生物技术
DNA/RNA
Blot
- 众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
- 核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
- 硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸 比较脆；后者靠共价键结合核酸 比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）
PCR（及其衍生操作）
- T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性 高浓度下表现聚合酶活性 应用于3'末端标记 同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
- 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记 现在多用于测序
- 引物设计原则（老生常谈系列）
- 长度18－30
- 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
- 碱基最好随机分布 同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
- Tm在55－80
- 3'端最好以G/C结尾 两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
- 5'端可以灵活修饰 影响没有那么大
- 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
- 甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键 进而打开二级结构 提高产量
- RT－PCR的ct法要看本底基因 本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照 用于排除RNA提取效率 反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差
一些奇怪的PCR
巢式PCR
两对引物 第一轮扩增后要对产物进行稀释 避免外引物产生干扰 可以极大提高反应的特异性
5'/3'RACE
适用于RNA一端已知一端未知
先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴 然后利用已知片段和尾巴进行PCR
用两对引物增强特异性
提取
测序
- sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳 琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
- 一代末端终止 二代边合成边测序 三代单分子合成测序
- 准确率上1＞2＞3
- 读长3＞1＞2
- 效率3＞2＞1
- 现在最常用的是二代
- 某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA
检测
- 280吸光
蛋白质
Blot
- 如果是免疫法的话直接考马斯亮蓝染胶 不用blot转膜
测序
提取
检测
- 260吸光
- ELISA
- 直接法：抗原吸附在固相载体上 仅使用酶标一抗 优点是方便快速 交叉反应性低；缺点是成本高 信号不够强 灵敏度差
- 间接法：抗原吸附在固相载体上 加入含有待测一抗的样本 洗板后加酶标二抗 用来检测抗体 优点是高灵敏度和高灵活度；缺点是有非特异性结合的风险 比直接法麻烦
- 夹心法：抗体吸附在板上 加待测样本 加检测抗体 形成抗体－抗原－抗体的三明治结构 洗板 加酶标二抗 洗板 加显色底物
- 分为直接和间接法 直接法不用加酶标二抗
- 优点是灵敏度高特异性高 适用于复杂样本；缺点是对抗体要求高
- 竞争法：分参考臂和检测臂 把抗原包被在孔板上 加待测样本（含有未知浓度的游离抗原）和固定量的酶标抗体 抗原浓度高则信号弱 抗原浓度低则信号强
- 考马斯 R250更灵敏 比G250多两个甲基 G250更常用 定量用G250
- 凯氏定氮法 一堆奇妙的试剂得到氨然后滴定 结果×8 三氯氰胺.jpg