Sanger测序：修订间差异
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Sanger测序即双脱氧链终止法、一代测序技术。 | |||
在HGP中被广泛使用。 | |||
== 基本原理 == | |||
Sanger测序基于DNA复制的原理，通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。 | Sanger测序基于DNA复制的原理，通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。 | ||
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* 向体系中加入不同类型的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP），使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止，形成一系列不同长度的DNA片段。 | * 向体系中加入不同类型的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP），使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止，形成一系列不同长度的DNA片段。 | ||
反应过程 | == 反应过程 == | ||
构建反应系统 | === 构建反应系统 === | ||
每个反应体系包含四种dNTP，用于正常DNA合成。 | |||
每个反应体系加入一种特定的ddNTP，使其在特定碱基处终止DNA链。 | |||
为了方便定位，ddNTP通常会被荧光或同位素标记。 | |||
反应体系还包括目标DNA片段、DNA聚合酶和引物。 | |||
=== 扩增目的片段 === | |||
以目标DNA片段为模板，在DNA聚合酶的催化下，从引物处开始复制DNA。 | 以目标DNA片段为模板，在DNA聚合酶的催化下，从引物处开始复制DNA。 | ||
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通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度，可以控制链终止的位置和频率。 | 通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度，可以控制链终止的位置和频率。 | ||
凝胶电泳 | === 凝胶电泳 === | ||
使用高分辨率变性丙烯酰胺凝胶电泳将不同长度的DNA片段分开。 | 使用高分辨率变性丙烯酰胺凝胶电泳将不同长度的DNA片段分开。 | ||
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从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列，从而推知待测模板链的序列。 | 从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列，从而推知待测模板链的序列。 | ||
应用实例 | == 应用实例 == | ||
=== 乙型肝炎病毒耐药基因突变检测 === | |||
一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒（HBV）DNA拷贝数大于10^3的患者血清进行测序。 | 一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒（HBV）DNA拷贝数大于10^3的患者血清进行测序。 | ||
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研究还发现，LAM药物（拉米夫定）的耐药发生率较高，为9.77%。 | 研究还发现，LAM药物（拉米夫定）的耐药发生率较高，为9.77%。 | ||
肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测 | === 肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测 === | ||
一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的CDA基因突变情况。 | 一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的CDA基因突变情况。 | ||
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研究表明，Sanger测序法可以有效地检测CDA基因突变，为临床用药提供参考。 | 研究表明，Sanger测序法可以有效地检测CDA基因突变，为临床用药提供参考。 | ||
胶质瘤IDH突变检测 | === 胶质瘤IDH突变检测 === | ||
一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。 | 一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。 | ||
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IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸，最常见的突变类型是IDH1R132H，占总突变的94%。 | IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸，最常见的突变类型是IDH1R132H，占总突变的94%。 | ||
感音神经性聋患者常见聋病基因检测 | === 感音神经性聋患者常见聋病基因检测 === | ||
一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。 | 一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。 | ||
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结果显示，Sanger测序法可以成功检测这些基因的突变，为临床诊断提供依据。 | 结果显示，Sanger测序法可以成功检测这些基因的突变，为临床诊断提供依据。 | ||
优势和局限性 | == 优势和局限性 == | ||
=== 优势 === | |||
高准确性: Sanger测序法的准确率非常高，通常在99.99%左右。 | 高准确性: Sanger测序法的准确率非常高，通常在99.99%左右。 | ||
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广泛使用： 由于其可靠性和准确性，Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。 | 广泛使用： 由于其可靠性和准确性，Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。 | ||
局限性 | === 局限性 === | ||
成本较高： 对于大规模、自动化基因组分析，Sanger测序的成本较高。 | 成本较高： 对于大规模、自动化基因组分析，Sanger测序的成本较高。 | ||
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灵敏度限制: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上，这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。 | 灵敏度限制: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上，这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。 | ||
与其他技术的比较 | == 与其他技术的比较 == | ||
=== 焦磷酸测序法 === | |||
焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术，与Sanger测序法相比，焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。 | 焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术，与Sanger测序法相比，焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。 | ||
例如，一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用，结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。 | 例如，一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用，结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。 | ||
ADx-ARMS法 | === ADx-ARMS法 === | ||
ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术，具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。 | ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术，具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。 | ||
一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用，结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法（51.0% vs 25.3%）。 | 一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用，结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法（51.0% vs 25.3%）。 | ||
蓝白斑筛选联合Sanger测序技术 | === 蓝白斑筛选联合Sanger测序技术 === | ||
通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度，达到千分之一的水平。 | 通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度，达到千分之一的水平。 | ||
该技术操作简便，成本低廉，适合在基层医院推广，可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测，提供预后信息。 | 该技术操作简便，成本低廉，适合在基层医院推广，可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测，提供预后信息。 | ||
2025年1月24日 (五) 08:28的版本
Sanger测序即双脱氧链终止法、一代测序技术。
在HGP中被广泛使用。
基本原理
Sanger测序基于DNA复制的原理，通过在DNA合成过程中引入链终止剂来实现测序。
测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、引物和DNA聚合酶。
- ddNTP由于缺少3'-OH基团，无法与下一个dNTP形成磷酸二酯键，导致DNA链在此位置终止，ddNTP成为该肽段的末端。
- 向体系中加入不同类型的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP），使得DNA链在A、G、C、T位点分别终止，形成一系列不同长度的DNA片段。
反应过程
构建反应系统
每个反应体系包含四种dNTP，用于正常DNA合成。
每个反应体系加入一种特定的ddNTP，使其在特定碱基处终止DNA链。
为了方便定位，ddNTP通常会被荧光或同位素标记。
反应体系还包括目标DNA片段、DNA聚合酶和引物。
扩增目的片段
以目标DNA片段为模板，在DNA聚合酶的催化下，从引物处开始复制DNA。
当遇到ddNTP时，反应停止，产生一系列具有共同起始点但不同终止点的DNA片段。
通过调节dNTP和ddNTP的相对浓度，可以控制链终止的位置和频率。
凝胶电泳
使用高分辨率变性丙烯酰胺凝胶电泳将不同长度的DNA片段分开。
凝胶电泳有四个泳道，每个泳道对应一种碱基（A、G、C、T）。
电泳结束后，通过放射自显影或紫外显影读取凝胶影像，确定每个片段的终止位置。
从凝胶底部到顶部读出新合成链的序列，从而推知待测模板链的序列。
应用实例
乙型肝炎病毒耐药基因突变检测
一项研究使用Sanger测序法对215例乙型肝炎病毒（HBV）DNA拷贝数大于10^3的患者血清进行测序。
结果显示，40例（18.6%）患者检测到耐药基因突变，其中21例（9.77%）具有对应参考价值。<cite>2</cite>
研究还发现，LAM药物（拉米夫定）的耐药发生率较高，为9.77%。
肺癌吉西他滨化疗耐药敏感基因CDA检测
一项研究使用Sanger测序法检测255例晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的CDA基因突变情况。
检测成功率高达98.04%，敏感度和特异度分别为92.50%和99.52%。
研究表明，Sanger测序法可以有效地检测CDA基因突变，为临床用药提供参考。
胶质瘤IDH突变检测
一项研究使用Sanger测序法检测660例胶质瘤样本中的IDH1和IDH2基因突变。
结果显示，237例（35.9%）样本检测到IDH1基因突变，9例（1.4%）样本检测到IDH2基因突变。
IDH1基因突变主要集中在132位氨基酸，最常见的突变类型是IDH1R132H，占总突变的94%。
感音神经性聋患者常见聋病基因检测
一项研究使用Sanger测序法检测GJB2、SLC26A4和mtDNA基因的突变情况。
研究选择了GJB2基因的第二个外显子、SLC26A4基因的p8和p18两个外显子、mtDNA的两个常见突变位点进行测序。
结果显示，Sanger测序法可以成功检测这些基因的突变，为临床诊断提供依据。
优势和局限性
优势
高准确性: Sanger测序法的准确率非常高，通常在99.99%左右。
长读长: 可以产生超过500个核苷酸的读长，适用于较长的DNA片段测序。
广泛使用： 由于其可靠性和准确性，Sanger测序法在许多小型项目和验证性研究中仍然广泛应用。
局限性
成本较高： 对于大规模、自动化基因组分析，Sanger测序的成本较高。
通量较低: 相比于下一代测序技术（如Illumina），Sanger测序的通量较低，不适合处理大量样本。
灵敏度限制: Sanger测序法的灵敏度一般要求突变细胞占总标本的15%以上，这限制了其在某些低突变频率样本中的应用。
与其他技术的比较
焦磷酸测序法
焦磷酸测序法是一种基于焦磷酸释放的测序技术，与Sanger测序法相比，焦磷酸测序法在某些情况下可以提供更高的灵敏度。
例如，一项研究比较了焦磷酸测序法和Sanger测序法在检测CYP2C19*17基因多态性中的应用，结果显示焦磷酸测序法的检出率更高。
ADx-ARMS法
ADx-ARMS法是将ARMS和双环探针实时PCR技术相结合的一种新技术，具有高灵敏度和无需开盖操作的特点。
一项研究比较了ADx-ARMS法和PCR-Sanger测序法在检测非小细胞肺癌微小标本EGFR基因突变中的应用，结果显示ADx-ARMS法的总突变检出率显著高于Sanger测序法（51.0% vs 25.3%）。
蓝白斑筛选联合Sanger测序技术
通过蓝白斑筛选技术可以提高Sanger测序法的灵敏度，达到千分之一的水平。
该技术操作简便，成本低廉，适合在基层医院推广，可以用于对肿瘤切除术后患者的血中游离DNA进行监测，提供预后信息。