细胞周期调控
前言
众所周知，某不知名通用细胞生物学教材在这一块内容的描述堪称清晰至极，为了增加大家学习细胞周期调控的难度，于是笔者打算从头重构，从真正细胞周期的顺序，为大家梳理一遍。
Cyclin-CDK复合物
Cyclins：细胞周期蛋白
细胞周期蛋白最初得名于其浓度在细胞周期中呈周期性变化。（根据其保守的细胞周期蛋白盒结构进行分类）细胞周期蛋白的振荡，即细胞周期蛋白基因表达的波动以及泛素介导的蛋白酶体途径对其的降解，会诱导细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）活性的振荡，从而驱动细胞周期。细胞周期蛋白与Cdk形成复合物，Cdk开始被激活，但完全激活还需要磷酸化。复合物的形成导致Cdk活性位点的激活。细胞周期蛋白本身没有酶活性，但它们具有某些底物的结合位点，并将Cdk靶向特定的亚细胞定位。
结构
周期蛋白之间的一级结构（即氨基酸序列）通常差异显著。然而，所有周期蛋白家族成员在构成周期蛋白盒的约100个氨基酸区域上具有相似性。周期蛋白包含两个结构相似的全α折叠，第一个位于N端，第二个位于C端。一般认为所有周期蛋白都具有相似的三级结构，即由五个α螺旋紧密排列组成的两个结构域。其中第一个结构域为保守的周期蛋白盒，而周期蛋白盒以外的区域则呈现多样性。例如，S期周期蛋白和M期周期蛋白的氨基末端区域包含短小的破坏盒基序，这些基序可在有丝分裂中靶向引导这些蛋白质发生蛋白水解。
CDKs：细胞周期依赖性蛋白激酶
细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞周期的调控。这些酶作为上游调控因子，响应细胞外和细胞内信号，调控转录、DNA修复、代谢和表观遗传调控等细胞过程。它们存在于所有已知的真核生物中，其在细胞周期中的调控功能在进化过程中高度保守。
CDKs的激活需要结合cyclins和磷酸化。这种磷酸化通常发生在特定的苏氨酸残基上，导致CDK发生构象变化，增强其激酶活性。激活后形成cyclin-CDK复合物，该复合物磷酸化特定的调节蛋白，这些蛋白是启动细胞周期各个步骤所必需的。在人类细胞中，CDK家族包含20个不同的成员，它们在细胞周期调控和转录中起关键作用。它们通常分为细胞周期CDK（调节细胞周期转换和细胞分裂）和转录CDK（介导基因转录）。CDK1、CDK2、CDK3、CDK4和CDK6直接与细胞周期事件的调控相关，而CDK7–13与转录调控相关。不同的cyclin-CDK复合物调控细胞周期的不同阶段，即G0/G1、S、G2和M期，这些阶段设有多个检查点以维持基因组稳定性并确保准确的DNA复制。较早细胞周期阶段的cyclin-CDK复合物有助于激活较后阶段的cyclin-CDK复合物。
Cyclin-CDK 复合物类型、作用及其存在周期
- G1/S 期细胞周期蛋白 – 对于细胞周期在细胞周期检查点 G1期检查点（G1/S 期转换）的调控至关重要。
- Cyclin A / CDK2 – 在 S 期活跃。
- Cyclin D / CDK4、Cyclin D / CDK6 和 Cyclin E / CDK2 – 调控从 G1 期到 S 期的转换。
- G2/M 期细胞周期蛋白 – 对于细胞周期在细胞周期检查点G2期检查点（G2/M 期转换）的调控至关重要。G2/M 期细胞周期蛋白在 G2 期稳定积累，并在细胞退出有丝分裂时（中期|M期末期）被迅速降解。
- 细胞周期蛋白B / Cdk1|CDK1 – 调控从 G2 期到 M 期的进程。
| CDK | Cyclin伴侣 | 已确认的功能 |
|---|---|---|
| CDK1 | cyclin B | M期转换 |
| CDK2 | cyclin A | S/G2转换 |
| CDK2 | cyclin E | G1/S转换 |
| CDK3 | cyclin C | G0/G1和G1/S转换 |
| CDK4, CDK6 | cyclin D | G1/S转换。视网膜母细胞瘤基因产物（Rb）的磷酸化 |
| CDK7 | cyclin H | CAK和RNAPII转录 |
CDK抑制系统（CKI）
主要分为INK4家族和CIP/KIP家族。
INK4家族
该家族的成员（p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d）是CDK4和CDK6的抑制剂。另一类CKI家族，即CIP/KIP蛋白，能够抑制所有的CDKs。强制表达INK4蛋白可通过促进Cip/Kip蛋白的重新分布并阻断cyclin E-CDK2的活性，导致G1期阻滞。在周期中的细胞里，随着细胞在G1期推进，Cip/Kip蛋白会在CDK4/6和CDK2之间重新分配。INK4蛋白的功能是抑制CDK4/6，从而阻止细胞周期越过G1期限制点。此外，INK4蛋白在细胞衰老、凋亡和DNA修复中也发挥作用。
CIP/KIP
CIP/KIP（CDK相互作用蛋白/激酶抑制蛋白）家族由三种蛋白质组成：p21cip1/waf1、p27kip1和p57kip2。这些蛋白质在N端结构域具有序列同源性，这使得它们能够同时结合cyclin和CDK。它们的主要活性涉及结合并抑制G1/S期和S期的CDKs；然而，研究也表明它们在激活G1期CDKs（CDK4和CDK6）中发挥重要作用。此外，最近的研究工作显示，CIP/KIP家族成员还具有许多不依赖于CDK的功能，涉及调控转录、细胞凋亡和细胞骨架。
CIP/KIP家族蛋白能够结合多种G1/S期和S期的cyclin-CDK复合物，包括cyclin D-CDK4/6复合物以及cyclin E-、cyclin A-CDK2复合物。传统观点认为CIP/KIP蛋白的作用是抑制所有这些复合物；然而后来发现，CIP/KIP蛋白在抑制CDK2活性的同时，也可能通过促进cyclin D与CDK4/6之间的稳定结合来激活cyclin D-CDK4/6的活性。
cyclin A-CDK2的调控
p27同时与cyclin A和CDK2相互作用。此外，p27模拟ATP并插入ATP结合位点，从而阻止ATP结合。这种机制阻断了任何激酶活性，并阻止了视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的下游过度磷酸化，而Rb的过度磷酸化通常会导致E2F转录因子的释放以及细胞周期相关基因的转录。
cyclin D-CDK4/6的调控
Cyclin D与其CDK的亲和力较低。因此，有假设认为需要额外的蛋白质来形成稳定的cyclin D-CDK4/6复合物。越来越多的证据表明，CIP/KIP蛋白参与了这种稳定作用。首个证据来自观察到p27经常与有活性的cyclin D-CDK4复合物发生免疫共沉淀。此外，缺乏p21和p27的小鼠胚胎成纤维细胞中cyclin D1水平较低，且免疫沉淀的cyclin D-CDK复合物没有激酶活性。重新引入p21和p27可以挽救这些效应，但重新引入cyclin D1却不能，这表明CIP/KIP蛋白对于cyclin D-CDK的活性至关重要。体外实验证据表明，cyclin D-CDK对CIP/KIP的结合并不局限于p21和p27，p57也可以实现这种结合。
CIP/KIP对G1-S期调控的模型
基于CIP/KIP蛋白结合CDK2还是CDK4/6所产生的不同作用，形成了一个模型：在G1早期，CIP/KIP蛋白结合并失活CDK2复合物；然而，随着Cyclin D的产生，CIP/KIP蛋白被移除并重新用于稳定cyclin D-CDK。这种隔离作用随后释放了cyclin A-和cyclin E-CDK2，使其能够过度磷酸化Rb并促进细胞周期的进程。该模型得到以下发现的支持：表达野生型或无催化活性的CDK4均可隔离CIP/KIP蛋白，从而导致cyclin E-CDK2的激活。这一发现表明，cyclin D-CDK复合物隔离CIP/KIP蛋白的能力超过了其对CDK2的抑制活性。
Rb-E2F通路与G1/S转换
G1/S转换是细胞周期中位于G1期末端、细胞正式进入DNA复制之前的关键转换阶段。对动物细胞而言，这一阶段并不只是单纯的“从G1到S”的时间推进，而是一个高度整合性的决策过程：细胞需要综合外界促分裂刺激、营养与生长状态、抗增殖信号以及DNA是否完好的信息，然后在静止、分化、修复或增殖之间作出选择。就此意义而言，G1/S转换既是细胞周期机器的一个节点，也是细胞命运被压缩成“是否复制DNA”这一根本判断的分子门槛。
概述
在哺乳动物细胞中，G1/S转换发生于G1晚期，并受到细胞周期检查点的严格约束。其中心问题是：细胞是否已经具备进入S期并完成DNA复制的条件。若条件不足，细胞可以停留在G1期，回到G0静止状态，或启动修复程序；若条件合适，则通过一系列激酶活化、转录解除抑制以及蛋白降解事件，迅速切换到面向DNA复制的程序。
这一转换之所以具有决定性，原因不只在于它位于S期之前，更在于它通常被视为细胞周期中的一个“不可回返点”。一旦细胞越过这一点，即便外界促分裂因子随后减弱，细胞也往往能够依靠内部正反馈网络继续推进到S期。也正因此，G1/S转换在多细胞真核生物中通常与限制点（restriction point, R-point）相联系。
限制点：R点
限制点是G1期中的一个经典概念，用以说明细胞在何时从“依赖外界刺激”转变为“依赖内部程序”。在限制点之前，细胞必须持续接收促分裂信号，才能顺利通过G1早期和中期；一旦通过限制点，细胞便不再需要外界持续供给增殖刺激，而会不可逆地进入为DNA复制做准备的状态。
从经典描述来看，G1可进一步区分为若干功能性阶段。在到达限制点之前，细胞要经历与外界刺激整合密切相关的“获得增殖能力”“进入G1”以及“推进G1”等子阶段。若在此之前撤去血清或生长刺激，细胞可退回静止状态；而一旦越过限制点，再撤去外界刺激，细胞通常仍会继续朝S期推进。因此，限制点并不是一个简单的时间标记，而是细胞将环境信息内化为分子决定的关键节点。
外界信号如何进入细胞周期机器
G1/S转换的启动并非自发发生，而是通常由生长因子信号驱动。促分裂刺激可通过Ras/Raf/ERK、MAPK以及PI3K等通路传入细胞核，诱导与细胞周期推进有关的基因表达。其中，D型细胞周期蛋白的产生是一个关键环节。Myc、AP-1、Fos等转录因子可参与这一过程，推动Cyclin D及相关G1期调控因子的转录，并促进核糖体生物发生与细胞生长，从而把“外界存在分裂理由”转化为“细胞内部具备启动条件”的信号。
与之相对，抗增殖信号也可作用于这一阶段。例如多种CDK抑制蛋白可在高增殖压力或抑制性刺激下被激活，抑制Cyclin D相关激酶活性，使细胞停在限制点之前。这说明限制点并非单纯的促分裂阈值，而是外界促进与抑制力量竞争后的结果。
Cyclin D-CDK4/6：G1期的启动模块
Cyclin D是连接外界生长刺激与细胞周期推进的关键细胞周期蛋白。D型细胞周期蛋白包括Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3三个成员，其中Cyclin D1研究尤多。Cyclin D本身并不是催化酶，它必须与CDK4或CDK6结合，形成有活性的激酶复合物，才能真正介入G1/S转换。
CDK4是Cyclin D复合物中的催化亚基之一，CDK4与CDK6在结构和功能上高度相关，通常并称CDK4/6。它们在G1期通过磷酸化pRb等底物，逐步削弱细胞对S期入口的抑制。CDK4因此不只是一个“与Cyclin D结合的激酶”，更是把生长因子输入翻译为细胞周期推进动作的酶学执行者。
在正常情况下，Cyclin D的合成与稳定依赖外界生长信号，因此它使细胞周期保持对环境的敏感性。只要促分裂刺激存在，Cyclin D便持续产生；而当Cyclin D失活或被降解时，细胞则更容易退出细胞周期，进入分化或静止。正因为Cyclin D位于这一枢纽位置，其异常升高、稳定性增强或上游信号持续活化，都可能缩短G1期，削弱细胞对外界调控的依赖。CDK4本身的异常也与肿瘤发生有关，某些突变甚至可见于黑色素瘤等肿瘤背景之中。
pRb：限制点的分子闸门
视网膜母细胞瘤蛋白pRb是G1/S转换中最经典的肿瘤抑制蛋白之一。它的基本功能是阻止细胞在尚未准备好的情况下进入S期。就机制而言，pRb主要通过抑制E2F家族中促进细胞周期推进的转录因子来发挥作用。只要pRb保持活性，E2F所控制的S期基因表达程序便无法充分启动，细胞也就难以越过限制点。
pRb的经典调控方式是磷酸化。传统上，人们常将其理解为Cyclin D-CDK4/6逐步推动pRb从低磷酸化走向高磷酸化，但更细致的研究显示，pRb至少可存在未磷酸化、单磷酸化和高磷酸化等不同功能状态。未磷酸化pRb与细胞周期退出、静止和衰老维持关系最为密切；在G1期，Cyclin D-CDK4/6首先促成pRb进入单磷酸化状态，使其对E2F的抑制开始松动；而当细胞越过限制点后，Cyclin E-CDK2进一步将pRb推向高磷酸化状态，这一事件具有明显的开关性和不可逆性，常被视为S期入口真正被打开的分子标志。
在有丝分裂结束后，pRb又可被蛋白磷酸酶去磷酸化，回到未磷酸化状态，从而在下一轮细胞周期开始时重新建立对G1/S入口的控制。也就是说，pRb既是限制点的“闸门”，也是每轮细胞周期结束后重新上锁的装置。
pRb抑制E2F的具体方式
pRb并不是仅靠“结合E2F”这一件事来抑制转录。对E2F靶启动子的抑制，至少包含几种不同层次的机制。
其一，pRb可直接结合激活型E2F的转录激活区域，阻断其驱动下游基因表达的能力。这样一来，即使E2F已经占据靶基因启动子，其激活功能仍会被封住。
其二，pRb可干扰转录起始复合体的装配。转录前起始复合体本应在启动子上按步骤组装，而pRb的存在会削弱相关组分形成有效复合体的能力，从而使E2F靶基因难以启动。
其三，pRb可招募改变染色质状态的因子，包括与组蛋白去乙酰化相关的抑制性机制。通过促使E2F调控区域形成更致密的染色质环境，pRb进一步降低转录因子接近这些启动子的机会。换言之，pRb并不只是在“堵住E2F”，还在“关闭启动子周围的可接近性”。
这些作用共同说明，pRb对G1/S转换的抑制并非单点刹车，而是一套同时作用于转录因子、起始复合体与染色质结构的多层压制系统。
E2F：从G1程序切换到S期程序的转录枢纽
E2F并非单一蛋白，而是一组转录因子家族。人类E2F家族包括E2F1、E2F2、E2F3A、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7和E2F8等成员。总体上，E2F1、E2F2和E2F3a多被视为激活型成员，E2F3b以及E2F4至E2F8则更多承担抑制型或限制性作用。它们在功能上并非绝对截然分开，但这种区分有助于理解G1/S转换中的基本分工。
E2F蛋白通常具有DNA结合域、与DP蛋白形成异源二聚体的结构域、转录激活区以及与pRb等口袋蛋白结合的区域。它们通过识别特定启动子序列，控制一批与细胞增殖密切相关的基因表达。E2F的靶基因并不局限于细胞周期蛋白本身，还包括CDKs、DNA复制起始蛋白、检查点调节因子、DNA修复因子等。因此，E2F被释放的后果并不是单个基因开启，而是整个S期准备程序被成套启动。
在G1/S转换中，E2F最重要的作用是把细胞从“以生长和评估为主的G1状态”切换到“以复制准备为主的S期前状态”。其中最关键的下游对象之一便是Cyclin E；此外，Cyclin A以及多种复制相关因子也受其调控。正因如此，pRb-E2F轴通常被视为限制点控制的核心分子开关。
Cyclin E-CDK2：将局部释放放大为S期承诺
Cyclin E家族主要包括Cyclin E1与Cyclin E2。与Cyclin D不同，Cyclin E的作用更直接地靠近S期入口。Cyclin E与CDK2结合形成Cyclin E-CDK2复合物，这一复合物是G1/S转换中最关键的执行模块之一。
CDK2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，其活性主要局限于G1-S阶段，并受Cyclin E或Cyclin A调节。若说CDK4/6负责将外界促分裂刺激导入细胞周期机器，那么CDK2则更像是将这一导入结果放大并真正落实为S期进入的酶学核心。
Cyclin E-CDK2的一个关键作用，是进一步磷酸化pRb，使pRb从前期较弱的抑制状态走向更彻底的失活状态。这样，原本只是“部分释放”的E2F，会被放大成“广泛释放”的E2F活性；而更多E2F又会促进更多Cyclin E表达，形成强有力的正反馈。正是这一回路，使G1/S转换呈现明显的全或无、开关式特点。
Cyclin E-CDK2的作用并不止于pRb。它还可磷酸化p27Kip1等CDK抑制蛋白，使其更容易被后续的泛素-蛋白酶体系统识别并降解，从而进一步解除对CDK2活性的抑制。此外，Cyclin E-CDK2还参与中心体周期调控，例如通过作用于nucleophosmin等底物促进中心体复制，为后续细胞分裂准备结构基础。这说明Cyclin E-CDK2不仅在“让细胞进入S期”，也在“让细胞为后续复制与分裂配套备料”。
SCF复合物：用蛋白降解来推动G1/S转换
G1/S转换不仅依赖激酶逐步加速，也依赖抑制蛋白被及时清除。SCF复合物就是这一过程中的关键蛋白降解机器。SCF是一个多蛋白E3泛素连接酶复合物，其名称来自Skp、Cullin和F-box蛋白。它负责把特定底物打上泛素标签，使其进入26S蛋白酶体降解。
SCF的核心组成包括Skp1、Cullin 1、Rbx1以及一个可变的F-box蛋白。Skp1主要起桥接作用，Cullin 1构成支架，Rbx1与E2泛素结合酶相连，而F-box蛋白则决定底物特异性。也就是说，SCF复合物的“通用骨架”相对固定，但它“抓谁去降解”则取决于所配备的F-box蛋白。
SCF系统在细胞周期中的一个重要原则是：复合物总体水平相对稳定，而底物的识别则常依赖于底物先被磷酸化等修饰。换言之，激酶活化与泛素化降解并不是两套分离机制，而是前后衔接、彼此嵌套的同一推进链条。正因为如此，SCF被看作G1/S转换的关键放行装置之一。
从发现史看，SCF复合物的重要性最早在芽殖酵母中被揭示：某些细胞分裂周期突变体会停滞在G1期，无法降解S期Cyclin-CDK抑制因子Sic1，从而不能进入DNA复制阶段。这一发现后来被视为“蛋白水解对G1/S转换至关重要”的经典证据。
Skp2：把p27与p21移走的底物识别亚基
Skp2是SCFSkp2复合物中的F-box蛋白，也是G1/S转换中的重要促增殖因子。它的核心作用，在于招募并识别若干细胞周期抑制分子，尤其是p27Kip1和p21，使这些抑制因子被泛素化并送往蛋白酶体降解。
p27Kip1是限制Cyclin E-CDK2活性的关键CDK抑制蛋白之一，也能在一定程度上抑制Cyclin D-CDK4复合物。当Skp2上升时，SCFSkp2对p27的识别和降解增强，原本压在CDK2上的“刹车”便被拆除。Skp2与p21、p27之间因此形成双负反馈关系：抑制因子压制G1/S转换，而Skp2则通过清除这些抑制因子促进转换发生。
在生理情况下，Skp2水平随着细胞周期推进而变化；当细胞进入G0或静止状态时，Skp2下降，p27上升，这有助于维持退出周期的状态。相反，在G1/S转换前后，Skp2升高可帮助细胞摆脱CKI约束。由于这一作用直接触及细胞周期的阈值控制，Skp2常被视为具有原癌基因意义，其升高与多种肿瘤及耐药现象相关。
正反馈如何形成“开关式”转换
Rb-E2F通路之所以能把连续变化的上游信号变成陡峭而明确的S期进入事件，关键在于其内部存在多重正反馈。
第一重反馈来自Cyclin D-CDK4/6对pRb的初始磷酸化。这一步只是让E2F开始被释放，但一旦E2F稍有活化，它便可促进Cyclin E等S期准备因子的表达。
第二重反馈来自Cyclin E-CDK2。它进一步强化pRb失活，释放更多E2F，而更多E2F又会促进更多Cyclin E表达。这使得系统一旦越过某个阈值，便会快速跳转到高E2F、高Cyclin E-CDK2活性的状态。
第三重反馈来自Skp2。E2F可促进Skp2相关程序，而Skp2又通过降解p27和p21削弱对CDK2的抑制，使Cyclin E-CDK2活性更高，进而进一步推动pRb失活和E2F释放。
这三层反馈叠加后，G1/S转换不再是线性渐进过程，而表现为明显的双稳态与开关样行为。也就是说，细胞并不是缓慢地“一点点进入S期”，而是在积累到某个阈值后迅速完成从G1程序到S期程序的整体切换。
ATM-p53轴：DNA损伤条件下的制动系统
G1/S转换并不是单向踩油门的系统。若细胞在进入S期之前检测到DNA损伤，则必须及时制动，否则错误将被带入复制阶段并放大。ATM和p53正是这一制动系统中的关键节点。
ATM是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可由DNA双链断裂、氧化应激以及若干其他核内异常信号激活。ATM被募集到损伤位点后，会磷酸化多种检查点与修复相关蛋白，包括NBS1、CHK2、p53等，从而把局部损伤信号放大为全细胞性的检查点响应。就功能而言，ATM不是单纯的“损伤传感器”，而是损伤信号的中央转发器。
ATM介导的DNA损伤应答可分为较快和较慢两个层面。较快的一层通过CHK2等效应蛋白建立早期停滞；若损伤不能迅速修复，ATM还会进一步稳定并激活p53。p53是脊椎动物中最关键的抑癌因子之一，常被称为“基因组守护者”。它通过调节基因表达，协调DNA修复、细胞周期停滞、凋亡以及衰老等多种程序，以防基因组不稳定性被积累和传递。
在G1/S检查点上，p53最重要的效应器之一是p21。p21可结合并抑制多种Cyclin-CDK复合物，包括CDK2、CDK4与CDK6，从而阻断G1/S转换，为DNA修复争取时间。若损伤过重、无法修复，则p53还可推动细胞进入凋亡或衰老。由此可见，ATM-p53-p21轴构成了Rb-E2F推进系统的主要反向约束力量：前者负责判断“现在是否应该停下来”，后者负责在条件适宜时推动“现在可以过去了”。
肿瘤意义
Rb-E2F通路及其相连的Cyclin D、Cyclin E、CDK4、CDK2、SCF-Skp2和ATM-p53模块，几乎覆盖了G1/S转换的主要控制层面，因此它们也是肿瘤发生中最常见的异常节点之一。
当Cyclin D或Cyclin E过度表达时，G1期可被缩短，细胞对血清或生长因子的依赖下降；当CDK4异常活化时，pRb失活会被过早推进；当pRb缺失或功能受损时，E2F介导的S期程序失去有效压制；当Skp2升高时，p27与p21等抑制蛋白被过度清除，系统更容易越过限制点；而当ATM或p53受损时，DNA损伤条件下本应建立的G1/S停滞将难以维持，使带有损伤的细胞继续复制DNA。TP53本身也是人类癌症中最常见的突变抑癌基因之一，这恰好说明G1/S检查点对于基因组稳定性的保护意义。