调控RNA
总论
- 调控RNA（Regulatory RNA）控制RNA的翻译，也有其它功能。
细菌的sRNA
sRNA的功能
- sRNA既可与其它RNA互补（称为反义RNA（Antisense RNA）），也可与蛋白质结合，发挥功能。
- 古菌、真核生物也有反义RNA。
- sRNA本身可监测温度、某种物质浓度等环境因子。
- 根据反义RNA与其影响的RNA是否完全配对，将反义RNA分为顺式（Cis-encoded）和反式（Trans-encoded）两种。
- 编码顺式反义RNA的基因出现在细菌染色体、质粒、噬菌体、转位子中。
- 它控制质粒的复制、接合。
- 它决定噬菌体是否将宿主裂解。
- 它控制转位子转位的频率。
- 它控制（通常是有毒的）蛋白合成。
- 顺式反义RNA的工作机制：（图1）
- 与mRNA结合，阻止核糖体翻译mRNA。
- 促进mRNA降解，通常由RNase III水解。
- 与mRNA结合，掩盖切割位点，防止mRNA被水解。
- 转录弱化（Transcription Attenuation），只出现在革兰氏阳性细菌。
- 转录干扰（Transcriptional Interference）。
- “伪结”干扰（Pseudoknot Formation Interference）。
- 启动子干扰。
- 反式反义RNA在数量、功能、工作机制上都较丰富。
- 有些反式反义RNA同时是mRNA。
- 很多反式反义RNA需要Hfq蛋白（一种分子伴侣）的帮助才能和RNA结合。
- 反式反义RNA的工作机制：（图2）
- 抑制、促进翻译。
- 促进mRNA降解。
- 抑制翻译，同时促进mRNA降解。
- 稳定mRNA。
- 促进mRNA的后加工。
- RNA陷阱（RNA Trapping）。
- 古菌、真核生物也有“反义RNA”，但功能仅限于与mRNA互补，物理干扰mRNA翻译。
转录弱化
- mRNA存在两种可能二级结构，其中一种有转录终止柄环（Transcriptional Terminator Stem-loop）结构。
- 未完成转录的mRNA与反义RNA结合时，形成有转录终止环的二级结构。
- 转录终止环使mRNA转录提前终止，称为转录弱化现象。
转录干扰
- 转录干扰现象至今只观察到一例。
- 某细菌染色体有ubiGmccBA基因，其下游有一个反义RNA的启动子。
- 从该启动子可转录出四种反义RNA。
- 细胞中甲硫氨酸较高时，转录出的反义RNA最短，不干扰ubiGmccBA的转录。
- 细胞中甲硫氨酸越低，转录出的反义RNA越长，通过积累正超螺旋抑制ubiGmccBA的转录，称为转录干扰现象。
“伪结”干扰
- 翻译某个mRNA需要它有个“伪结”结构。
- 必须先合成repY，再合成repZ，由repZ干扰mRNA的一个柄环结构，才能形成伪结结构。
- 反义RNA既抑制repY的翻译，也抑制伪结结构的形成，称为伪结干扰现象。
启动子干扰
- 某些质粒复制时需复制原点有一个启动子RNAII。
- 对应的反义RNA（RNAI）与RNAII结合，阻止质粒复制，称为启动子干扰现象。
RNA陷阱
- ChiX是某细菌中的一种反式反义RNA。
- 一般情况下，ChiX抑制chiP（一种mRNA）的翻译并促进它降解。（但ChiX本身不被降解）
- 细菌细胞内出现某种物质时，细胞转录一种陷阱mRNA，与ChiX结合，二者同时被降解。
- ChiX被降解后，chiP得以翻译。
与蛋白质结合的sRNA
6S RNA
- 细菌在营养不足时，产生6S RNA。
- 6S RNA与σ70转录因子结合，抑制相关基因转录。
- 细菌同时产生σS转录因子，6S RNA帮助细菌过渡到新转录因子。
CsrB
- CsrA是一种蛋白质，通过翻译调控促进糖酵解，抑制糖异生。
- CsrB是一种sRNA，通过与CsrA结合，抑制CsrA的功能。
监测环境因子的sRNA（图3、4）
- 核开关（Riboswitch）能监测细胞中的环境因子。
- 核开关有时是mRNA的一部分。
- 温度或与某物质非共价结合能使核开关的二级结构改变。
- 二级结构的改变既可调控转录也可调控翻译。
细菌和古菌的CRISPR
- 大部分细菌和古菌的基因组中有结构如图5所示的CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）结构。
- 每个基因组中可以有不止一个CRISPR结构。
- CRISPR是原核生物的免疫系统。
- CRISPR由高度保守的Repeat序列和高度自由的Spacer序列交替构成。
- Repeat和Spacer的长度都约为30 bp。
- CRISPR的一端有Leader序列，长约500 bp，富含A-T。
- 在Leader序列方向有若干编码蛋白质的基因，这些蛋白质与CRISPR功能有关。
- 上述基因中最保守的是cas1和cas2。
- 细菌被噬菌体或质粒感染时，感染者DNA的一部分（靠近一种叫PAM的序列）被写入靠近Leader序列的一端。
- CRISPR结构的转录启动子在Leader序列内。
- 整个CRISPR结构被转录为一个RNA，称为pre-crRNA。
- pre-crRNA被切割为若干crRNA。
- 每个crRNA的5'端为8个Repeat序列的碱基，中间为一个Spacer序列，3'端为下一个Repeat序列剪去8个碱基。
- crRNA随后与一个蛋白质复合体结合，识别外来核酸。如配对正确，则蛋白质复合体将外来核酸在配对处切开。
- CRISPR系统中的Cas9蛋白可用于一切生物的基因组编辑。
真核生物的RNA干扰（RNA Interference，RNAi）
- 真核生物的部分非编码RNA通过RNA干扰机制调控基因表达。（图9）
- 若上述RNA与mRNA结合紧密，则mRNA被立刻水解。
- “结合紧密”的关键是RNA的第9~11个核苷酸。
- 若上述RNA与mRNA结合不紧密，则mRNA先被抑制翻译，然后被水解。
- 若上述RNA与正在转录的RNA结合，则引起DNA构象改变，抑制其转录。
- 上述RNA有三类：siRNA、miRNA、piRNA，长度均约为20 nt，统称为小RNA（Small RNA，注意不是sRNA）。（piRNA略长）
miRNA
- miRNA参与细胞自身基因表达调控。
- miRNA由pri-miRNA经两次剪切产生。
- 绝大部分pri-miRNA源于基因的内含子或外显子，由RNA聚合酶II转录，此时pri-miRNA是mRNA。
- 基因组中5'端有Alu元素、MWIR元素、tRNA的pri-miRNA由RNA聚合酶III转录。
- miRNA在pri-miRNA中呈柄环结构。（图10、11）
- 每个pri-miRNA可含1~6个miRNA。
- 细胞核中，pri-miRNA被DGCR8蛋白（无脊椎动物中称为Pasha蛋白）识别，然后被Drosha酶（属于RNase III）将柄环结构剪切为pre-miRNA。
- DGCR8蛋白和Drosha酶共同构成“微处理”复合体（Microprocessor Complex）。
- pre-miRNA长约为70 nt。
- miRNA出现于柄环结构中柄的上半部分。
- pre-miRNA利用Exportin-5通过核孔进入细胞质。
- 细胞质内，Dicer酶将pre-miRNA从中间切下22 nt左右，切下部分为dsRNA。（下文暂称此RNA为pro-miRNA）
- pre-miRNA和pro-miRNA的每条链的3'端多出2个核苷酸。（RNase III切割的特征）
- 如果pre-miRNA富含G，可能形成G四联体结构，则不被Dicer酶处理。
- 植物细胞中产生miRNA的过程与上述略有不同，见图13。（它们的进化起源可能不同）
- 植物的miRNA处理不经过Drosha酶切。
- 植物的miRNA通常不在基因内，动物的miRNA通常在内含子内。
- 动物的miRNA主要与mRNA的3'端不翻译区结合，次要与外显子结合，少数与内含子结合。
- 植物的miRNA一般与外显子结合。
- RISC复合体结合Dicer酶切下的dsRNA，使它变性，抛弃其中一条链，另一条链成为miRNA，此过程称为RISC复合体的成熟（Maturation）。
- 若切下的dsRNA只有一条链成为miRNA，此链称为Guide Strand，另一条链称为Passenger Strand。（也可能两条链都成为miRNA）
siRNA
- siRNA帮助细胞抵抗外来RNA。
- siRNA绝大部分产生于外源的dsRNA，极少数产生于细胞转录的dsRNA。
- siRNA是双链结构，而pre-miRNA是发夹结构。（区分siRNA和miRNA的唯一标准）
- Dicer酶处理dsRNA产生新的dsRNA（暂称为pro-siRNA），它与RISC复合体结合。（类似于pro-miRNA）
Dicer酶（图12）
- Dicer酶由2个RNase III亚基、1个PAZ亚基组成。
- Dicer酶既可切割发夹结构，也可切割双链结构，但每条链一3'端要多出2个核苷酸。
- PAZ亚基固定3'端的2个核苷酸。
- 两个RNase III的切割位点距离PAZ亚基约20个核苷酸长，从而切下的dsRNA每条链也约为此长度。
piRNA
- piRNA只出现于动物细胞内，帮助细胞抑制转位子。（植物用siRNA对抗转位子）
- piRNA几乎只在生殖细胞中表达。
- piRNA源于细胞转录出的ssRNA，具体产生过程尚不清楚，但Dicer酶一定不参与。
- piRNA的5‘端一般是U，3'端磷酸基团的3'羟基一般变为氧甲基。
- 细胞核内也有piRNA，作用不明。
RISC复合体及其它
- 5'端的核苷酸以A或U为主的链更容易被选为Guide Strand。
- RISC复合体的核心是Argonaute酶。
- Argonaute酶将与Guide Strand紧密配对的RNA剪断，从而阻止翻译。（图14）
- Argonaute酶亦可抑制RNA翻译。（图15）
- 植物（包括真菌）、低等动物（不包括果蝇）的细胞内有以RNA为模板的RNA聚合酶（RdRP）。
- 未与RISC复合体结合的小RNA可直接与mRNA结合，此时RdRP以小RNA为引物，合成一条链，组成dsRNA。
- 上述dsRNA可被Dicer酶处理，形成新小RNA，从而放大RNAi现象。
RNAi与生物技术
- 转基因技术中，导入同一基因的多个拷贝会引起共抑制现象（Cosuppresion）。
- 共抑制现象原因尚不清楚，但转录组研究显示细胞产生了对应于多拷贝基因的miRNA。
- RNAi被用于人工基因表达调控：
- 最早，先在试管内合成特定dsRNA，然后注入秀丽隐杆线虫细胞。
- 随后，发现直接将秀丽隐杆线虫浸泡在dsRNA溶液里也能注入dsRNA。（但哺乳动物细胞不行）
- 后来，先将dsRNA对应的DNA导入大肠杆菌的质粒，使大肠杆菌产生dsRNA，然后给线虫喂食大肠杆菌。
- 哺乳动物细胞中，以上方法成功率都不高，因为较长的dsRNA易引起干扰素（Interferon）反应，进而细胞凋亡。
- 现代，先将构造的DNA序列导入动物细胞的基因组中，该序列转录产生自动折叠为柄环结构的RNA（shRNA），模仿pre-RNA的功能。
- 此方法可使线虫的全部细胞永久具有该dsRNA的干扰效果。
真核生物的长非编码RNA（lncRNA）
- lncRNA指长度大于200 nt的非编码RNA。
- lncRNA的功能非常复杂，包括：
- 抑制或激活特定基因的转录；
- 控制通用转录因子（General Transcription Factor）或RNA聚合酶本身；（此类lncRNA多由RNA聚合酶III转录）
- 控制mRNA剪接（Slicing）；
- 控制mRNA翻译；（此现象在神经细胞中尤为明显）
- 控制表观遗传。（典型：Xist控制形成巴氏小体，见下文）
Xist
- 雌性胎盘动物（后兽亚纲和真兽亚纲）在胚胎有32~64个细胞时，每个细胞中两条X染色体中任意一条变为异染色质（失活），称为巴氏小体（Barr's Body）。
- 若失活的X染色体来自父方（母方），则该细胞分裂产生的所有细胞中失活的X染色体都来自父方（母方）。
- 正常的X染色体记作Xa，失活的X染色体记作Xi。
- 后兽亚纲动物中，总是来自父方的X染色体变为异染色质。
- 老鼠胚胎有2~4个细胞时，来自父方的X染色体因染色体印记而失活，但在囊胚早期此染色体复活。（但胚外组织，包括胎盘，其细胞中此X染色体永久失活）
- X染色体上有XIC区域（X-inactivation Center）。
- XIC区域包含4个基因：Xist、Tsix、Jpx、Ftx。
- Xist和Tsix互为反义RNA，互相抑制转录。
- 胚胎初期，所有细胞少量转录Xist。
- 胚胎达到32细胞时，每个细胞中其中一个X染色体不再转录Xist，另一个大量转录Xist。
- Xist有3'端多聚A，要经历剪接，但不编码蛋白质，属于伪基因（Pseudogene）。
- Xist是唯一Xa不表达，Xi大量表达的基因。
- Xist先逐步包裹转录出它的X染色体。（尚不清楚为何不包裹另一条X染色体）
- Xist吸引其它蛋白质（如PRC2）对X染色体进行修饰。
- X染色体失活修饰包括：高DNA甲基化、低组蛋白乙酰化、低H3K4甲基化、高H3K9甲基化。
- 只有失活X染色体中出现一种罕见组蛋白macroH2A（又名H2AFY），替代正常组蛋白H2A。
- 将XIC区域移入其它染色体，该染色体也会出现上述失活现象。
参考文献
- 《Molecular Biology of the Cell》第7章
- 《Molecular Biology of the Gene》第20章