生物技术

DNA/RNA

一些电泳相关

• 众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
• 核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
• 硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸 比较脆；后者靠共价键结合核酸 比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）

PCR（及其衍生操作）

• T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性 高浓度下表现聚合酶活性 应用于3'末端标记 同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
  • 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记 现在多用于测序

• 引物设计原则（老生常谈系列）
  • 长度18－30
  • 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
  • 碱基最好随机分布 同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
  • Tm在55－80
  • 3'端最好以G/C结尾 两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
  • 5'端可以灵活修饰 影响没有那么大
  • 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
• 甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键 进而打开二级结构 提高产量
• RT－PCR的ct法要看本底基因 本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照 用于排除RNA提取效率 反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差

一些奇怪的PCR

巢式PCR

两对引物 第一轮扩增后要对产物进行稀释 避免外引物产生干扰 可以极大提高反应的特异性

5'/3'RACE

适用于RNA一端已知一端未知

先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴 然后利用已知片段和尾巴进行PCR

用两对引物增强特异性

测序

• sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳 琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
• 一代末端终止 二代边合成边测序 三代单分子合成测序
  • 准确率上1＞2＞3
  • 读长3＞1＞2
  • 效率3＞2＞1
  • 现在最常用的是二代
• 某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA

检测

• 280吸光

蛋白质（氨基酸）

一些电泳相关

• 如果是免疫法的话直接考马斯亮蓝染胶 不用blot转膜
• PAGE胶的制备：化学催化剂AP由TEMED催化产生硫酸自由基 激活Acr（丙烯酰胺）形成长链 由Bis（甲叉双丙烯酰胺）交联形成凝胶；光催化剂核黄素在TEMED和光照条件下还原再被氧化形成自由基进而聚合
  • 化学聚合的启动需要TEMED推动 光聚合不需要（光聚合法中没有TEMED也能凝固 不过会比较慢）
  • 光催化一开始需要氧气 聚合过程中氧气必须隔绝 因为氧分子会阻止碳链的延长和聚合
  • Acr和Bis有神经毒性 凝固后毒性基本没有但仍然不建议食用（啊喂）
• 使用SDS时加热可以使其结合更加充分 可以使蛋白质转变成线性棒状结构

测序

• Sanger法：2'4'二硝基氟苯和蛋白质α－氨基反应然后用酸水解（一般肽链会被完全水解）得到DNP－氨基酸 黄色 也可以和别的氨基反应 不一定测出的是N端蛋白质 反应条件弱碱性
• Edman法：PITC在碱性条件下和α－氨基反应得到PTC－肽链 在无水强酸中被切割下来得到PTH－氨基酸和新的肽链 可以自动化 有读长限制 反应条件弱碱性

检测（和一些特异反应）

• 260吸光
• ELISA
  • 直接法：抗原吸附在固相载体上 仅使用酶标一抗 优点是方便快速 交叉反应性低；缺点是成本高 信号不够强 灵敏度差
  • 间接法：抗原吸附在固相载体上 加入含有待测一抗的样本 洗板后加酶标二抗 用来检测抗体 优点是高灵敏度和高灵活度；缺点是有非特异性结合的风险 比直接法麻烦
  • 夹心法：抗体吸附在板上 加待测样本 加检测抗体 形成抗体－抗原－抗体的三明治结构 洗板 加酶标二抗 洗板 加显色底物
    • 分为直接和间接法 直接法不用加酶标二抗
    • 优点是灵敏度高特异性高 适用于复杂样本；缺点是对抗体要求高
  • 竞争法：分参考臂和检测臂 把抗原包被在孔板上 加待测样本（含有未知浓度的游离抗原）和固定量的酶标抗体 抗原浓度高则信号弱 抗原浓度低则信号强
• 考马斯 R250更灵敏 比G250多两个甲基 G250更常用 定量用G250 抗干扰性好 灵敏度高 会被去垢剂干扰 受蛋白质种类影响大
• 凯氏定氮法 一堆奇妙的试剂得到氨然后滴定 结果×8 三氯氰胺.jpg
• 双缩脲：肽键在碱性环境下和Cu^2＋离子结合形成紫色络合物 可以定量检测 灵敏度较低
• BCA：在碱性环境下肽键把Cu^2＋还原成Cu^＋ Cu^＋再和BCA反应生成紫色络合物 562nm最大吸光 复合物稳定 灵敏度高 会被强还原剂干扰 受蛋白质种类影响大
  • 我知道这很怪 但是 这个反应实际上是肽键旁边的α－碳院子发生一次去质子化－电子转移－得到质子的过程 其结果可以看作生成了一个烯醇式结构作为中间过渡态 真正的电子供体是α－碳上那个氢原子
• lowry：双缩脲plus版 先双缩脲再加folin－酚 产生深蓝色物质 比双缩脲灵敏但繁琐耗时长 易被干扰
• 荧光法：不常考 顾名思义用荧光染料染 灵敏度/特异性高 成本高 需要标准曲线
• 茚三酮：和α－氨基反应 蛋白质的游离氨基不支持产生明显实验结果 用来检测氨基酸 其他氨基酸为紫色 脯氨酸为黄色
• ellman反应：（别和edman搞混）二硝基苯甲酸 弱碱条件下和巯基反应 产物412nm有吸光 拿来判断游离巯基含量
• 黄色反应：芳香族和浓硝酸反应变黄 再加浓碱液变橙黄
• 坂口反应：精氨酸特异性反应 α－萘酚和次氯酸钠反应产生红色产物