熟悉迷宫环境。
4. 第四天起，动物单个进行训练：在每个臂靠近外端食盒处各放一颗食粒，让动物自由摄食。食粒吃完或10min后将动物取出。
5. 第五天，将食物放在食盒内，重复前一天的训练，一天2次，其间间隔1h以上。。
6. 第六天以后，随机选4个臂，每个臂放一颗食粒；各臂门关闭，将动物放在迷宫中央；30s后，臂门打开，让动物在迷宫中自由活动并摄取食粒，直到动物吃完所有4个臂的食粒。如经10min食粒仍未吃完，则实验终止。记录以下4个指标：
   • 工作记忆错误（working memory errors）,即在同一次训练中动物再次进入已经吃过食粒的臂；
   • 参考记忆错误（reference memory errors ），即动物进入不曾放过食粒的臂；
   • 总的入臂次数；
   • 测试时间，即动物吃完所有食粒所花的时间。

穿梭实验

大鼠避暗穿梭箱

简介

穿梭实验，又称穿梭箱实验或穿梭箱测试（Shuttle Box Test）。在这个实验中，动物（通常是老鼠）被置于两个相邻的腔室中，其中一个腔室内会提供声音和光刺激作为警告信号。这一实验的目的是研究动物在面对刺激时的回避行为和学习能力。

• 如果老鼠在声音和光刺激的警告期内成功逃离到另一腔室（被称为安全区），则被视为主动回避。
• 如果声音和光刺激结束后，老鼠仍停留在原腔室内，将给予电刺激作为惩罚，老鼠在被电刺激后逃至另一腔室则被归类为被动回避。
• 如果老鼠被电击后仍停留在原腔室且没有成功逃脱，则被认定为无反应。

穿梭箱实验中动物受到声光刺激后由左侧较暗箱体逃入右侧白色箱体

步骤

1. 准备期：在实验前1-2天，每天抚摸实验动物1-5min，借以消除实验动物对实验者的恐惧。
2. 训练期：先让动物在测试箱中自由活动5min，以消除探究反射。将动物置于穿梭实验箱电击区。先给予条件刺激(灯光)和(或)蜂鸣音（纯音刺激）20 s（时长可调节），然后给以10s（时长可调节）的电刺激(电流强度为0.2-0.8mA，可调节)。如果在亮灯或声音响20 s内大鼠逃向安全区为主动回避反应，电击后才逃向安全区为被动回避反应。经过数次训练后，大鼠可逐渐形成主动回避性条件反应，从而获得记忆。共训练20～40次，即设定测试次数为20～40次。
3. 正式测试期：做实验时，将实验动物置于穿梭箱电击区，方法步骤同训练期。记录动物遭受电击的次数(被动回避的次数)以及动物主动回避的次数；也可以记录动物主动回避平均反应时间，该值越小，说明动物主动回避反应越迅速。

新物体识别实验

简介

新物体识别实验装置

在一个旷场箱内放几个物体，让小鼠熟悉一段时间后，将其中一个物体换成一个新物体。观察实验鼠是否对新物体更感兴趣。若否，则认为实验鼠有记忆缺失的可能。

新物体识别实验场景布置

步骤

1. 适应阶段：在进行训练和测试前三天，每天抚摸实验小鼠 1min，避免刺激。在进行训练或测试前 24h，将小鼠放在测试的房间内，头朝向实验者这一面，让其自由探索 5min。
2. 训练阶段：将两个相同的物体固定在距两箱壁各 5cm 处，随后将小鼠放入空箱中，头朝两个相同物体相反的方向，让其在箱中自由运动。记录小鼠与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体小于 2cm 范围内探究的时间。如果总探索时间达 20s 或者实验时间达到 10min，停止实验并记录此过程花费的时间。
3. 测试阶段：每只小鼠标准时间小于 10 min，24h 后，与训练阶段相似，将相同物体的一个换成另一个物体。新物体的位置（左或右）在不同小鼠和不同测试组中随机。计时小鼠分别在两个物体上的探索时间和探索次数，如果总探索时间达到 20s 或者实验时间达到 10min 需停止实验并记录此过程花费的时间。
   • 测试阶段小鼠行为被跟踪记录，并据此单独分析每只小鼠探索新物体的时间T1与探索旧物体的时间 T2，计算得到认知指数 CI。CI=T1/(T1+T2)。
   • 也可计算小鼠的认知指数(Recognition index，RI)。RI(％)=新物体探索次数/（新物体探索次数+旧物体探索次数）×100%。认知指数越高表示小鼠记忆能力越强。

斯金纳箱

斯金纳箱（图源网络）

简介

在箱壁的一边有一个可供按压的杠杆（大多是一块金属板），在杠杆旁边有一个承受食物的小盒紧靠着箱壁上的小孔，小孔外是食物释放器，其中贮有颗粒形食物。动物在箱内按一下杠杆，即有一粒食物从小孔口落入小盒内，动物可取食。结合奖惩机制，可形成操作条件反射。用于研究动物学习能力和自我刺激与合作行为等心理学研究。

步骤

基于实验需求灵活设计。

二、运动耐力及平衡协调能力评估

转棒实验

小鼠平衡转棒实验装置

简介

实验中，小鼠被放置在一个旋转的棒上，需要通过调整自身的重心来保持平衡并避免从棒上掉落，通过调整旋转棒的速度、角度和时间等参数测定小鼠在旋转棒子上停留时间的长短来评估小鼠的运动和平衡能力。

步骤

1. 适应：在进行测试之前，将小鼠适应测试环境 1~2 天，期间让小鼠进入测试装置并且经历一些试验来熟悉旋转棒，减少因过度不适应实验环境导致的误差。在适应期间棒的旋转速度一般比测试时慢，训练时间为 5~10 分钟，以帮助小鼠逐渐适应棒的运动。
2. 实验：手持小鼠身体，将前爪和后爪轻放于旋转棒上，背向杆旋转的方向。在测试期间，棒的旋转速度逐渐增加，一般加速度设置为 20 rpm/min，测试时间为 5~10 分钟。
3. 记录：记录小鼠的停留时间：记录小鼠从登上旋转棒开始的时间，并在小鼠掉下来或完成满足条件的时间后停止计时。重复测量每个小鼠的时间来确定平均值，同时记录小鼠在棒上的速度。
4. 分析：分析实验结果：通过比较不同组别小鼠的停留时间，评估其运动协调性和平衡能力。在转棒测试中，下列指标用于评估小鼠的运动协调能力。
   • 潜伏期（latency）：它表示小鼠第一次掉落棒的时间，潜伏期越长，表明小鼠的运动协调能力越好。
   • 均衡时间（balance time）：它表示小鼠能够保持在棒上的时间，这个指标通常用于测量小鼠在旋转速度逐渐增加时的运动协调能力，均衡时间越长，表明小鼠的运动协调能力越好。
   • 转速（rotational speed）：棒的旋转速度，一般以每分钟旋转数（rpm）为单位。
   • 转数（rotations）：小鼠在测试期间在棒上完成的完整转数。

平衡木实验

简介

平衡木检测实验图

该实验通过观察动物在平衡木上行走的能力以评估动物运动协调性和平衡能力的行为学测试方法。

步骤

1. 实验前准备：
   • 准备一个平衡木设备，通常包括一个木棒或金属棒，长度约为1米，直径可以根据实验需求选择（如1-2厘米）。木棒的两端需要分别固定在支撑架上，使其悬空并保持水平。确保实验场地安静、无干扰。
   • 在正式测试前，对动物进行平衡木训练。首先，让动物熟悉实验环境，可以让动物在实验室待一段时间。接着，在平衡木上进行逐步训练，从较粗的木棒开始，让动物多次行走，直至熟练。随后，逐渐减小木棒的直径，让动物适应不同直径的木棒。训练时间可根据动物的适应程度确定。
   • 实验前30分钟，将动物从笼子里移至实验室，让其适应环境。确保动物禁食约1小时，以避免食物摄入对实验结果的影响。
2. 实验操作：将动物放置在平衡木的起始端。开始计时，观察动物在平衡木上行走过程中的摔落次数与通过时间，同时观察其姿态调整，如抓握能力、身体平衡、步态等。
3. 重复实验：每只动物需要进行多次实验（如3-5次），实验间隔时间应足够长。
4. 数据记录和分析：统计，对比，求均值等。

爬杆实验

爬杆实验示意图（图源网络）

简介

在该实验中，动物被放置在一个垂直的杆子上，然后观察它们的能力来保持平衡和爬到杆子的顶部，常用于评估动物的协调能力和肌肉功能。

步骤

1. 选取合适的杆子：通常是直径为1-3厘米的木杆或金属杆。杆子的高度通常是50-100厘米。
2. 适应期训练：适应期训练通常包括将动物放置在杆子底部，然后逐渐向上移动杆子，让动物逐渐适应，以提高它们的协调能力。
3. 测试阶段：将动物放置在杆子底部，记录动物到达杆子顶部所需的时间和在杆子上停留的时间。通常进行多次测试，以获得可靠的结果。
4. 数据分析：通常包括计算平均值、标准差、方差等参数。

抓力测试

抓力测试（图源网络）

简介

抓力测试是一种简单、无创的方法，用于活体评估小鼠和大鼠的肌肉力量，通过确定动物产生的最大功率来测量神经肌肉功能。测试装置由一个杆或网格组成，该杆或网格连接到一个力敏传感器，该传感器又连接到计算机。力敏传感器记录每次试验获得的最大力量。

步骤

1. 实验：
   • 小鼠前肢抓力测试：将实验小鼠放置在抓力计上，轻轻拉动实验鼠的尾巴，使小鼠前肢用力抓住探头。当实验人员对实验小鼠施加最大力量时，记录抓力计上的读数。多次重复测量保证结果。
   • 小鼠后肢抓力测试：将实验鼠放置在抓力计上，让其后肢抓住探头，轻轻拉动实验鼠的尾巴，使其用力抓住探头。记录实验鼠施加最大力量时的抓力计读数。进行多次重复测量。
2. 数据分析：对测量的数据进行整理和计算，获得实验小鼠的平均抓力值。将不同实验组的抓力值进行对比分析。

负重游泳

负重游泳实验（图源网络）

简介

常用的实验方法是将小鼠尾部1/3一2/3处负重(体重的5 %一10%) 后投人水槽中游泳，观察和记录小鼠自入水后到沉入水中，不能浮出水面(处于力竭状态)的时间。此负重游泳时间被看作是定量客观评价疲劳程度的指标。若负重游泳时间越长， 则表明药物的抗疲劳效果越佳。

步骤

1. 游泳筛选：动物分组与给药小鼠适应性喂养7d后，进行游泳筛选。
   • 将筛选后适应游泳训练的小鼠以数字随机分组法分组：正常组、模型组、给药组。除正常组外各组小鼠每天进行负重游泳训练。训练期间，各组每天自由摄食饮水。
   • 训练28d，第1周进行无负重游泳训练，第2周负重2%体质量，第3周负重4%体质量，第4周负重5%体质量，每次训练至力竭。最后一次为无负重游泳训练，记录小鼠力竭时的游泳时间。
2. 游泳试验：最后一次给药30min后，将小鼠尾部1/3-2/3处负重，重量为其体重的5%，然后放入水深约25cm的水槽中进行游泳试验，实验中水温保持在（25±1）℃。记录首次连续下沉时刻和力竭时间等指标。游泳结束后立即捞出小鼠，擦干小鼠身上的水，放回原笼中，置于温暖环境下恢复。
   • 首次连续下沉时刻是小鼠在负重游泳过程中首次出现连续两次及以上头部完全浸入水中的时刻。
   • 力竭标准：小鼠下沉后10s不露出水面。

跑台实验

简介

跑台的核心部分是一个滚动的传送带，传送带表面的材质有利于动物抓地。通道的后壁安装有刺激电极、发声装置及发光的小灯泡或吹风装置，各个通道的刺激装置是彼此独立的。当动物拒绝跑动或者跑速低于实验要求时，就会在传送带上退行而碰触到后壁的刺激装置，较强的电刺激或声音刺激将迫使动物按照跑台的速度奔跑。常用于小动物如大鼠、小鼠的运动训练、运动及神经功能测试、新陈代谢研究等。

步骤

1. 

   大鼠跑台训练示意图

   适应性训练：通常设定速度为15~20m/min,为了获得更好的训练效果，可分段设定不同速度，如第一个3min设定5m/min;第二个3min设定10m/min,第三个3min设定为15m/min,最后1min设定为20m/min,按这样的方式可使动物能迅速适应训练节奏。这样的训练每次10min,每天1次，一般要训练5～6次。
2. 正式训练：经过适应训练后，正式运动训练一般每天1次，每次运动20～30min,训练时间一般4～6周(通常为30天),最长可达8周；跑步机的速度可以设定为一天内渐进式，如速度2m/min运行5min,3m/min运行5min,然后5m/min运行20min;或者设定为固定速度如10m/min持续30min。
3. 力竭实验：跑步机训练时间30天，每天在跑步机上适应2min,然后以15m/min速度跑步30min,进一步增加至18m/min速度跑步30min,再进一步增加至21m/min,一直保持或进一步增加速度到力竭。
   • 力竭动物的行为表现：动物跟不上预定速度，大鼠臀部压在笼具后壁，后肢随转动皮带后拖达30s,毛刷刺激驱赶无效；行为特征为呼吸深急，精神疲倦，俯卧位垂头，刺激后无反应，最终记录跑步力竭时间。
   • 评价指标：常采用动物在力竭实验中的运动距离、电击次数、最大跑步速度、力竭时间，即动物运动达力竭时的运动距离、受到的刺激次数、最大的跑步速度和运动时间等评价动物的运动耐力和耐疲劳程度。运动距离增加、跑步速度快、电击次数减少、力竭时间长，代表动物运动耐力大。

三、动物情绪活动能力评估

三箱社交实验

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