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PCR补充】

  （1）巢式PCR （Nested PCR）

   巢式PCR 通常涉及两轮连续PCR 反应，需要设计两对引物，第一轮PCR 是用一对外引物扩增得到包含目的片段的较长产物，将其经过稀释以后作为第二轮PCR 的模板，再用另对内引物（巢式引物，位于第一轮PCR 产物的内部）进行第二轮PCR，得到的产物为目的片段。

   两对引物：外引物在目的片段的侧翼，内引物在目的DNA 片段的准确区域。

   巢式PCR 的特点：

   特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR 中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR 中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。

   灵敏度高：进行两轮PCR 扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR 的灵敏度。

   巢式PCR 在实际应用中，根据实验的要求和遇到的问题，又延伸出以下几种类型：

   半巢式PCR（semi-nested PCR）是利用三条引物进行两次 PCR 扩增，在第二轮PCR 反应中使用的引物有一条为第一轮PCR 的引物，适用于巢式PCR 中基因的3'末端或者5'末端无法设计出两条引物的情况。

   反转录巢式PCR（RT-nested PCR）是以cDNA 为模板，对目的片段进行巢式PCR 扩增，适用于检测拷贝数较低的RNA，特异性更高、可靠性更强。

   单管巢式PCR （single-tube nested PCR，STN-PCR）是指设计具有不同退火温度的外引物和内引物，通过控制退火温度在一个PCR 管中进行两轮PCR 反应，降低了交叉污染的风险，并且缩短了实验时间和节约了试剂。

   共有序列巢式PCR（consensus nested PCR），又称为共有引物巢式PCR（ consensus primer nestedPCR），适用于病毒等种属内型别较多，但检测样本中的病毒型别不确定的情况，根据同一种属内较为保守的序列设计简并引物，经过两轮PCR 扩增待检样本中的目的片段，通常第一轮PCR 引物的简并碱基较多，第二轮PCR 引物的简并碱基较少。

   巢式PCR 大多应用于模板DNA 含量较低的情况，一次PCR 难以得到满意的结果，用巢式PCR的两轮扩增可以得到足够的特异性产物。

   巢式PCR 需要注意两轮扩增引物的比例，特别是第一轮PCR 的引物用量。如果第一轮PCR 引物加入过量，体系中剩余的引物将会进入第二轮PCR 扩增反应，同样能得到一定产量的较长产物，此时第二轮PCR 的产物会出现除目的片段之外的杂带。因此，在第一轮PCR 中要严格控制引物最低的加入量，同时适当增加循环次数，尽量消耗体系中的残余引物。

  （2）降落PCR（TouchdownPCR）

降落PCR 是通过对反应体系中退火温度进行优化来提高反应的特异性。在降落PCR 中，根据引物的Tm 值，设置一系列从高到低的退火温度，在最开始循环中的退火温度高于引物的Tm 值，之后每一个（或n 个）循环降低1℃（或 n℃）退火温度，直到退火温度降低到最佳温度（通常比引物的Tm 值低 2~5℃），剩余的循环都维持此退火温度。

   降落PCR 的基本原理是一开始使用较高的退火温度可避免引物二聚体和非特异性产物的形成，保证扩增产物的特异性，之后的循环中逐渐降低退火温度，提高扩增的效率。在初始循环中，特异性产物的量达到一定丰度，后续低退火温度扩增循环中，虽然扩增的特异性降低，但非特异位点结合的竞争力要低于特异性位点，因此产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。

   降落PCR 的特点：

   早期循环中进行高特异性、低效率的扩增，退火温度要高于最适的退火温度。

   后期较低的退火温度能很有效地增加特异性产物的产量，同时使非特异性的扩增降到最低，因为在早期循环中已积累大量的特异产物，减少了特异引物与非特异序列结合的机会。

当退火温度在特异性产物的Tm 值与非特异性产物的Tm 值之间时，特异性产物的竞争优势更加明显。

   降落PCR 与温度梯度PCR 的区别：

   降落PCR 与温度梯度PCR 都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。

   温度梯度PCR 是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管 PCR，将其分别放置在PCR 仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR 扩增。

   降落PCR 是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR 管内进行PCR 扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。

与温度梯度PCR 相比，降落PCR 更有优势。温度梯度PCR 需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR 只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。

   降落PCR 适用于不确定引物的最适Tm 值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR 可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR 还可与其它PCR 方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR 等。

  （3）多重PCR（Multiplex PCR）

   多重PCR 是指在同一PCR 反应体系中加入两对或两对以上引物，扩增同一模板的几个区段，从而同时扩增出多个核酸片段。多重PCR 技术是在常规PCR 的基础上进行改良，实现在同一反应管中同时扩增和对比多个不同的片段，节约了时间、试剂和样本。

多重PCR 具有高效性和系统性，可在一次反应中检测出多个目的片段，但无法仅针对一对引物或目的片段进行反应优化，因此对引物设计要求高，设计引物时要尽量避免非特异性扩增或者产生引物二聚体。引物序列应尽可能与其目的序列一一对应，并且目的片段的大小应该是不同的，才能通过凝胶电泳对其进行分离鉴定。

   多重PCR 中的所有引物 Tm 值相差不应超过 5°C，在多重 PCR 开始前，应利用单个PCR 反应验证每个引物对的特异性和扩增效率。多重 PCR 合适的引物浓度为 0.1 ~ 0.5 μM，当重数较多时，建议引物用量不超过 0.3 μM。 除了引物设计，使用热启动DNA 聚合酶和专为多重PCR 设计的缓冲液也有助于获得成功的PCR 结果和提高反应特异性。

   多重PCR 主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。根据多重PCR 技术的优点，也常将其与实时荧光定量 PCR 结合进行多重荧光定量检测。

  （4）不对称PCR（asymmetric PCR）

经典的PCR 反应是通过一对引物得到双链DNA（dsDNA）产物，不对称PCR是利用不等量的一对引物，PCR 扩增后形成大量单链DNA（ssDNA），便于测序。

不对称 PCR 一般采用 50～100：1 的引物浓度比，在最初的10～15 个循环中主要产物是双链DNA，但当低浓度引物被消耗尽时，高浓度引物介导的PCR 反应就会产生大量的单链DNA，因此经过不对称 PCR 获得的是ssDNA 和 dsDNA 的混合物，可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，可用原引物或第三条内部引物直接测序。

   通过调整正反向引物的量，可以实现得到ssDNA。我们将低浓度的引物称为限制性引物，高浓度引物称为非限制引物，不对称PCR 的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。

   制备ssDNA 的另一种方法是先用等浓度的引物PCR 扩增，制备dsDNA，然后以此dsDNA 为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，得到ssDNA。