生物技术

DNA/RNA

Blot

• 众所周知的southern对应DNA northern对应RNA
• 核酸探针杂交之前要预杂交（一般用鲑鱼精子???）
• 硝酸纤维素膜和尼龙膜：前者靠疏水作用结合核酸 比较脆；后者靠共价键结合核酸 比较坚韧（所以多轮杂交一般用尼龙膜）

PCR（及其衍生操作）

• T4DNA聚合酶在低dNTP浓度下表现3'-5'外切酶活性 高浓度下表现聚合酶活性 应用于3'末端标记 同时klenow片段也可应用于3'末端标记；5'末端标记用碱性磷酸酶和T4多核苷酸激酶
  • 末端标记法一般较少用于杂交探针制备（但可以用）早期DNA测序会使用末端标记 现在多用于测序

• 引物设计原则（老生常谈系列）
  • 长度18－30
  • 避免二聚体/二级结构（电泳胶底下一大坨二聚体预警）
  • 碱基最好随机分布 同种碱基不要成串出现 GC比例40％－60％
  • Tm在55－80
  • 3'端最好以G/C结尾 两条引物3'端绝对不能互补（二聚体预警）避免多个A/T
  • 5'端可以灵活修饰 影响没有那么大
  • 对真核生物mRNA可设计跨内含子引物防止非特异性扩增
• 甘油和DMSO可以竞争核酸内部的氢键 进而打开二级结构 提高产量
• RT－PCR的ct法要看本底基因 本底是内参基因！！要用本底基因的Δct进行矫正算ΔΔct 具体计算公式是ΔΔct＝Δct实验－Δct对照 用于排除RNA提取效率 反转录效率和你每个管加的cDNA量有轻微不一样的误差

一些奇怪的PCR

巢式PCR

两对引物 第一轮扩增后要对产物进行稀释 避免外引物产生干扰 可以极大提高反应的特异性

5'/3'RACE

适用于RNA一端已知一端未知

先利用反转录酶得到一段DNA 接着给它加上一个尾巴 然后利用已知片段和尾巴进行PCR

用两对引物增强特异性

测序

• sanger法等多种末端终止法电泳的时候用（SDS－）PAGE胶电泳 琼脂糖孔洞太大了分辨率不够
• 一代末端终止 二代边合成边测序 三代单分子合成测序
  • 准确率上1＞2＞3
  • 读长3＞1＞2
  • 效率3＞2＞1
  • 现在最常用的是二代
• 某些非光学显微镜（比如扫描隧道显微镜）可以直接“阅读”DNA