生物技术

DNA/RNA

提取

DNA

酚－氯仿抽提

SDS和蛋白酶K裂解细胞并降解蛋白质 加入苯酚/氯仿/异戊醇混合物后离心 分为三层

上层（水相）：DNA＆RNA

中层（白色的一坨）：变性的蛋白质

下层（有机相）：细胞碎片＆脂质

将水相转移并加入乙醇/异丙醇 DNA会形成白色絮状沉淀

酚用于变形并抽提DNA白纸 氯仿增强去蛋白效果并抽提氯仿 同时促进相分离

注：这个方法里涉及到异戊醇和异丙醇两个长得挺像的东西 前者用作消泡剂 后者用来沉淀DNA

柱层析法

高盐条件下裂解细胞并上柱 DNA带负点的磷酸骨架会通过盐桥（也有说疏水作用？）吸附在硅胶膜上 用乙醇缓冲液洗去杂质 再用TE缓冲液/水洗脱 得到DNA

碱裂解法

试剂一：Tris－HCl和葡萄糖（也可以是水 有时会有EDTA和RNaseI）重悬菌体

试剂二：NaOH和SDS 用来裂解细胞 变性 不能剧烈震荡 会把基因组DNA打碎 导致后续质粒混入基因组DNA

试剂三：KAc＆HAc 缓冲液 使碱性环境变为中性 质粒复性 而较为复杂的基因组DNA来不及复性 形成白色絮状沉淀

不过试剂一里不用特意加RNase 毕竟这玩意哪都有

转染的话我们要超螺旋的质粒

RNA

TRIzol法

TRIzol试剂含有异硫氰酸胍和苯酚 异硫氰酸胍是变性剂 灭活RNase 苯酚溶解蛋白质 加入氯仿后分层

上层（水相）：RNA

中层（也是白的一坨）：DNA 蛋白质

下层（有机相）：蛋白质 脂质

提取水相加入乙醇/异丙醇 沉淀RNA

和酚－氯仿的区别在于环境pH 酚－氯仿为中性环境 此时DNA结构稳定且可溶 倾向于留在水相里；而TRIzol法环境为较强的酸性 DNA亲水性下降并发生酸变性 碱基暴露 疏水性增强（一个小小的知识点：嘌呤碱对酸更敏感）

柱层析法

和DNA柱层析法类似 裂解液里会加入异硫氰酸胍或DEPC抑制RNase的活性 通常还会在柱上加上DNase

PCR（及其衍生操作）

• T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性 高浓度下表现聚合酶活性 应用于3'末端标记 同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
  • 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记 现在多用于测序

• 引物设计原则（老生常谈系列）
  • 长度18－30
  • 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
  • 碱基最好随机分布 同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
  • Tm在55－80
  • 3'端最好以G/C结尾 两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
  • 5'端可以灵活修饰 影响没有那么大
  • 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
• 甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键 进而打开二级结构 提高产量
• RT－PCR的ct法要看本底基因 本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照 用于排除RNA提取效率 反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差

一些奇怪的PCR

巢式PCR

两对引物 第一轮扩增后要对产物进行稀释 避免外引物产生干扰 可以极大提高反应的特异性

5'/3'RACE

适用于RNA一端已知一端未知

先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴 然后利用已知片段和尾巴进行PCR

用两对引物增强特异性

甲基化特异性PCR（MSP）

亚硫酸盐处理时非甲基化的C会脱氨转化为尿嘧啶 对此设计两组引物 一种是T 一种是C（用于确保亚硫酸盐处理完全） 引物要覆盖GpC

测序

• sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳 琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
• 一代末端终止 二代边合成边测序 三代单分子合成测序
  • 准确率上1＞2＞3
  • 读长3＞1＞2
  • 效率3＞2＞1
  • 现在最常用的是二代
• 某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA

一些重组

• 枯草芽孢杆菌不致病…
• Gateway：利用位点特异性重组 模仿λ噬菌体整合进大肠杆菌基因组的机制 优点是高度模块化和通用性 效率接近100％；缺点是初始构建入门克隆需要时间且无法做到无缝克隆 基因两侧会留下疤痕 是专利系统 贵
• GoldenGate（看到我去吃麦麦）：大名鼎鼎的II S型限制性内切酶 见下文 优点是高效且酶切连接在同一个管子里反应 可以做到无缝 一般合成生物学用这个；缺点是引物设计比较烦
• Gibson Assembly：原理是同源序列重组 让相邻DNA片段末端拥有20－40bp的同源重组末端 在管子里同时有5'核酸外切酶（暴露出3'末端 形成重叠）DNA聚合酶（利用重叠区作为模板 填补外切酶产生的缺口）DNA连接酶 优点是简单快捷且组装效率很高；缺点是引物成本较高 片段多的时候效率会低
• In－Fushion：类似Gibson的前身 原理同样是同源序列重组 使用In－Fushion酶（一种专有的DNA聚合酶 有5'→3'外切酶活性和链置换酶活性）形成开环分子 再转入大肠杆菌中由细胞内修复系统完成缺口填补和连接 优点是简单快速 对线性化载体和PCR片段的组装非常高效；缺点是这玩意同样是有专利的 贵

一些电泳相关

• 众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
• 核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
• 硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸 比较脆；后者靠共价键结合核酸 比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）

检测

• 280吸光
• 福尔根反应 特异性染DNA

基因编辑！

• ZFN：利用锌指蛋白识别碱基 一个模块可以特定识别三个碱基 利用多个模块的串联来识别一段较长的特异性序列；利用FokI作为内切酶 二聚体有活性（所以需要设计一对ZFN 且结合位点有一定距离 让两个单体能相遇并形成有活性的剪刀）
• TALEN：定位系统是TALE蛋白序列（来自植物病原菌） 一个模块识别一个碱基 同样使用FokI作为剪刀
• CRISPR－Cas（全体起立！）：用RNA定位 分子剪刀是Cas蛋白 向导RNA和Cas蛋白形成复合物 通过碱基互补配对找到目标位点（旁边还要有NGG） 由Cas9执行切割（结构域HNH切割和sgRNA互补配对的链 RuvC切割非互补链）
  • Cas酶分为六型，分为两个class，class1切割多亚基，2切割单亚基，class2（2、5、6）更常用，Cas9属于二型。
    • 一型：Cas3，切割双链，一般用于大片段删除。
    • 三型：切割单链。
    • 四型：目前唯一没有找到完整组分的系统。
    • 五型：只有一个RuvC活性但切双链，产生粘性末端。
    • 六型：Cas13，不用transRNA，特异性切割RNA且激活后非特异性降解周围RNA。

一些奇奇怪怪……

• 四种限制性内切酶
  • I型：切割位点和识别位点不同 切割位点不确定 需要ATP SAM和镁离子
  • II型：识别回文序列 切割位点和识别位点一致（除了II S型）不依赖ATP 只要镁离子就行
  • II S型：GoldenGate里会用到 在识别位点的下游 切割位点确定
  • III型：大致和I型相同
  • IV型：切割位点仅限甲基化和羟甲基化的C 切割位点和识别位点相同 多用于表观遗传的检测
  • 在高盐 甘油 DMSO Mn^2＋ 酶量过多的情况下限制酶会出现星活性开始乱切
• 染色体构象捕获
  • 先用甲醛处理细胞让DNA片段交联 再将DNA切割成片段 接着进行连接反应（原本三维空间中靠的很近的DNA有更高的概率被连接在一起 形成嵌合DNA分子） 解除交联 纯化DNA 接着测序
  • 3C：通过特异性引物PCR来验证一对特定的基因座之间是否存在交互 单点对单点
  • 4C：在3C的基础上将连接产物环化 针对一个特定位点的引物去扩增所有和它交互的偏酸 单点对多点
  • 5C：针对一个感兴趣的大区域设计大量覆盖该区域的引物 对3C文库进行多重PCR 多点对多点
  • Hi－C：连接前对DNA片段进行末端标记 富集并坚定所有连接产物
• 基因工程/分子里的洋文序列
  • SD序列：原核生物特有 为核糖体定位起始密码子提供条件 真核生物起类似作用的是帽子
  • Kozak序列：真核生物翻译起始处环绕起始密码子的序列 优化翻译其实效率
  • Pribow序列：原核 转录起始时RNAP结合的区域
  • Goldberg－Hogness序列：其实就是TATAbox…这玩意儿应该不咋会考
• 一些启动子：
  • SV40：哺乳 强启动子
  • CaMV：花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子 常用于植物 强启动子
  • U6：由RNAP III转录 由RNAP III转录的启动子特点一般就是表达量中等且稳定
  • H1：也是由RNAP III转录 稳定且表达量不高 常常用于shRNA来表达KD基因（注意不是KO 无法完全抑制基因表达）

蛋白质（氨基酸）

一些电泳相关

• 如果是免疫法的话直接考马斯亮蓝染胶 不用blot转膜
• PAGE胶的制备：化学催化剂AP由TEMED催化产生硫酸自由基 激活Acr（丙烯酰胺）形成长链 由Bis（甲叉双丙烯酰胺）交联形成凝胶；光催化剂核黄素在TEMED和光照条件下还原再被氧化形成自由基进而聚合
  • 化学聚合的启动需要TEMED推动 光聚合不需要（光聚合法中没有TEMED也能凝固 不过会比较慢）
  • 光催化一开始需要氧气 聚合过程中氧气必须隔绝 因为氧分子会阻止碳链的延长和聚合
  • Acr和Bis有神经毒性 凝固后毒性基本没有但仍然不建议食用（啊喂）
• 使用SDS时加热可以使其结合更加充分 可以使蛋白质转变成线性棒状结构
• PG－PAGE：梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 越往下孔径越小
• 火箭电泳（单向径向免疫扩散电泳）：在制胶的时候加入一定浓度梯度的抗体 胶凝固后打孔 在孔里加入抗原沉淀 抗原抗体只有在恰当的浓度下才能形成沉淀 抗原过多或抗体过多都比较可溶 所以只有前段有沉淀线
  • 可以用于检测特定抗原的含量 抗原浓度越高 沉淀峰也越高

一些层析相关

• 离子交换
• 疏水
• 凝胶过滤/尺寸排阻
• 亲和
• 薄层
  • 根据原理不同可以分为吸附层析 分配层析 离子交换层析
  • 吸附：固定相为吸附剂 根据组分与吸附剂表面活性微店吸附能力强弱来分离 一般极性越强的组分吸附作用越强 Rf值越大 如植物色素的分离就是用的吸附层析
  • 分配：固定相为液态！由于我们不能让一层水在玻璃板/塑料薄板上稳定存在 一般我们会把液体负载在一个固体支撑物上（比如硅胶板/氧化铝板）其表面覆盖着一层液体膜 为试剂的固相 分离原理是组分在流动性和固定相间溶解度不同 我们跑的氨基酸薄膜层析就是这种
  • 离子交换：顾名思义 参考柱层析里的离子交换

结构检测

一级

• Sanger法：2'4'二硝基氟苯和蛋白质α－氨基反应然后用酸水解（一般肽链会被完全水解）得到DNP－氨基酸 黄色 也可以和别的氨基反应 不一定测出的是N端蛋白质 反应条件弱碱性
• Edman法：PITC在碱性条件下和α－氨基反应得到PTC－肽链 在无水强酸中被切割下来得到PTH－氨基酸和新的肽链 可以自动化 有读长限制 反应条件弱碱性
• 矩阵也用 PAM和BLOSUM 相对而言BLOSUM更有生理意义一点

二级

• Chou－Fasman GOR PHD NNSSP（一串神秘字母）

三级

• X晶体衍射：优点是分辨率极高 对分子量无限制 缺点是有些蛋白没法结晶 且结晶中的结构是静态的 无法反应动态变化 结构也可能扭曲
• 核磁共振：可以研究生物大分子的动态过程 也能用来研究膜蛋白 缺点是有分子量限制 特别大的蛋白用不了 且分辨率一般较低
• 冷冻电镜：分单颗粒和电子断层成像
  • 低温电镜单颗粒分析：对包被在冰膜中的相同的 分散的 随机取向的大量颗粒性样品拍照
  • 电子断层成像：对样品中同一物体在不同倾角下连续拍照
• 对于预测：如果同源性＞50％则直接同源建模法（SATSS－MODEL）如果＜30％且有已知结构的同源蛋白质模板则用穿线法 如果没有就从头分析（Rosetta de novo）_{（不过现在一般扔给AlphaFold2）}

检测（和一些特异反应）

• 260吸光
• ELISA
  • 直接法：抗原吸附在固相载体上 仅使用酶标一抗 优点是方便快速 交叉反应性低；缺点是成本高 信号不够强 灵敏度差
  • 间接法：抗原吸附在固相载体上 加入含有待测一抗的样本 洗板后加酶标二抗 用来检测抗体 优点是高灵敏度和高灵活度；缺点是有非特异性结合的风险 比直接法麻烦
  • 夹心法：抗体吸附在板上 加待测样本 加检测抗体 形成抗体－抗原－抗体的三明治结构 洗板 加酶标二抗 洗板 加显色底物
    • 分为直接和间接法 直接法不用加酶标二抗
    • 优点是灵敏度高特异性高 适用于复杂样本；缺点是对抗体要求高
  • 竞争法：分参考臂和检测臂 把抗原包被在孔板上 加待测样本（含有未知浓度的游离抗原）和固定量的酶标抗体 抗原浓度高则信号弱 抗原浓度低则信号强
• 考马斯 R250更灵敏 比G250多两个甲基 G250更常用 定量用G250 抗干扰性好 灵敏度高 会被去垢剂干扰 受蛋白质种类影响大
• 凯氏定氮法 一堆奇妙的试剂得到氨然后滴定 结果×8 三氯氰胺.jpg
• 双缩脲：肽键在碱性环境下和Cu^2＋离子结合形成紫色络合物 可以定量检测 灵敏度较低
  • 氢氧化钠先加入再加入硫酸铜 制造碱性环境 可以分液长期保存 常温反应
  • 注意和斐林区分 斐林的氢氧化钠和硫酸铜先混合 生成氢氧化铜 因此要现用现配 反应要加热
• BCA：在碱性环境下肽键把Cu^2＋还原成Cu^＋ Cu^＋再和BCA反应生成紫色络合物 562nm最大吸光 复合物稳定 灵敏度高 会被强还原剂干扰 受蛋白质种类影响大
  • 我知道这很怪 但是 这个反应实际上是肽键旁边的α－碳院子发生一次去质子化－电子转移－得到质子的过程 其结果可以看作生成了一个烯醇式结构作为中间过渡态 真正的电子供体是α－碳上那个氢原子
• lowry：双缩脲plus版 先双缩脲再加folin－酚 产生深蓝色物质 比双缩脲灵敏但繁琐耗时长 易被干扰
• 荧光法：不常考 顾名思义用荧光染料染 灵敏度/特异性高 成本高 需要标准曲线
• 茚三酮：和α－氨基反应 蛋白质的游离氨基不支持产生明显实验结果 用来检测氨基酸 其他氨基酸为紫色 脯氨酸为黄色
• ellman反应：（别和edman搞混）二硝基苯甲酸 弱碱条件下和巯基反应 产物412nm有吸光 拿来判断游离巯基含量
• 黄色反应：芳香族和浓硝酸反应变黄 再加浓碱液变橙黄
• 坂口反应：精氨酸特异性反应 α－萘酚和次氯酸钠反应产生红色产物
• 纳氏试剂法：一坨奇妙的试剂，pH＞11，最后得到的产物吸光与氮含量成正比。灵敏度高，简便快速，显色稳定，重复度很好，氮线性范围窄，试剂剧毒。

互作检测

• 酵母双杂交 BD结合DNA 一般诱饵蛋白和BD融合；AD和猎物蛋白融合
• FRET：用来检测直接互作 难以显示瞬时互作 假阴性率更高
• BiFC：两个蛋白上带一个荧光分子的N端和C端 可以显示瞬时互作 时间轴上所有的互作都会显示 假阳性率更高 也是显示直接互作的
• 免疫共沉淀：体内实验 相对酵母双杂交更自然一点
• GST－pulldown：体外实验 但可以说明直接互作
• SRP：一个很物理的东西 具体是先把一种蛋白偶练在金膜传感芯片上 再加入另一种分子 如果互作那么通过各种光学元件后会有参数改变 可以计算解离常数 无需标记蛋白质 可以较大程度地还原生物内的环境（不止蛋白质 其他大分子的互作也可以）
• EMSA（不知道扔哪我就扔这里了）老生常谈系列 可以在反应中加入特异性抗体 电泳迁移率更慢 称为超迁移 用来进一步检验 确保蛋白质没有加错

样品处理

• 组织匀浆器更适合软材料
• 研钵适合硬材料 但软的材料也能用 加个液氮
• 自溶法适用于肝脏这种富含酶的组织
• 甲醛固定的可以很大程度地保留蛋白质的抗原表位 所以依赖免疫原理的荧光组织固定常用甲醛

染色

染料

• 酸碱染料指染料本身成酸性/碱性或它带负电/正电 缓冲液的pH可以起到一定作用 比如改变物质的解离状态
  • 常见碱性染料：苏木精 杨红 番红 结晶紫 硫堇 甲苯胺蓝 甲基绿 美蓝 孔雀铜绿 焦油紫
  • 常见酸性染料：曙红 亮绿 橘黄G 酸性品红 苦味酸 水溶性苯胺蓝

细胞

分选

• 流式：前向散射角（FSC）反映细胞大小 侧向散射角（SSC）反映细胞颗粒度/复杂程度
• 关于密度梯度离心（速率区带）＆平衡密度梯度离心（等密度区带）
  • 原理：沉降速度＆浮力密度
  • 介质：甘油/蔗糖＆CsCl
  • 需预制梯度＆可自成梯度
  • 依赖于时间＆不依赖时间

一些特异反应不好往前面放的

• 联苯胺：检测过氧化氢酶 过氧化氢酶催化过氧化氢分解成水和氧气 氧气氧化联苯胺生成联苯胺蓝 强氧化性试剂会导致假阳性
• 中性红：活细胞只有液泡染上；刚死的细胞全部染色；死了很久的细胞全部染不上