第十二章 细胞内组织和蛋白质分选
内质网
内质网 （ER） 的膜通常占普通动物细胞总膜的一半以上（参见表 12-2）。ER 组织成一个网状迷宫，由分支小管和扁平囊组成，延伸到整个胞质溶胶（图 12-14 和电影 12.2）。小管和囊相互连接，它们的膜与外核膜连续。这个膜系统包含一个称为 ER 腔的内部空间，它与内外核膜之间的空间连续。ER 通常占据总细胞体积的 10% 以上（请参见表 12-1）。
ER 在脂质和蛋白质的生物合成中起着核心作用，ER 腔储存在许多细胞信号反应中动员的细胞内 Ca2+（在第 15 章中讨论）。ER 膜是细胞器许多跨膜蛋白和脂质的产生场所，包括 ER 本身、高尔基体、溶酶体、内体、分泌囊泡、过氧化物酶体和质膜。ER 膜也是线粒体和质体膜的大多数脂质的制造部位。此外，几乎所有将分泌到细胞外部的蛋白质——加上那些发往内质网、高尔基体或溶酶体腔的蛋白质——最初都被输送到内质网腔。
ER 在结构和功能上是多种多样的
虽然 ER 的各种功能对每个细胞都是必不可少的，但它们的相对重要性在单个细胞类型之间差异很大。为了满足不同的功能需求，ER的不同区域变得高度专业化。功能专业化导致 ER 不同部分的比例丰度发生巨大变化。这些变化被观察到为不同类型细胞中不同类型的 ER 膜。视觉上最引人注目的特化是粗糙 ER 和光滑 ER（图 12-15）。粗糙的外观是由于大量参与蛋白质合成的核糖体结合到 ER 的这一部分表面。相比之下，光滑 ER 区域缺乏核糖体，专用于其他 ER 功能，例如脂质的生物合成和代谢。所有细胞都有粗糙和光滑的 ER，但它们的相对丰度在特化细胞中可能会有很大差异。
大多数分泌蛋白是由粗糙 ER 表面的核糖体合成的。因此，专门分泌大量蛋白质的细胞充满了大量的粗 ER。例如，胰腺的外分泌细胞每天在分泌自身重量的消化酶，这解释了为什么粗内质网占这些细胞膜的 60%（参见表 12-2）。同样，分泌抗体的浆细胞和分泌胰岛素的 β 细胞也含有标记扩增的粗 ER。高分泌细胞与大量粗面内质网之间的共存提供了ER是合成分泌蛋白的第一个证据。
与粗略的 ER 相比，平滑 ER 的功能更加多样化，并且可以变得高度专业化。在所有细胞中发现的一种光滑的 ER 称为瞬时 ERtransitional ER，携带新合成蛋白质和脂质的运输囊泡从中萌出并运输到高尔基体。在某些专门的细胞中，光滑的 ER 具有保证其扩展的附加功能。例如，合成类固醇激素的细胞含有突出的光滑内质网，以配合制造胆固醇的酶并对其进行修饰以形成各种类固醇激素（参见图 12-15B）。
肝脏中的主要细胞类型，即肝细胞，也具有增加的平滑 ER 量（参见表 12-2），用于两个不同的目的。肝细胞是产生脂蛋白颗粒的主要部位，脂蛋白颗粒通过血流将脂质输送到身体的其他部位。合成颗粒脂质成分的酶富集在光滑的 ER 膜中。此外，这些膜还含有催化一系列反应的酶，以解毒药物和新陈代谢产生的各种有害化合物。这些解毒反应中研究最广泛的是由细胞色素 P450 酶家族进行的。它们催化一系列反应，在这些反应中，水不溶性药物或代谢物本来会在细胞膜中积累到毒性水平，但水溶性足以离开细胞并随尿液或胆汁排出。
在大多数真核细胞中，ER 的另一个至关重要的功能是从胞质溶胶中隔离 Ca2+。Ca2+ 从ER释放到胞质，及其随后的再摄取，发生在对细胞外信号的许多快速反应中，如第 15 章所述。Ca2+ 泵将 Ca2+ 从细胞溶胶输送到 ER 管腔。ER 中高浓度的 Ca2 + 结合蛋白有助于 Ca2 + 的储存。在某些细胞类型中，ER 的特定区域专门用于 Ca2+ 储存。肌肉细胞具有丰富的、经过修饰的平滑 ER，称为肌浆网。肌浆网对 Ca2+ 的释放和再摄取在每一轮肌肉收缩期间分别触发肌原纤维收缩和松弛（在第 16 章中讨论）。
最后，光滑的 ER 可以特化处用于与其他细胞器密切相关的区域，尤其是线粒体、质体、内体和质膜（图 12-16）。这些细胞器接触位点富含参与并列膜之间关键代谢物通讯或运输的蛋白质。例如，脂质从它们在 ER 中的合成位点到线粒体的转运被认为发生在 ER 线粒体接触位点。ER 与质膜的接触调节质膜磷酸肌醇的水平，质膜磷酸肌醇是参与许多信号通路的脂质（在第 13 章和第 15 章中讨论）。还观察到其他细胞器组合之间的接触，这些很可能也参与脂质和其他代谢物的选择性转移。
为了研究 ER 的功能和生物化学，有必要将其分离。这似乎是一项无望的任务，因为 ER 与细胞质的其他成分错综复杂地交错。幸运的是，当组织或细胞被匀浆破坏时，ER 会分解成片段，这些片段重新密封形成小的（直径为 ∼100-200 nm）封闭囊泡，称为微粒体（图 12-17）。对于生物化学家来说，微粒体代表 ER 的小真实版本，仍然能够进行蛋白质易位、蛋白质糖基化（稍后讨论）、Ca2+ 摄取和释放以及脂质合成。粗糙的微粒体，来源于粗糙的 ER，在其外表面包含核糖体，并包围了 ER 管腔的一小部分。缺乏核糖体的光滑微粒体来源于光滑 ER、质膜、高尔基体、内体和线粒体的囊泡化片段。附着在粗糙微粒体上的核糖体使它们比光滑的微粒体更致密。因此，科学家们使用平衡密度离心来分离粗糙和光滑的微粒（图 12-17）。来自不同细胞器的光滑微粒体可以依据内含蛋白的不同进一步分离。
信号序列首先在输入粗糙ER的蛋白质中发现
ER 在合成时从胞质溶胶中捕获选定的蛋白质。T 蛋白有两种类型：跨膜蛋白，嵌入 ER 膜中，和水溶性蛋白，它们完全穿过 ER 膜转位到 ER 腔。其中一些蛋白质在 ER 中起作用，但许多蛋白质注定要驻留在另一个细胞器中，驻留在质膜中，或分泌到细胞外。所有这些蛋白质，无论其随后的命运如何，最初都通过 ER 信号序列定向到 ER 膜。
信号序列（以及蛋白质分选的信号序列策略）是在分泌的水溶性蛋白质中发现的，这些蛋白质首先跨 ER 膜易位。在关键实验中，将编码分泌蛋白的 mRNA 添加到从细胞中提取的胞质溶胶中。在这种无细胞反应中，胞质溶胶中的核糖体将 mRNA 翻译成比正常分泌蛋白略大的蛋白质（图 12-18）。当在来自粗 ER 的微粒体存在下重复反应时，产生正确大小的蛋白质并位于微粒体内部（图 12-18）。相比之下，编码胞质蛋白的 mRNA 产生正确大小的产物，无论是否存在粗糙的微粒体。信号假说被提出来解释这些观察结果。根据这个模型，分泌蛋白的 mRNA 编码的蛋白质最终比分泌的蛋白质大。有人提出，额外的多肽是将分泌的蛋白质引导到 ER 膜的信号序列。信号序列发挥其功能后，在多肽链完成之前，它被 ER 膜中的信号肽酶切割掉。
这些实验强调了如何通过将必要的细胞成分（如 mRNA、胞质溶胶和微粒体）混合在一起，在无细胞系统中重构复杂的细胞过程（如 ER 输入）。通过以不同的方式组合组成部分，早在可以直接对其 mRNA 进行测序之前，就推断出分泌蛋白上信号序列的存在。事实证明，这种无细胞系统易于操作对于识别、纯化和研究负责 ER 输入的分子机制的各种成分是必不可少的。后来建立了类似的系统来解剖蛋白质进出细胞核的运输、蛋白质输入线粒体和叶绿体以及囊泡运输。
信号识别粒子SRP将 ER 信号序列引导至 ER处的特定受体
ER 信号序列由至少两个成分引导至 ER 膜：与信号序列结合的信号识别粒子 （SRP） 和 ER 膜中的 SRP 受体。SRP 是一个大型综合体;在动物细胞中，它由与单个 RNA 分子结合的六条不同的多肽链组成（图 12-19A）。这个蛋白质靶向机制出现在进化的早期并且一直被保守。
ER 信号序列的氨基酸序列差异很大，但每个序列的中心都有 8 个或更多非极性氨基酸（参见图 12-13）。SRP 如何特异性结合这么多不同的序列？答案来自一种 SRP 蛋白的结构，它表明信号序列结合位点是一个富含蛋氨酸的大疏水口袋（图 12-19B）。由于蛋氨酸具有未支链的柔性侧链，因此该口袋具有足够的可塑性，可以容纳各种大小和形状的不同疏水信号序列。
在真核细胞中，SRP 是一种铰链棒状结构，可以包裹在大核糖体亚基上（图 12-19C）。SRP包含信号肽结合口袋的末端位于核糖体隧道附近，新制造的多肽通过该隧道出现。这使得 SRP 能够在信号序列从核糖体中出现时参与信号序列。一旦 SRP 与信号序列结合，SRP 的另一端就可以在大核糖体亚基和小核糖体亚基之间的界面处结合（图 12-19D）。这是翻译延伸因子结合的同一位点，因此 SRP 参与的核糖体翻译蛋白质的速度会比正常情况慢。较慢的翻译可能使核糖体有足够的时间在多肽完成之前与 ER 膜结合，从而确保蛋白质不会释放到胞质溶胶中。这种安全装置对于分泌型和溶酶体水解酶可能特别重要，它们可能会对胞质溶胶造成严重破坏;然而，分泌大量水解酶的细胞需要额外的预防措施，即其胞质溶胶中含有高浓度的水解酶抑制剂。
当信号序列结合时，SRP 暴露了 SRP 接收的结合位点（参见图 12–19D），该受体是粗面 ER 膜中的跨膜蛋白复合物。SRP 与其受体的结合使 SRP-核糖体复合体到 ER 膜中未占据的蛋白质易位子protein translocator 。在核糖体隧道附近结合的 SRP 部分移动到不同的部位，允许易位子占据这个位置。然后释放 SRP 和 SRP 受体，蛋白质合成全速恢复。现在与翻译核糖体紧密结合的转运体将生长的多肽链转移过膜（图 12-20）
这个共翻译转移过程产生了两个空间上独立的核糖体种群。附着在 ER 膜胞质侧的膜结合核糖体参与当前跨 ER 膜易位的蛋白质的合成。未附着在任何膜上的游离核糖体合成由核基因组编码的所有其他蛋白质。膜结合核糖体和游离核糖体在结构和功能上相同。T hey 的区别仅在于它们在任何给定时间制造的蛋白质。
由于许多核糖体可以与单个 mRNA 分子结合，因此通常会形成多核糖体。如果 mRNA 编码具有 ER 信号序列的蛋白质，则多核糖体会附着在 ER 膜上，由多个生长的多肽链上的信号序列引导。与这种 mRNA 分子相关的单个核糖体在完成翻译并与游离核糖体库混合时可以返回胞质溶胶。然而，mRNA 本身仍然通过不同的核糖体附着在内质网上。
多肽链通过一个信号序列门控的亲水性通道
长期以来，人们一直争论多肽链是通过与脂质双层直接接触还是通过蛋白质转运蛋白中的通道穿过 ER 膜转移。争论以鉴定出易位蛋白而告终，该转运蛋白被证明在多肽链通过的膜上形成一个充满水的通道。易位蛋白的核心称为 Sec61 复合物，由三个亚基构建，细菌到真核细胞都是高度保守的。Sec61 转运蛋白的结构显示，10个 α螺旋围绕着一个中央通道（图 12-22）。通道由一个短的 α 螺旋插入，该螺旋在空闲时保持 translocator 关闭。保持通道关闭以防止离子（如 Ca2+）从 ER 中泄漏出来非常重要。在易位过程中，栓子移开，以便多肽可以通过通道。
Sec61 转位蛋白仅对包含信号序列的蛋白质开放。Sec61 转位器识别信号序列的能力提供了一个校对步骤，以确保只有真正用于 ER 的蛋白质可以进入。信号序列识别前后 Sec61 易位点的冷冻电子显微镜结构显示，信号序列楔入 Sec61 中的侧门或接缝，其 N末端面向细胞溶胶（图 12-23A）。在这个侧向门上插入信号序列会加宽中央通道并释放塞子。然后，开放的转位器很容易容纳通道内信号序列后面的多肽片段。信号序列是疏水性的，横向离开门进入膜，在那里它被信号肽酶切割掉，然后被 ER 膜和胞质溶胶中的其他蛋白酶迅速降解为氨基酸。正如这种机制所示，Sec61 转运器中的侧门提供了从 Sec61 的中央通道到细胞膜的疏水核心的入口路线。除了在识别信号序列中的作用外，侧门还指导跨膜蛋白整合到 ER 中，我们将在后面讨论。
一旦信号序列打开 Sec61 转位器并将随后的多肽穿入通道，转位与继续翻译同时发生。在易位过程中，核糖体大亚基内的多肽隧道747-785与 Sec61 转运体内的通道对齐（图 12-23B）。这种配置为多肽从核糖体中的肽基转移酶中心（其中新氨基酸被添加到生长的蛋白质链中）到 15 nm 外的 ER 腔提供了一条连续的路径。通过这种方式，用于多肽延伸的能量也被间接利用来驱动跨 ER 膜的易位。
当翻译终止时，多肽的末端从核糖体中释放出来，并通过 Sec61 转运蛋白滑过，其插头返回以关闭通道。因此，ER 导入的整个过程，从 SRP 的信号序列识别到通过 Sec61 转位器的易位，在多肽有机会折叠之前以共翻译方式发生。此途径提供了一种解决方案，以解决如何将大的蛋白质穿过膜的屏障，而不导致小的离子和代谢物的泄露。
穿过ER膜的移位不总是需要肽链延长正在发生
一些蛋白在加入ER之前完全在细胞质中合成，展示了穿过ER膜的移位不总是需要肽链延长正在发生。这称为翻译后转运。翻译后转运在酵母的ER中更常见，以及细菌的细胞膜上。两种情况下，Sec61易位子（细菌中SecY）被使用。其狭窄的通道意味着前体只能作为未折叠的多肽转运。因此，前体蛋白在胞质溶胶中初始合成后不会折叠。相反，它们与其他胞质溶胶蛋白相互作用，这些蛋白在与 Sec61 转运蛋白结合之前阻止前体折叠或聚集。这些相互作用的蛋白质通常是一般的伴侣蛋白，例如 hsp70 家族的蛋白质（第 6 章讨论），并且必须在未折叠的多肽穿过转运蛋白时解离。
正如前面讨论的共翻译转运一样，前体的信号肽直接与 Sec61 转运蛋白结合以打开通道。然而，跨膜转运的下一步发生的方式不同，并且依赖于使用细胞能量将多肽拉动的辅助蛋白，从腔侧穿过通道或从胞质溶胶进入通道（图 12-25）。为了将蛋白质拉入内质网腔，真核细胞使用称为 Sec62 和 Sec63 的辅助蛋白，它们与 Sec61 转运蛋白相关联，并将 hsp70 样分子伴侣蛋白（称为 BiP，代表结合蛋白）定位在转运通道的腔侧开口附近。与其胞质表亲一样，BiP 对未折叠的多肽链具有高亲和力，并且多肽链一旦从内质网腔中的 Sec61 转运蛋白中出现，它就会紧密结合到进入的蛋白质链上。BiP 的紧密结合可防止蛋白质链向后滑动，有利于更多的链进入腔内，在那里它可以与另一个 BiP 分子结合。 BiP 对 ATP 的水解使其释放多肽，使其能够再次与任何新出现的转运多肽片段结合。这种能量驱动的结合和释放循环充当分子棘轮，在前体最初插入 Sec61 转运蛋白后，为蛋白质的输入提供驱动力。
由于细菌将蛋白质直接运输到没有能量的细胞外空间，因此它们使用一种称为 SecA ATPase的细胞质辅助蛋白。
图 12-5 蛋白质转运可以通过结构相似的转运蛋白驱动的三种方式。（A）共翻译转运。核糖体由 SRP 和 SRP 受体带到膜上，然后与 Sec61 转运蛋白结合。生长的多肽链在生成时穿过膜。不需要额外的能量，因为生长链的唯一可用路径是穿过膜。 (B) 真核细胞中的翻译后转运需要由 Sec62 和 Sec63 蛋白组成的额外复合物。该复合物附着在 Sec61 转运蛋白上，并将 BiP 分子定位在它们可以与从内质网腔中的转运蛋白中出现的转运链结合的位置。ATP 驱动的 BiP 结合和释放循环将蛋白质拉入腔内。
(C) 细菌中的翻译后转运。完整的多肽链由 SecA ATPase 从细胞质侧送入质膜中 Sec61 转运蛋白的细菌同源物（称为 SecY）。ATP 水解驱动的构象变化驱动 SecA 中的活塞式运动。活塞不仅推动蛋白质链的几种氨基酸通过转运蛋白的孔，而且还防止链回滑到细胞质中。尽管Sec61 转运蛋白、SRP 和 SRP 受体存在于所有生物体中，但 SecA 仅存在于细菌中，而Sec62✣ec63 复合物仅存在于真核细胞中。（改编自 P. Walter 和 A.E. Johnson，Annu. Rev.Cell Biol. 10:87-19, 1994.）
SecA 与前体多肽结合并附着在转运蛋白的胞质侧，在那里，它经历由 ATP 水解引起的周期性构象变化。每次水解 ATP 时，一部分 SecA 蛋白都会插入转运蛋白的孔中，推动前体蛋白的短片段。由于这种类似活塞的棘轮机制，SecA ATPase 逐渐推动运输蛋白的多肽链穿过膜。
跨膜蛋白含有被识别为信号序列的疏水片段
所有存在于 ER、高尔基体、溶酶体、内体、分泌囊泡和质膜中的跨膜蛋白在移动到最终目的地之前都会插入 ER 膜中。内质网产生的跨膜蛋白通过一个或多个螺旋疏水性分子跨越脂质双层转运 - 膜片段（见图 10-7）。因此，膜蛋白的生物合成需要多肽链的某些部分跨脂质双层转运，其他部分留在胞质溶胶中，跨膜片段整合到膜中。尽管增加了这种复杂性，但刚刚描述的用于将可溶性蛋白质转移到 ER 腔中的相同因子（SRP、SRP 受体和 Sec61 转运蛋白）也介导跨膜蛋白整合到 ER 膜中。可以使用相同的因子，因为定义跨膜蛋白的跨膜片段类似于指导可溶性蛋白质转运的疏水性 ER 信号序列。
在最简单的情况下，跨膜蛋白包含单个跨膜片段，该片段最终将作为跨膜α螺旋嵌入脂质双层中。当该跨膜片段在合成过程中从核糖体中出现时，SRP 将其疏水性螺旋特征识别为信号序列，并将该核糖体带到内质网膜上的 Sec61 转运蛋白。然后，跨膜片段插入 Sec61 转运蛋白的侧门，该侧门与信号序列结合的位点相同。跨膜片段插入侧门的方向决定了跨膜片段之前或之后的蛋白质片段是否穿过膜进入内质网腔（图 12-26）。如果 N 末端较短且未折叠，则跨膜片段的方向取决于多肽链的特征，例如附近带电氨基酸的分布和跨膜片段的长度。如果前面的 N 末端片段很长且折叠稳定，则它不会通过狭窄的 Sec61 通道穿过膜。在这种情况下，仍在合成中（因此未折叠）的 C 末端片段会跨膜转位。
图 12?6 跨膜片段引导膜蛋白插入内质网膜。许多单次通过的膜蛋白使用其跨膜片段直接插入内质网膜（影片 12.3）。跨膜片段被 SRP（未显示）识别，并通过 SRP 受体（未显示）递送至内质网膜上的 Sec61 转运蛋白。然后，跨膜片段以两种方向之一插入 Sec61 转运蛋白的侧门。（A）一些跨膜片段插入侧门，使得 N 端结构域保留在 Sec61 的胞质侧。这种方向有利于 N 端结构域非常长或折叠的蛋白质，以及侧翼氨基酸在 N 端侧带有净正电荷的跨膜片段。 (B) 一些跨膜片段插入侧门，使得 C 端侧翼区保留在 Sec61 的胞质侧。在这种情况下，N 端侧翼区被认为通过 Sec61 通道跨膜转移。这种方向有利于侧翼氨基酸在 C 端侧带净正电荷的跨膜片段。
许多跨膜蛋白含有较大的 N 末端腔内结构域。在这种情况下，N 末端信号序列用于启动易位，就像可溶性蛋白质一样。 这样，成熟多肽的 N 末端通过信号序列进入内质网腔，多肽的其余部分开始通过 Sec61 转运蛋白进行易位。 当多肽中的疏水片段从核糖体中出现时，它插入侧门以进入脂质双层。由于疏水片段在膜中比在水性通道中更稳定，它会从侧向离开通道，转运停止，其余蛋白质在内质网膜的胞质侧合成（图 12-7）。
根据上下文解释多通道跨膜蛋白的疏水片段以确定其方向
在多跨膜蛋白中，多肽链以疏水螺旋的形式反复穿过脂质双层（见图 10-7）。多通道跨膜蛋白的合成直到第一个跨膜片段的发生，就像我们刚刚描述的单通道跨膜蛋白一样。因此，SRP 会将蛋白质运送到转运蛋白，在那里第一个跨膜片段将插入 Sec61 转运蛋白的侧门，其方向由前一个 N 末端结构域和附近带电氨基酸的特征决定。这样，第一个跨膜片段插入膜可有效锁定蛋白质其余部分的拓扑结构。从此时起，Sec61 转运蛋白根据蛋白质前一部分的拓扑结构和特性解释每个连续的疏水片段。
由于核糖体和 Sec61 转运蛋白之间紧密耦合，每个疏水片段都出现在非常靠近侧门的位置，侧门可进入脂质双层。在最简单的情况下，新出现的疏水片段以与最近插入的跨膜片段相反的方向与侧门接合，并插入脂质双层中（图 12-8）。 一些多通道蛋白的跨膜片段仅部分疏水，并且它们本身在脂质双层中不稳定。 但如果它们能够与靠近 Sec61 侧门的先前跨膜片段之一相互作用，它们仍然可以插入膜中。这种合作使得产生含有脂质双层内亲水部分的多通道跨膜蛋白成为可能，这是至关重要的
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C
N
N
ER膜中成熟的单通道跨膜蛋白
跨膜片段
信号序列
胞质溶胶
ER腔
信号肽酶
图12-7 膜蛋白插入过程中切割的ER信号序列和跨膜片段的顺序使用。在ER腔侧含有相对较大N末端结构域的膜蛋白同时利用切割的ER信号序列和跨膜片段。靶向 ER 膜、通过 Sec61 启动转运以及信号序列的裂解都与分泌蛋白完全相同（见图 12-0）。然而，当跨膜片段进入 Sec61 转运蛋白时，转运停止，跨膜片段通过侧门进入脂质双层。蛋白质的其余部分继续在膜的胞质侧合成，直到翻译终止。
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710 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 711 内质网
许多重要的蛋白质，如转运蛋白和通道（在第 11 章中讨论）。跨膜片段之间的亲水序列
要么合成到细胞溶胶中，要么穿过 Sec61 转运蛋白，
这取决于前一个跨膜片段的方向。这样，多通道蛋白质通过连续的疏水序列编织到膜中？
bic 片段达到相反的方向，直到它们全部作为跨膜 a 螺旋插入膜中。
由于膜蛋白总是以这种程序化的方式从 ER 的胞质侧插入，因此相同多肽链的所有副本在脂质双层中都将具有相同的方向。这会产生不对称的 ER 膜，其中暴露在一侧的蛋白质结构域与暴露在另一侧的蛋白质结构域不同。这种不对称性在许多膜出芽和融合事件中得以维持，这些事件将 ER 中产生的蛋白质运输到其他细胞膜（第 13 章讨论）。因此，新合成的蛋白质插入 ER 膜的方式也决定了蛋白质在所有其他膜中的方向。
一些蛋白质通过翻译后机制整合到内质网膜中 许多重要的胞质溶胶膜蛋白通过非常靠近 C 末端的单个跨膜 α 螺旋锚定在膜中。这些尾锚定蛋白包括大量 SNARE 蛋白亚基，可引导囊泡运输（第 13 章讨论）。当尾锚定蛋白被翻译时，核糖体到达终止密码子，而注定要成为跨膜 α 螺旋的多肽序列仍在核糖体出口通道内。因此，SRP 无法识别，蛋白质从核糖体释放到胞质溶胶中。疏水片段被专门的伴侣复合物识别，该复合物将其转移到称为 Get3 的靶向因子（图 12-9）。尽管 Get3 与 SRP 无关，但它也含有一个疏水口袋，口袋内衬有许多蛋氨酸侧链，以帮助它识别各种疏水片段，而不管它们的确切序列如何。 ER 膜上的两种蛋白质 Get1 和 Get2 不仅是 Get3 的受体，也是插入疏水片段的转运蛋白。尾锚定蛋白进入脂质双层。因此，这种翻译后靶向机制在概念上类似于 SRP 依赖性蛋白质靶向（见图 12-0）。一些尾锚定蛋白靶向线粒体或过氧化物酶体而不是 ER，但它们的靶向机制尚不清楚。
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C
N N
ER 膜中的成熟多程跨膜蛋白 跨膜节段 跨膜节段 胞质溶胶 ER 腔
图 12-8 多程跨膜蛋白插入 ER 膜。插入第一个跨膜片段之前发生的事件遵循单次通过膜蛋白的步骤（见图 12?6 和 12?7）。第一个跨膜片段的方向取决于跨膜片段和侧翼区域的特征，就像单次通过膜蛋白一样。当下一个跨膜片段从核糖体中出现时，它会以与第一个跨膜片段相反的方向插入 Sec61 的侧门，然后进入脂质双层。每个连续的跨膜片段都以与紧接在它之前的跨膜片段相反的方向通过侧门插入膜中。这个过程一直持续到所有跨膜片段都已插入膜中。 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 711 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 711 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
712 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
一些膜蛋白获得共价连接的
糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚
蛋白质附着在膜上的另一种方式是通过糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚，该锚与一些前往质膜的蛋白质的 C 末端共价连接。 GPI 锚定蛋白最初由 N 末端信号序列引导至 ER，并由非常靠近 C 末端的疏水片段组成。ER 膜中的转酰胺酶选择性地识别该疏水片段，同时裂解疏水片段并将预先形成的 GPI 锚附着到蛋白质的其余部分（图 12-0）。许多质膜蛋白都是以这种方式修饰的。由于它们仅通过 GPI 锚附着在质膜外部，因此它们可以以可溶形式从细胞中释放出来，以响应激活质膜中特定磷脂酶的信号。例如，锥虫寄生虫在受到免疫系统攻击时使用这种机制来脱落其 GPI 锚定表面蛋白的外壳。 GPI 锚还参与引导一些质膜蛋白进入特殊区域，如脂筏，从而将它们与其他膜蛋白横向隔离（见图 10-3）。
转位的多肽链在粗面内质网腔内折叠和组装
蛋白质以未折叠的多肽形式进入内质网腔。因此，它们必须折叠并组装成正确的三维结构，就像胞质溶胶中新合成的蛋白质必须折叠一样（第 3 章讨论）。为了满足这一需求，内质网腔含有高浓度的常驻分子伴侣和其他蛋白质折叠催化剂。这些 ER 驻留蛋白在其 C 末端含有四个氨基酸的 ER 保留信号，负责将蛋白质保留在 ER 中（见图 12-3；第 13 章第 768 页讨论）。
图 12-9 尾锚定蛋白的插入机制。（A）在尾锚定膜蛋白插入 ER 的翻译后途径中，可溶性预靶向复合物在疏水性 C 末端跨膜片段（红色）从核糖体出口通道出现后捕获它并将其加载到 Get3 靶向因子上。
所得复合物通过与 Get1/et2 受体复合物相互作用靶向 ER 膜，后者起膜蛋白插入机器的作用。尾锚定蛋白从 Get3 释放并插入 ER 膜后，Get3 被回收回细胞溶胶。该靶向循环在概念上类似于 SRP 的蛋白质靶向（见图 12-0）。虽然图中未显示，但 Get3 和 SRP 均可结合并水解核苷三磷酸，从而为靶向循环提供方向性。ATP 由 Get3 使用，而 GTP 由 SRP 使用。（B）与跨膜片段（红色螺旋）结合的 Get3 靶向因子的晶体结构。疏水性跨膜片段与 Get3 中的深沟结合，深沟内衬疏水性氨基酸（黄色），包括许多柔性蛋氨酸。 （PDB 代码：4XTR。）
识别
靶向回收
释放
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预靶向
复合物
N
N
N
C
尾锚定
蛋白
Get3 A TPase
Get1朑et2
ER 腔
胞质溶胶
（A）(B)
C 末端跨膜片段
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712 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 713 内质网
蛋白质 BiP 是 hsp70 伴侣蛋白家族的成员，是
ER 折叠机制的主要组成部分。我们已经讨论了
BiP 如何通过 Sec61 ER 转运体将蛋白质翻译后拉入 ER？
cator。与其他分子伴侣（第 6 章讨论）一样，BiP 可识别错误折叠的蛋白质以及尚未组装成最终寡聚复合物的蛋白质亚基。它通过结合暴露的疏水性氨基酸序列来实现这一点，这些序列通常隐藏在正确折叠或组装的多肽链内部。结合的 BiP 既可防止蛋白质聚集，又有助于将其保持在 ER 中（从而远离高尔基体和分泌途径的后续部分）。BiP 水解 ATP 以在高亲和力和低亲和力多肽结合状态之间穿梭。通过这种方式，BiP 定期释放其底物蛋白，让它们有机会折叠，然后如果尚未折叠，则重新折叠它们。ER 驻留蛋白蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 催化氧化？半胱氨酸上的游离巯基 (SH) 基团形成二硫键 (S}S)
(图 12?1)。几乎所有暴露于
肌醇
ER LUMEN
CYTOSOL
H2N
P
P
P
P H2N P P
C CC
NH2
N
N
N
磷酸乙醇胺
前体
蛋白
糖基磷脂酰肌醇
转酰胺酶裂解的 C 端
肽
蛋白通过
GPI 锚与
膜结合
MBoC7 m12.52/12.30
图 12?0 GPI 锚附着于 ER 中的蛋白质。 GPI 锚定蛋白通过 N 端信号序列（未显示）靶向 ER 膜，整合到膜中，并由信号肽酶处理，类似于单次跨膜蛋白（见图 12-7）。蛋白质合成完成后，前体蛋白立即通过 15-0 个氨基酸的疏水性 C 端序列锚定在 ER 膜中；蛋白质的其余部分位于 ER 腔中。在不到一分钟的时间内，ER 中的转酰胺酶将蛋白质从其膜结合的 C 端切割下来，同时将新的 C 端连接到预组装的 GPI 中间体的氨基上。糖链包含附着在脂质上的肌醇，GPI 锚的名称由此而来。它后面是葡萄糖胺和三个甘露糖。末端甘露糖与磷酸乙醇胺连接，后者提供氨基，通过酰胺键将蛋白质附着。指定这种修饰的信号包含在内质网膜腔侧的疏水性 C 末端序列和与其相邻的几个氨基酸内；如果将此信号添加到其他蛋白质中，它们也会以这种方式进行修饰。由于共价连接的脂质锚，蛋白质保持膜结合，其所有氨基酸最初暴露在内质网腔侧，最终暴露在质膜外部。
SS S
S SH
SH SH SH
SS SH
SH
ER 中的二硫键蛋白
蛋白质二硫键异构酶 (PDI) ER 腔
PDI 的再氧化
氧化 PDI
还原蛋白
还原 PDI
氧化蛋白
MBoC7 n12.104-12.31
图 12?1 ER 中二硫键的形成。含有半胱氨酸上游离巯基 (SH) 基团的蛋白质在蛋白质折叠过程中被氧化，从而形成二硫键 (S}S)。蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 含有一个分子内二硫键，该二硫键从要氧化的底物蛋白质中的游离巯基接受电子。这导致 PDI 与其底物之间形成分子间混合二硫键。然后，底物中的第二个游离巯基将其电子捐献给混合二硫键，导致底物氧化和 PDI 还原。PDI 的再氧化由其他 ER 酶（未显示）进行。
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 713 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 713 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
714 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
分泌和内吞途径中的细胞器腔？
途径中的二硫键。二硫键稳定蛋白质的折叠状态，
使其能够更好地承受严酷、多变且无伴侣的细胞外
环境。由于蛋白质通常含有多个半胱氨酸，因此它们有时会
配对不正确。PDI 通过重新排列蛋白质中的二硫键直到其正确折叠来解决此问题。这是可能的，因为 PDI 酶具有能力？
能够反向操作以减少未成熟蛋白质的错误配对二硫键。内质网腔包含多个成员在 PDI 家族中，有些 PDI 酶专门用于还原二硫键，以完全展开需要转运回胞质溶胶进行降解的错误折叠蛋白质（稍后讨论）。因此，所有 PDI 酶都是氧化还原酶，可以催化其客户蛋白质中二硫键的形成或断裂。二硫键的形成依赖于维持内质网腔中的氧化环境。由于内质网腔的还原环境，二硫键在暴露于胞质溶胶的区域很少形成。
粗面内质网中合成的大多数蛋白质都是通过添加常见的 N 连接寡糖进行糖基化的。寡糖与蛋白质的共价添加是内质网的主要生物合成功能之一。内质网中加工的可溶性和膜蛋白（包括那些注定要运输到高尔基体、溶酶体、质膜或细胞外空间的蛋白）中约有一半是以这种方式修饰的糖蛋白。胞质溶胶和细胞核中的一些蛋白质也被糖基化，但不是用大的寡糖：而是带有一种简单得多的糖修饰，其中单个 N - 乙酰葡萄糖胺基团被添加到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸上。在内质网中最常见的蛋白质糖基化形式中，预先形成的前体寡糖（含有 14 个糖，由 2 个 N - 乙酰葡萄糖胺、9 个甘露糖和 3 个葡萄糖组成）作为一个完整的单位转移到蛋白质中。由于这种寡糖被转移到蛋白质中天冬酰胺的侧链 NH 2 基团上，因此它被称为 N 连接或天冬酰胺连接
（图 12-2A）。一种称为多萜醇的特殊脂质分子（见图 2-，
第 102-03 页）将前体寡糖锚定在内质网膜上。前体寡糖通过寡糖基转移酶在单个酶促步骤中转移到目标天冬酰胺上。这种膜连接酶与 Sec61 转运蛋白结合，其活性位点暴露在腔侧
图 12-2 粗面内质网中的 N 连接蛋白糖基化。
（A）多肽链几乎在进入内质网腔后立即在目标天冬酰胺氨基酸上进行糖基化。前体寡糖（以颜色显示）仅附着在 Asn-X-Ser 和 Asn-X-Thr 序列中的天冬酰胺侧链上（其中 X 是除脯氨酸以外的任何氨基酸）。这些序列在糖蛋白中出现的频率远低于在非糖基化胞浆蛋白中出现的频率。显然，在蛋白质进化过程中存在针对这些序列的选择压力，大概是因为在不适当的位置进行糖基化会干扰蛋白质折叠。灰色框中的五种糖构成了这种寡糖的核心区域。对于许多糖蛋白来说，只有核心糖才能在高尔基体中发生的大量寡糖修剪中幸存下来（电影 13.4）。 (B) 前体寡糖从多萜醇脂质锚转移到天冬酰胺，在跨膜寡糖基转移酶复合物催化的反应中，作为完整单元。该酶的一个拷贝与内质网膜中的每个蛋白质转运蛋白相关。寡糖基转移酶含有 13 个跨膜 α 螺旋和一个大的内质网腔域，其中包含新生蛋白质和多萜醇寡糖的结合位点。天冬酰胺结合一条穿透酶内部的通道。在那里，天冬酰胺的氨基被扭转出平面，从而稳定了原本反应性较差的酰胺键，激活了它以与多萜醇寡糖反应。
ER LUMEN 转运蛋白，具有 N-糖基化位点，脂质连接寡糖，锚定在 ER 膜上
P
P
寡糖基转移酶
多肽骨架
(B) (A)
MBoC7 m12.47/12.32
N-乙酰葡萄糖胺
甘露糖
葡萄糖
天冬酰胺
侧链
C
H
CH 2
C O
NH
CYTOSOL
Asn
N
多萜醇
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714 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 715 内质网
ER 膜。这使得寡糖基转移酶能够在目标天冬酰胺在蛋白质转运过程中进入 ER 腔后立即修饰新制造的蛋白质（图 12?2B）。
前体寡糖由膜上的糖组成？
结合的多萜醇脂质。糖首先在细胞溶胶中通过形成核苷酸（UDP 或 GDP）-糖中间体被激活，然后这些中间体首先将其糖捐赠给多萜醇脂质，然后以有序的顺序捐赠给部分组装的寡糖树。在此过程中，脂质连接的寡糖？
在转运蛋白的帮助下，从细胞溶胶翻转到脂质ER 膜的内侧（图 12-3）。
N 连接寡糖是迄今为止最常见的寡糖，存在于 90% 的所有糖蛋白中。较少见的是，寡糖与丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸氨基酸侧链上的羟基相连。这些 O 连接寡糖的第一个糖在 ER 中添加。N 连接和 O 连接寡糖在高尔基体中经历广泛的加工、修饰和延伸（第 13 章），产生在成熟糖蛋白上观察到的寡糖结构的多样性。
寡糖用作标记蛋白质折叠状态的标签
长期以来，人们一直在争论为什么糖基化是如此常见的加工修饰？进入内质网的蛋白质。一个特别令人费解的观察结果是，一些蛋白质需要 N 连接糖基化才能在内质网中正确折叠，但附着在蛋白质表面的寡糖的准确位置似乎并不重要。糖基化在蛋白质折叠中的作用的线索来自对两种内质网伴侣蛋白的研究，这两种蛋白被称为钙联蛋白和钙网蛋白，因为它们的活动需要 Ca2+。这些分子伴侣是碳水化合物结合蛋白或凝集素，它们与未完全折叠的蛋白质上的寡糖结合
ER 腔 胞质溶胶
2 GlcNAc
(GlcNAc)2
(GlcNAc)2(Man)5
Man
+
5
5
膜内揊脂化
Glc
(Man)9(GlcNAc)2
Man
(Man)5(GlcNAc)2
4 X
3 X
(Glc)3(Man)9(GlcNAc)2
由多萜醇磷酸酯和 GDP-甘露糖制成的甘露糖供体
由多萜醇磷酸酯和 UDP-葡萄糖制成的葡萄糖供体
ER 膜的脂质双层
MBoC7 m12.48/12.33
多萜醇
多萜醇
多萜醇
多萜醇
多萜醇
多萜醇
多萜醇
多萜醇
多萜醇
多萜醇
CT P
CDP
GDP
GDP
UDP
UDP UMP
P
PP
PP
PP
PP
PP
PP
P
P
P
P
图 12?3 粗面内质网膜中脂质连接前体寡糖的合成。寡糖逐个组装到载体脂质多萜醇（一种聚异戊二烯类化合物；见图 2?，第 102?03 页）上。多萜醇很长，而且非常疏水：它的 22 个五碳单元可以跨越脂质双层厚度的三倍以上，因此附着的寡糖可以牢固地锚定在膜上。第一个糖通过焦磷酸桥与多萜醇相连。这种高能键激活寡糖，使其最终从脂质转移到粗面内质网腔侧生长多肽的天冬酰胺侧链上。如图所示，寡糖的合成始于内质网膜的胞质侧，并在 (Man)5(GlcNAc)2 脂质中间体通过转运蛋白（未显示）翻转穿过双层后继续在腔面上进行。内质网腔侧的所有后续糖基转移反应都涉及多萜醇-P-葡萄糖和多萜醇-P-甘露糖的转移；这些活性脂质连接单糖由内质网胞质侧的多萜醇磷酸盐和 UDP-葡萄糖或 GDP-甘露糖（视情况而定）合成，然后翻转穿过内质网膜。
GlcNAc = N-乙酰葡萄糖胺；Man = 甘露糖；Glc = 葡萄糖。
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716 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
并将它们保留在 ER 中。与其他分子伴侣一样，它们可以防止不完全折叠的蛋白质不可逆地聚集。钙联蛋白和钙网蛋白也促进不完全折叠的蛋白质与另一个 ER 分子伴侣的结合——后者与尚未形成二硫键的半胱氨酸结合。
钙联蛋白和钙网蛋白如何区分正确折叠的蛋白质和不完全折叠的蛋白质？
答案在于附着在蛋白质上的寡糖的结构。新合成的蛋白质获得 N 连接的前体寡糖后不久，ER 葡萄糖苷酶会迅速去除两个葡萄糖，留下一个末端葡萄糖。这种单糖基化的寡糖被钙联蛋白和钙网蛋白识别，确保所有新合成的（因此可能尚未折叠）糖蛋白与这些分子伴侣之一结合。最后一种葡萄糖会随着时间的推移被去除，留下一种脱葡萄糖基化的糖蛋白，不再与钙联蛋白或钙网蛋白结合。如果糖蛋白折叠，它可以离开 ER。然而，另一种 ER 酶，即葡萄糖基转移酶，会选择性地将末端葡萄糖添加到尚未完全折叠的糖蛋白上。葡萄糖随后导致未折叠蛋白与钙连接蛋白或钙网蛋白重新结合。因此，葡萄糖修剪（通过葡萄糖苷酶）和葡萄糖添加（通过葡萄糖基转移酶）驱动与钙连接蛋白和钙网蛋白的解离和重新结合循环直到新合成的未折叠蛋白质达到其完全折叠状态（图 12-4）。
折叠不正确的蛋白质从内质网输出并在胞质溶胶中降解
尽管有伴侣分子的帮助，许多转运到内质网的蛋白质分子仍未能达到其正确折叠或寡聚状态。 这些蛋白质从内质网输出回胞质溶胶，在那里它们在蛋白酶体中降解（第 6 章讨论）。 在许多方面，这种逆转位的机制与其他翻译后转位模式相似。
图 12-4 N 连接糖基化在内质网蛋白质折叠中的作用。
内质网膜伴侣蛋白钙联蛋白与 N 连接寡糖上含有一个末端葡萄糖的未完全折叠蛋白质结合，从而将蛋白质困在内质网中。葡萄糖苷酶去除末端葡萄糖可释放钙联蛋白。葡萄糖基转移酶是决定蛋白质折叠是否正确的关键酶：如果蛋白质仍未完全折叠，则酶将新的葡萄糖从 UDP-葡萄糖转移到 N 连接寡糖，从而恢复蛋白质对钙联蛋白的亲和力并将其保留在内质网中。该循环重复进行，直到蛋白质完全折叠。钙网蛋白的功能类似，只是它是一种可溶性内质网驻留蛋白。另一种 ER 伴侣蛋白 ERp57（未显示）与钙联蛋白和钙网蛋白协同作用，将未完全折叠的蛋白质保留在 ER 中。ERp57 识别游离巯基，这是二硫键形成不完整的标志。蛋白质在此循环中未正确折叠的时间越长，ER 驻留甘露糖苷酶（未显示）从 N 连接寡糖中去除末端甘露糖的可能性就越大。其他 ER 凝集素会识别甘露糖减少的修剪寡糖，从而引导多肽进行降解。因此，只有迅速折叠并离开 ER 的蛋白质才能避免被甘露糖苷酶修剪并避免降解。
葡萄糖基转移酶
钙联蛋白
ER 腔
胞质溶胶
从 ER 退出
葡萄糖苷酶
N 连接
寡糖前体
寡糖
未折叠
蛋白质
葡萄糖
修剪
UDP
UDP-葡萄糖
ER 膜
正常
折叠不完全折叠未折叠
MBoC7 m12.49/12.34
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 716 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 716 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
716 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选717 内质网
例如，与翻译后进入内质网一样，伴侣蛋白对于在转运之前和转运过程中保持多肽链处于未折叠状态必不可少。同样，需要能量源来为运输提供方向性并将蛋白质拉入细胞溶胶。最后，转运蛋白是必需的。从内质网中选择蛋白质进行降解是一个具有挑战性的过程：错误折叠的蛋白质或未组装的蛋白质亚基应该被降解，但新合成蛋白质的折叠中间体则不应该。N 链寡糖有助于做出这种区分，它们可作为计时器，测量蛋白质在内质网中停留的时间。内质网中的一种酶（甘露糖苷酶）缓慢地修剪核心寡糖树上的特定甘露糖，从而产生一种新的寡糖结构，这种结构可被内质网逆转位装置的内质网凝集素识别。如果蛋白质折叠并从内质网中离开的速度比甘露糖苷酶去除其目标甘露糖的速度快，则不会发生降解。除了内质网中识别寡糖的凝集素外，分子伴侣和蛋白质二硫键异构酶也与必须降解的蛋白质相关联。分子伴侣可防止未折叠的蛋白质聚集，二硫键异构酶可破坏可能形成错误的二硫键，从而使线性多肽链可以转运回细胞溶胶。多个转运蛋白复合物将不同的蛋白质从内质网移出。膜或腔进入胞质溶胶。转运蛋白复合物总是含有 E3 泛素连接酶（第 6 章），当未折叠的蛋白质进入胞质溶胶时，该酶将多泛素标签附着到未折叠的蛋白质上，标记它们以进行破坏。由 ATP 水解产生的能量驱动，AAA TPases 家族的六聚体 ATPase（见图 6-8）将未折叠的蛋白质拉过转运蛋白进入胞质溶胶。N-糖基化酶将附着在逆转运蛋白上的任何寡糖链全部去除。在其泛素标签的引导下，脱糖基化的多肽被迅速送入蛋白酶体，在那里被降解（图 12-5）。内质网中的错误折叠蛋白质激活未折叠蛋白质反应
细胞仔细监测各个隔室中错误折叠蛋白质的数量。例如，细胞质中错误折叠蛋白质的合成会引发热休克反应（第 6 章讨论），从而刺激编码有助于重新折叠蛋白质的细胞质伴侣的基因的转录。类似地，ER 中错误折叠蛋白质的积累会触发未折叠的
AAA-ATPase
S
S
ATP P
ADP
N-聚糖酶
泛素
E3 泛素连接酶
多泛素链
凝集素
错误折叠
蛋白质
分子伴侣
二硫化物
异构酶
蛋白质转运蛋白
复合物
蛋白酶体
胞质溶胶
ER 腔
MBOC7 m12.50/12.35
P +
识别
降解
靶向
出口
图 12?5 错误折叠 ER 蛋白质的输出和降解。
内质网腔中错误折叠的可溶性蛋白质被识别并靶向内质网膜中的转运蛋白复合物。它们首先在内质网腔中与分子伴侣、二硫键异构酶和凝集素相互作用。分子伴侣将错误折叠的蛋白质保持在未折叠构象并防止其聚集。二硫键异构酶还原二硫键以完全展开蛋白质。凝集素选择性识别当蛋白质在内质网中停留时间过长时产生的修剪的 N 连接寡糖。凝集素在围绕 E3 泛素连接酶构建的膜嵌入蛋白质转运蛋白上具有结合位点。然后，未折叠的蛋白质通过转运蛋白输出到细胞溶胶中。 E3 泛素连接酶在未折叠蛋白出现在转运蛋白的胞质侧时对其进行泛素化。泛素可防止蛋白回滑至内质网，并为完成提取反应的 AAA-ATPase 提供分子把手。然后，未折叠蛋白在蛋白酶体中去糖基化并降解。错误折叠的膜蛋白遵循类似的途径，但被认为在脂质双层内与转运蛋白侧向结合。内质网中驻留着含有不同 E3 泛素连接酶的多种转运蛋白复合物。它们被认为以不同的方式处理错误折叠的不同蛋白质子集。 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 717 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 717 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
718 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
蛋白质反应，刺激基因转录，共同提高 ER 的蛋白质包装能力。受刺激的基因编码 ER 伴侣、蛋白质逆转位和降解机制、蛋白质转运出 ER 的因子以及 ER 扩张的因子。这种多管齐下的反应通过将 ER 腔内错误折叠蛋白质的检测与进入细胞核的转录调节蛋白的产生结合起来来调节数百种基因的转录。
内质网中的错误折叠蛋白质如何向细胞核发出信号？有三条平行的途径执行未折叠蛋白质反应（图 12-6）。
第一种途径最初是在酵母细胞中发现的，它在所有真核细胞中都得到保留，并且特别引人注目。内质网中的错误折叠蛋白质导致内质网中的跨膜蛋白激酶 IRE1 自身寡聚化和磷酸化。这种激活机制类似于质膜中某些细胞表面受体激酶的激活方式（第 15 章讨论）。寡聚和磷酸化的 IRE1 使其胞浆内切核糖核酸酶结构域能够从特定的胞浆 mRNA 分子中去除内含子。IRE1 通过在两个位置切割 mRNA 来完成此任务，然后通过 RNA 连接酶将它们连接在一起。这种剪接反应产生的 mRNA 被翻译成一种活性转录调节蛋白，这种蛋白可增加未折叠蛋白反应基因子集的表达（图 12-7）。IRE1 对细胞质 mRNA 的调节剪接是所有 mRNA 剪接都发生在细胞核中并由剪接体催化的规则的一个独特例外。错误折叠的蛋白质还会激活 ER 中的第二个跨膜激酶 PERK。激活 PERK 的靶标是一种翻译起始蛋白，其磷酸化会产生两种后果。首先，整个细胞中新蛋白质的翻译减少，从而减少了需要在 ER 中折叠的蛋白质负荷。其次，当翻译起始因子稀缺时，某些蛋白质会优先翻译，其中之一就是转录调节蛋白。转录调节剂，帮助激活执行未折叠蛋白质反应的基因的转录。
最后，第三个转录调节剂 ATF6 最初合成为跨膜 ER 蛋白。由于它嵌入 ER 膜中，因此无法
图 12-6 未折叠蛋白质反应。三个平行的细胞内信号通路感知 ER 腔内错误折叠的蛋白质并导致激活n 在细胞核中转录。
每条通路都始于内质网驻留的错误折叠蛋白质传感器。当这些传感器被激活时，它们会启动不同的下游信号通路。
尽管下游机制彼此之间差异很大，但它们最终都会产生活性转录因子。转录因子的重叠靶标会产生基因产物，从而改善内质网的蛋白质处理能力并提高细胞的蛋白质降解能力。
ER 腔
ER 膜
三种错误折叠蛋白传感器
胞质溶胶
MBoC7 m12.51a/12.36
调节 mRNA 剪接启动
翻译
磷酸化失活
翻译起始因子
转录
调节蛋白 1
激活基因以增加
ER 的蛋白质折叠能力
和蛋白质降解装置
调节高尔基体中的蛋白质分解
释放
转录
调节蛋白 3
选择性
翻译
转录
调节器Y 蛋白 2
减少
进入 ER 的蛋白质
IRE1 PERK A TF6
PP PP
核糖核酸酶
结构域
激酶结构域
蛋白酶
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 718 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 718 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
718 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 719 内质网
激活细胞核内基因的转录。当错误折叠的蛋白质在 ER 中积累时，ATF6 蛋白被运送到高尔基体。高尔基体膜中的常驻蛋白酶会裂解 ATF6 的胞质结构域，ATF6 现在可以迁移到细胞核中并帮助激活编码参与未折叠蛋白反应的蛋白质的基因的转录。这种激活潜伏膜嵌入转录因子的机制类似于控制胆固醇生物合成的转录调节剂的激活方式（本章后面将讨论）。这三种途径在未折叠蛋白反应中的相对重要性在不同细胞类型中有所不同，这使得每种细胞类型都能根据其特定需求定制未折叠蛋白反应。在正常生理条件下，执行未折叠蛋白反应的信号通路用于调整 ER 容量以紧密匹配 ER 的需求。例如，在进餐后，胰腺细胞中的胰岛素产量会大幅增加。内质网（胰岛素最初组装的地方）对处理能力的需求增加，部分激活了 PERK，因此细胞可以调整胰岛素合成率，以避免内质网负担过重。在另一个例子中，当 B 细胞开始分化为抗体分泌浆细胞时，IRE1 被激活。IRE1 激活会显著扩大细胞的内质网含量，为即将在那里组装的极高水平的免疫球蛋白做好准备。未折叠蛋白质反应最终会增加蛋白质的产生，从而改善内质网中的蛋白质处理并减少错误折叠蛋白质的负担。随着体内平衡的恢复，IRE1、PERK 和 ATF6 的活性会减弱。如果无法恢复体内平衡，来自内质网的持续活跃信号，特别是通过 PERK，会激活引发细胞凋亡的基因。在多细胞生物中，消除持续功能失调的细胞通常比冒着其与邻近细胞发生异常相互作用的风险危害更小。
MBoC7 m12.51b/12.37
核
胞质溶胶
ER 伴侣 (BiP)
核孔
转录
调节器
错误折叠蛋白
与伴侣结合的错误折叠蛋白
跨膜
蛋白激酶
（传感器）
ER 腔
前 mRNA
内含子
伴侣 mRNA
伴侣
基因
核糖核酸酶
结构域
PP
mRNA
外显子
外显子
激酶
结构域
IRE1 单体
图 12?7 未折叠蛋白反应的 IRE1 肢体。受调控的 RNA 剪接是 IRE1 启动的未折叠蛋白反应通路中的关键调控开关（影片 12.4）。在正常情况下，IRE1 通过与 ER 腔内分子伴侣 BiP 结合而保持非活性状态。错误折叠蛋白水平升高通过两种机制激活 IRE1。首先，BiP 与 IRE1 分离，结合并保护错误折叠蛋白免于聚集。其次，错误折叠蛋白与 IRE1 的腔内结构域结合，促进 IRE1 寡聚体的形成。寡聚化的 IRE1 在胞质侧磷酸化自身，激活其核糖核酸酶结构域。激活的核糖核酸酶催化编码转录因子的前 mRNA 的剪接，该转录因子最终激活细胞核中的许多基因，包括编码分子伴侣的基因。升高的分子伴侣有助于降低内质网腔中错误折叠蛋白质的水平，最终关闭 IRE1 信号传导。
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 719 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 719 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
720 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
ER 组装大多数脂质双层
ER 膜是细胞中几乎所有主要脂质类别的合成位点，包括磷脂和胆固醇，这些脂质是新细胞膜生成所必需的。主要产生的磷脂是磷脂酰胆碱，它可以通过三步由胆碱、两种脂肪酸和甘油磷酸酯形成（图 12-8）。每个步骤都由 ER 膜中的酶催化，这些酶的活性位点面向细胞溶胶，所有必需的代谢物都位于细胞溶胶中。因此，磷脂合成仅发生在内质网膜的胞质小叶中。由于脂肪酸不溶于水，它们由脂肪酸结合蛋白从胞质溶胶中的合成位点引导至内质网。到达内质网膜并被辅酶 A 激活后，酰基转移酶依次将两个脂肪酸添加到甘油磷酸酯中以产生磷脂酸。磷脂酸的水不溶性足以留在脂质双层中；脂肪酸结合蛋白无法将其从双层中提取出来。因此，正是这第一步扩大了内质网脂质双层。后面的步骤决定了新形成的脂质分子的头部基团，从而决定了双层的化学性质，但不会导致净膜生长。其他两个主要成员膜磷脂——磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸（见图 10?）——以及次要磷脂——磷脂酰肌醇 (PI) 都是以这种方式合成的。由于磷脂合成发生在内质网脂质双层的胞浆小叶中，因此需要有一种机制将一些新形成的磷脂分子转移到双层的腔小叶中。在合成的脂质双层中，脂质不会以这种方式“翻转”（见图 10?）。然而，在内质网中，磷脂在几分钟内就能在膜上达到平衡，这几乎比自发“翻转”快 100,000 倍。翻牌。这种快速的跨膜运动是由一种特征不明显的磷脂转运蛋白（称为 scramblase）介导的，该蛋白非选择性地平衡
图 12-8 ER 膜上的磷脂合成。如图所示，脂肪酸通过胞浆脂肪酸结合蛋白输送到 ER，与 3-磷酸甘油酯连接，产生磷脂酸，磷脂酸可作为前体，用于制造极性头部结构不同的其他磷脂。
CoA
CoA CoA
2
CoA 2
酰基
转移酶
3-磷酸甘油
磷脂酸
MBoC7 m12.53/12.38
CH 2 CH 2 CH
OH OH
OH OH
C O
脂肪酸
C O
脂肪酸
C O
脂肪酸
C O
CH 2 CH 2 CH
OO
脂肪酸
C O
脂肪酸
C O
脂肪酸
OH C O
脂肪酸
3
2
1
酰基-CoA
连接酶
脂肪酸
结合蛋白
ER脂质双层
P
P
磷脂酰胆碱
磷脂酰乙醇胺
磷脂酰丝氨酸
磷脂酰肌醇
胞质溶胶
ER 腔
酶促修饰
头部基团
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 720 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 720 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
720 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 721 内质网
磷脂在脂质双层的两个小叶之间（图 12-9）。因此，
不同类型的磷脂被认为在
ER 膜的两个小叶之间均匀分布。
内质网还会产生胆固醇和神经酰胺（图 12-0）。神经酰胺是通过将氨基酸丝氨酸与脂肪酸缩合形成氨基醇鞘氨醇（见图 10-）而制成的；然后共价添加第二个脂肪酸以形成神经酰胺。神经酰胺被输出到高尔基体，在那里它作为两种脂质合成的前体。当寡糖添加到神经酰胺中时，会形成糖鞘脂（糖脂；见图 10-6），而鞘磷脂（第 10 章讨论）则由添加磷酸胆碱而产生。由于糖脂和鞘磷脂都是由活性位点暴露于高尔基体腔内的酶产生的，因此它们被限制在包含它们的脂质双层的非胞质小叶中。
如第 13 章所述，质膜和高尔基体、溶酶体和内体的膜都是膜系统的一部分，该系统通过运输囊泡与内质网进行通信。构成这些细胞器膜的大部分脂质是通过运输囊泡运送的膜获得的。尽管通过囊泡运输进行膜脂质交换，但每个细胞器膜的脂质组成都是不同的，并且有助于其独特身份和功能特性决定了其专业化。这种专业化是通过三种机制的组合实现的。
首先，运输囊泡的脂质组成可以不同于它要离开的细胞器，从而只将一部分脂质运送到目的地。
其次，细胞器膜上的蛋白质可以修改某些脂质的头部基团。改变脂质的身份（例如从
MBoC7 m12.54/12.39
高尔基腔
细胞溶胶
高尔基膜
从 ER
输送
新膜
翻转酶催化
特定磷脂转移到
对面单层
在高尔基体和其他细胞膜中，
磷脂分布不对称
不对称双层生长
不对称
双层生长
双层对称生长
(B)
ER 腔
细胞溶胶
在 ER 膜中，磷脂
随机分布
(A)
磷脂合成
添加到双层的胞质半层
SCRAMBLASE 催化
随机磷脂从一个单层转移到另一个单层
?lippase scramblase
CH 3
OH
CH
OH
CH 2
(CH 2 ) 12
CH
CH
CH
O
NH
(CH 2 ) 16
CH 3
C
神经酰胺
MBoC7 m12.55/12.40
图 12?9 磷脂转运蛋白在脂质双层合成中的作用。
(A) 因为新的脂质分子仅添加到 ER 的胞质半层
膜双层和脂质分子不会自发地从一个单层翻转到另一个单层，需要跨膜磷脂转运蛋白（称为
scramblase）将脂质分子从胞浆一半转移到腔内一半，从而使膜生长为双层。
scramblase 对特定的磷脂头部基团没有特异性，因此可以平衡两个单层之间的不同磷脂。
scramblase 不需要能量来催化磷脂翻转，并且可能通过为磷脂头部基团通过膜的疏水内部的被动移动提供亲水路径来发挥作用。
（B）高尔基体的膜、细胞表面和分泌和内吞途径的其他隔室是不对称的。当新膜通过运输囊泡输送时，进入的脂质必须被隔离到脂质双层的适当侧以保持其不对称性。这是由称为翻转酶的酶完成的，翻转酶将选择性磷脂从双层的一侧单向移动到另一侧。翻转酶通常将其底物（磷脂头部基团）的运输与 ATP 水解相结合，因此被认为是主动转运体（见第 11 章）。
图 12?0 神经酰胺的结构。
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 721 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 721 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
722 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
神经酰胺）或使用翻转酶将某些磷脂从膜的一个叶片移动到另一叶片（图 12?9B）。第三，特定脂质可以通过非囊泡运输途径选择性地从一个膜转移到另一个膜，如下所述。
ER 和其他细胞器之间的膜接触位点
促进选择性脂质转移
线粒体和质体不通过囊泡转移与 ER 通信？
端口，因此它们需要不同的机制从 ER 进口许多脂质用于生长。胞质溶胶中的载体蛋白称为脂质转移蛋白，在膜之间运送单个脂质分子，其功能与脂肪酸结合蛋白非常相似，后者引导脂肪酸通过胞质溶胶（见图 12-8）。在许多情况下，脂质转移蛋白在细胞器接触点起作用，其中起始膜和目标膜通过特定的连接复合物保持在 10-0 纳米范围内。不同的脂质转移蛋白将磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸从 ER 运送到接触点的线粒体。连接复合物或脂质转移蛋白的破坏会损害脂质进入线粒体并导致其功能障碍。 ER 的广泛网络参与与大多数其他细胞器的接触点（图 12-1）。与内质网膜接触位点（见图 12-6）一样，这些其他细胞器接触位点的主要功能之一是交换脂质（图 12-2）。细胞含有几种脂质转移蛋白家族。这些蛋白通常可以结合一种特定脂质分子（或在某些情况下结合多种相关脂质），并具有可与特定细胞膜相互作用的额外结构域。通过这种方式，它们充当穿梭蛋白，对供体和受体膜以及它们运输的脂质具有独特的特异性。两个细胞器膜之间的接触位点有利于募集结合这些膜的脂质转移蛋白s，从而提高脂质交换的效率。胆固醇使用专门的运输系统从溶酶体（在溶酶体中以脂蛋白中的胆固醇酯形式输送）到质膜和细胞内的其他位置（如我们在第 13 章中讨论的那样）。
(A)
与 ER 的接触点
(B)
MBoC7 n12.107-12.41
质膜
ER 线粒体
1 祄
脂质转移蛋白中的脂质
10?0 nm
连接复合物
ER
膜
线粒体
外膜
MBoC7 n12.105/12.42
(A) (B)
脂质转移蛋白中的脂质模拟物
图 12?1 ER 与小鼠神经元内几种细胞器之间的空间关系。通过聚焦离子束扫描电子显微镜分析了小鼠大脑中神经元细胞体的一部分。 (A) 从连续电子显微镜图像重建的主要细胞器的三维位置，并以不同颜色显示。
ER（黄色）与所有主要细胞器和质膜紧密接触。 (B) 重建的线粒体（绿色）与接触 ER（红色）的区域一起显示。
（A 和 B，来自 Y. Wu 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114：E4859✎4867，2017。）
图 12-2 脂质在细胞器接触点的转移。 (A) 锚定在两个不同膜上的蛋白质（所示示例中的 ER 和线粒体）相互作用，使膜保持 10-0 nm 的距离。
专门的脂质转移蛋白被招募到这些接触点，或者在某些情况下成为连接复合物的一部分。这些转移蛋白具有腔体，可以结合脂质并促进其从一个膜移动到另一个膜。（B）一种这样的转移蛋白的结构显示其腔内结合有脂质样分子。 （PDB 代码：4P42。）
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 722 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 722 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
722 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 723 过氧化物酶体
摘要
广泛的 ER 网络充当生产几乎所有细胞脂质的工厂。此外，细胞蛋白质合成的大部分发生在粗面内质网的胞质表面：几乎所有要分泌或进入内质网本身、高尔基体、溶酶体、内体和质膜的蛋白质都首先从胞质溶胶进入内质网。在内质网腔中，蛋白质折叠和寡聚化，形成二硫键，并添加 N 连接的寡糖。N 连接的糖基化模式用于指示蛋白质折叠的程度，因此蛋白质只有在正确折叠时才会离开内质网。未正确折叠或寡聚化的蛋白质被转运回胞质溶胶，在那里它们被去糖基化、多泛素化并在蛋白酶体中降解。如果错误折叠的蛋白质在内质网中过量积累，它们会触发未折叠蛋白质反应，从而激活细胞核中的适当基因以帮助内质网应对。只有携带特殊内质网信号序列的蛋白质才会被输入内质网。信号识别颗粒 (SRP) 识别信号序列，该颗粒结合正在生长的多肽链和核糖体，并将它们引导至粗糙内质网膜胞浆表面上的受体蛋白。这种与内质网膜的结合启动了转运过程，该过程使多肽链环通过蛋白质转运蛋白的亲水孔穿过内质网膜。可溶性蛋白质——注定要进入内质网腔、分泌或转移到其他细胞器腔——完全进入内质网腔。跨膜蛋白被送往内质网或其他细胞膜，通过其多肽链中的一个或多个跨膜α螺旋片段锚定在内质网膜上。当这些蛋白质的疏水部分从核糖体中出来时，它们会被蛋白质转运蛋白识别，从而为进入膜提供通道。当多肽含有多个疏水片段时，它将作为多次跨膜蛋白来回穿过双层膜多次。内质网中蛋白质插入和糖基化的不对称性决定了内质网为所有其他细胞器提供膜蛋白的膜的侧性。脂质在内质网的胞浆表面合成，在脂质双层的两个小叶之间保持平衡，并经常通过位于细胞器间连接处的脂质转移蛋白运输到其他细胞器。特定的翻转酶在质膜中建立并维持脂质不对称，进一步促进其侧性。
过氧化物酶体
过氧化物酶体是氧气利用的主要场所，几乎存在于所有真核细胞中。它们含有氧化酶，例如过氧化氢酶和尿酸氧化酶e，浓度如此之高，以至于在某些细胞中，过氧化物酶体由于存在晶体状蛋白质核心而在电子显微照片中脱颖而出（图 12-3）。过氧化物酶体的进化起源尚未确定，但人们普遍认为它们代表了构成分泌和内吞途径的膜系统的一个特殊分支。一种假设是，过氧化物酶体是一种古老细胞器的遗迹，它在真核细胞的原始祖先中完成了所有的氧气代谢。当光合细菌产生的氧气首次在大气中积累时，它对大多数细胞都是有剧毒的。过氧化物酶体可能降低了细胞内的氧气浓度，同时也利用了它的化学反应性来进行有用的氧化反应。根据这种观点，后来的发展？线粒体的取代使得过氧化物酶体对细胞代谢的重要性降低，因为许多以前在过氧化物酶体中进行的不产生能量的生化反应现在通过氧化磷酸化与 ATP 形成相结合。因此，目前细胞中过氧化物酶体进行的氧化反应可能部分是其功能未被线粒体取代的反应。
细胞核
过氧化物酶体
线粒体
质体
内质网
MBoC7 mp666/12.C
胞质溶胶
质膜和细胞外部
高尔基体
晚期内体
溶酶体
早期内体
分泌性
囊泡
胞质溶胶
200 nm
MBoC7 m12.27/12.43
图 12?3 大鼠肝细胞中三个过氧化物酶体的电子显微照片。
准晶态、电子致密内含体
主要由尿酸氧化酶组成。 （由 Daniel S. Friend 提供，经 E.L. Bearer 许可。）
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 723 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 723 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
724 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
过氧化物酶体使用分子氧和过氧化氢进行氧化反应
过氧化物酶体之所以如此命名，是因为它们通常含有一种或多种酶，这些酶利用分子氧从特定有机底物（此处指定为 R）中去除氢原子，从而产生过氧化氢（H2O2）：
RH2 + O2 ? R + H2O2
过氧化氢酶利用细胞器中其他酶产生的 H 2O2，通过“过氧化”反应氧化各种底物，包括甲酸、甲醛和酒精： H 2O2 + R'H2 ? R' + 2H 2O。这种氧化反应在肝脏和肾脏细胞中尤为重要，过氧化物酶体会将进入血液的各种有害分子解毒。我们喝的乙醇中约有 25% 以这种方式氧化成乙醛。此外，当过量的 H2O2 在细胞中积累时，过氧化氢酶会通过反应 2H2O2 ? 2H2O + O2 将其转化为 H2O
过氧化物酶体中进行的氧化反应的主要功能是分解脂肪酸分子。该过程称为 b 氧化，每次以两个碳原子为单位依次缩短脂肪酸的烷基链，从而将脂肪酸转化为乙酰辅酶 A。然后，过氧化物酶体将乙酰辅酶 A 输出到细胞质中，用于生物合成反应。在哺乳动物细胞中，氧化发生在线粒体和过氧化物酶体中；然而，在真菌和植物细胞中，这种基本反应仅发生在过氧化物酶体中。动物过氧化物酶体的一个重要生物合成功能是催化缩醛磷脂形成的第一个反应。这种丰富的磷脂类存在于所有人类细胞中，但在脑中尤其丰富，它是髓鞘的主要成分（图 12-4）。缩醛磷脂缺乏会导致促黄体生成素缺乏症。发现神经细胞轴突髓鞘形成异常，这是许多过氧化物酶体疾病导致神经系统疾病的原因之一。过氧化物酶体是异常多样化的细胞器，即使在单个生物体的各种细胞类型中，它们也可能含有不同的酶组。例如，大多数植物有两种主要类型的过氧化物酶体（图 12-5）。一种存在于叶子中，参与光呼吸（第 14 章讨论）。另一种过氧化物酶体存在于发芽的种子中，它将种子脂质中储存的脂肪酸转化为幼苗生长所需的糖。由于这种脂肪向糖的转化是通过一系列称为乙醛酸循环的反应完成的，因此这些过氧化物酶体也称为乙醛酸酶体。在乙醛酸循环中，过氧化物酶体中脂肪酸分解产生的两分子乙酰辅酶 A 用于制造琥珀酸，琥珀酸随后离开过氧化物酶体并在细胞质中转化为葡萄糖。乙醛酸循环不会在动物细胞中发生，因此动物无法将脂肪转化为碳水化合物。
除了跨不同细胞类型或生物体进行多样化之外，过氧化物酶体还能适应细胞内不断变化的条件。例如，在糖上生长的酵母有几个小的过氧化物酶体。但是，当一些酵母在甲醇上生长时，会形成许多大的过氧化物酶体，这些过氧化物酶体会氧化甲醇；而当在脂肪酸上生长时，它们会形成许多大的过氧化物酶体，这些过氧化物酶体会通过氧化将脂肪酸分解为乙酰辅酶 A。
短信号序列指导蛋白质进入过氧化物酶体
组成过氧化物酶体的蛋白质通过两种不同的途径传递（图 12-6）。在第一种途径中，过氧化物酶体膜的一些整合膜蛋白首先使用 ER 驻留蛋白 Sec61 转运蛋白插入 ER。然后这些过氧化物酶体蛋白被包装成老化成专门的过氧化物酶体前体囊泡。新的前体囊泡
图 12-4 缩醛磷脂的结构。缩醛磷脂在保护神经细胞轴突的髓鞘中非常丰富。它们构成了髓鞘膜磷脂的约 80-0%。除了乙醇胺头部基团和与磷脂相同的甘油磷酸骨架连接的长链脂肪酸外，缩醛磷脂还含有一种不寻常的脂肪醇，该脂肪醇通过黄色突出显示的醚键连接（左下角）。
CH 2 CH 2 NH 3
CH 2
CH 2
CH
CH
(CH 2 ) n
CH 3
(CH 2 ) n
CH 3
CH CH 2
O
O O
O
O
O
P
C
MBoC7 m12.28/12.44
+
髓鞘
轴突
纤溶酶原
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724 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 725然后，过氧化物酶体相互融合形成新的过氧化物酶体，或与现有的过氧化物酶体融合以促进其生长。在第二种途径中，过氧化物酶体蛋白可以直接从胞质溶胶输入到预先存在的过氧化物酶体中。位于许多过氧化物酶体蛋白 C 端的三个氨基酸（Ser 半胱氨酸）的特定序列起着输入信号的作用（见图 12-3）。其他过氧化物酶体蛋白在 N 端附近含有稍长且部分疏水的信号序列。如果任一序列附着在胞质溶胶蛋白上，则该蛋白质被输入到过氧化物酶体中。过氧化物酶体蛋白的输入由 ATP 水解驱动，并利用一组称为过氧化物酶的蛋白质来催化输入循环。 C 末端过氧化物酶体分选信号由胞质溶胶中的过氧化物酶体 Pex5 识别。
该输入受体随其货物一路进入过氧化物酶体膜中的蛋白质转运体。货物在过氧化物酶体内部释放后，Pex5 被回收回胞质溶胶。此回收步骤需要用泛素修饰 Pex5，泛素被 Pex1 和 Pex6 组成的 ATPase 复合物用作手柄。Pex1 和 Pex6 复合物利用 ATP 水解的能量从过氧化物酶体中释放 Pex5，以便它可以拾取下一个货物分子。
图 12-6 解释过氧化物酶体如何增殖以及新过氧化物酶体如何产生的模型。过氧化物酶体前体囊泡从 ER 中萌芽。
至少有两种过氧化物酶体膜蛋白 Pex3 和 Pex15 遵循此路线。驱动出芽反应并仅选择过氧化物酶体蛋白包装到这些囊泡中的机制依赖于 Pex19 和其他尚不清楚的细胞质蛋白。过氧化物酶体前体囊泡可能彼此融合或与预先存在的过氧化物酶体融合。过氧化物酶体膜含有输入受体和蛋白质转运蛋白，它们是输入在细胞质核糖体上产生的过氧化物酶体蛋白所必需的，包括输入受体和转运蛋白成分的新副本。据推测，生长所需的脂质也被输入，尽管有些脂质可能直接来自过氧化物酶体前体囊泡膜中的 ER。
图 12-5 植物细胞中发现的两种过氧化物酶体的电子显微照片。（A）烟草叶叶肉细胞中具有
副晶核的过氧化物酶体。它与叶绿体的密切联系被认为促进了
光呼吸过程中这些细胞器之间的物质交换。植物细胞中的液泡相当于动物细胞中的
溶酶体。（B）番茄种子发芽 4 天后储存脂肪的子叶细胞中的过氧化物酶体。在这里
过氧化物酶体（糖基化酶体）与储存脂肪的脂滴相关，反映了它们在种子发芽过程中脂肪动员和糖异生中的核心作用。 （A，？1969 年 S.E. Frederick 和 E.H. Newcomb。最初发表于 J. Cell Biol. https://doi.org/10.1083/jcb.43.2.343。经洛克菲勒大学出版社许可。B，来自
W.P. Wergin 等人，J. Ultrastruct. Res. 30:533-57，1970 年。Wi经 Elsevier 许可。)
(A)
液泡
过氧化物酶体
线粒体
叶绿体
1 祄
(B)
脂滴
糖酵解体
1 祄
MBoC7 m12.29/12.45
子过氧化物酶体
通过从胞质溶胶中吸收特定过氧化物酶体蛋白和脂质进行裂变生长
过氧化物酶体 过氧化物酶体前体
囊泡
过氧化物酶体前体蛋白
MBoC7 m12.30/12.46
内质网
催化蛋白质输入的特定蛋白质
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726 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
N 端过氧化物酶体信号序列由过氧化物酶体 Pex7 识别。
Pex7 过氧化物酶体复合物与其他附属过氧化物酶体一起似乎参与了类似于 Pex5 介导的输入循环。
过氧化物酶体膜中的蛋白质转运蛋白由至少六种不同的过氧化物酶体组成。与 ER 中的蛋白质转运蛋白不同，过氧化物酶体转运蛋白可以将完全折叠甚至寡聚的蛋白质转运过膜。为了允许大分子和不同大小的货物分子通过，转运蛋白被认为能够动态地适应要运输的特定货物分子的大小。目前尚不清楚如何利用如此大的孔隙进行运输，而不会在胞质溶胶和过氧化物酶体之间发生内容物泄漏。
人类遗传病 Zellweger 综合征证明了蛋白质进入过氧化物酶体的重要性。十几种不同的过氧化物酶中的任何一种发生突变，最常见的是 Pex1，都会导致过氧化物酶体蛋白质输入受损。这些个体的细胞含有“空”过氧化物酶体，积累了通常在过氧化物酶体中分解的非常长链和支链脂肪酸。此外，他们缺乏缩醛磷脂。
这些代谢障碍会导致个体的大脑、肝脏和肾脏出现严重异常，并在出生后不久死亡。
摘要
过氧化物酶体专门利用分子氧进行氧化反应。它们产生过氧化氢，用于氧化目的，并含有过氧化氢酶来破坏过量。所有过氧化物酶体蛋白都在细胞核中编码。其中一些蛋白质通过从内质网萌发的过氧化物酶体前体囊泡传送到过氧化物酶体，但大多数蛋白质是在细胞质中合成并直接输入的。许多后者蛋白质的 C 端附近的三个氨基酸的特定序列作为过氧化物酶体输入信号，由细胞质中的互补输入受体识别。进口通过过氧化物酶体膜中的蛋白质转运体进行，这与内质网中的蛋白质转运体不同，因为大而完全折叠的蛋白质从细胞质中进口时不展开。
蛋白质进入线粒体和叶绿体的过程
线粒体和叶绿体（绿藻和植物细胞中一种特殊的质体）是双层膜封闭的细胞器。它们专门用于 ATP 合成，利用来自线粒体中的电子传递和氧化磷酸化以及叶绿体中的光合作用的能量（第 14 章讨论）。虽然这两种细胞器都含有自己的 DNA、核糖体和蛋白质合成所需的其他成分，但几乎所有蛋白质都在细胞核中编码并从细胞质中进口。每种输入的蛋白质都必须到达其发挥作用的特定细胞器亚区室。线粒体中的不同亚区室由两个同心的线粒体膜形成（图 12-7A）：内线粒体膜，包围基质空间并形成称为嵴的广泛内陷，以及与细胞质接触的外线粒体膜。内膜和外膜之间的空间细分为嵴空间和膜间隙，在嵴内陷的连接处有蛋白质复合物。叶绿体具有外膜和内膜，它们包围膜间隙，以及基质，基质是叶绿体中线粒体基质空间的等价物（图 12-7B）。它们有一个额外的亚区室，即类囊体空间，被类囊体膜包围。类囊体膜在质体发育过程中从内膜衍生而来，并被夹断以与内膜不连续。线粒体和叶绿体中的每个亚区室都含有一组不同的蛋白质。
细胞核
过氧化物酶体
线粒体
质体
内质网
MBoC7 mp658/12.B
胞质溶胶
质膜和细胞外部
高尔基体
晚期内体
溶酶体
早期内体
分泌性
囊泡
胞质溶胶
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 726 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 726 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
726 章节r 12：细胞内组织和蛋白质分选 727 蛋白质进入线粒体和叶绿体的过程
新的线粒体和叶绿体是由预先存在的细胞器生长产生的，然后是裂变（第 14 章讨论）。生长主要取决于从细胞质中输入蛋白质。蛋白质进入线粒体和叶绿体的许多核心原理与我们之前讨论过的蛋白质进入内质网的类似过程相似。然而，多个膜和亚区室的存在增加了将新输入的蛋白质运送到正确位置的复杂性。本节解释了它是如何发生的。
转运到线粒体依赖于信号序列和蛋白质转运蛋白 一个或多个信号序列将所有线粒体前体蛋白引导至其适当的线粒体亚区室。许多进入基质空间的蛋白质在其 N 端含有信号序列，该序列在输入后会被信号肽酶迅速去除。其他输入的蛋白质，包括所有外膜和许多内膜和膜间空间蛋白质，都有未被去除的内部信号序列。信号序列对于蛋白质的输入和正确定位既是必要的也是充分的：当使用基因工程技术将这些信号与细胞质蛋白质连接时，信号会将蛋白质引导至正确的线粒体亚区室。因此，信号假说的原理旨在解释蛋白质如何分离到 ER，也适用于线粒体。多亚基蛋白复合物作为蛋白转运蛋白，介导蛋白穿过或进入线粒体膜（图 12-8A）。为了提供进入每个线粒体亚区的通道，蛋白转运蛋白复合物位于线粒体内膜和外膜中。一般来说，每个转运蛋白都有能力识别特定类型的信号，并充当穿过或进入其所在膜的导管。这些转运蛋白一起将约 1500 种不同的前体蛋白从细胞溶胶引导到线粒体的适当亚区：外膜、膜间隙和嵴间隙、内膜和基质空间。前体蛋白中信号的组织最终控制前体蛋白与哪种转运蛋白结合以及信号到达线粒体内蛋白质最终目的地的顺序。这个组合双链系统意味着有时有不止一条路线可以到达某个特定目的地，就像不同的地铁线路可以带你从布鲁克林到纽约时代广场一样。例如，位于线粒体内膜的膜蛋白至少使用三条路线到达那里。图 12-8B 显示了到达每个线粒体亚区室的可能路线以及引导蛋白质到达那里的转运蛋白复合物。TOM 复合物是几乎所有细胞核内编码的线粒体蛋白质的输入所必需的。它最初识别它们的信号序列并进行传输
(A) 线粒体 (B) 叶绿体
外膜 基质空间
膜间
空间
嵴
空间
内膜
外膜
基质空间
膜间
空间
内膜
类囊体
膜
类囊体
空间
MBoC7 m12.19/12.47
图 12?7 线粒体和叶绿体的亚区室。与线粒体的嵴（A）相反，叶绿体的类囊体（B）不与内膜相连，因此形成一个密封的连续隔室，具有单独的内部空间。
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 727 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 727 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
728 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
它们从细胞溶胶进入膜间隙。从这里开始，不同的线粒体蛋白质根据蛋白质中编码的序列特征遵循不同的路线。外膜中特别丰富的桶状蛋白被传递到 SAM 复合物，以便插入和折叠在外膜中。两种不同的 TIM 复合物介导内膜上的蛋白质运输。基质蛋白使用 TIM23 复合物进行运输，而内膜蛋白使用 TIM22 复合物、TIM23 复合物或 OXA 复合物进行插入。其余蛋白质留在膜间隙中，在那里发挥作用。除了必须从细胞质中输入的 ~99% 的线粒体蛋白质外，所有真核生物的线粒体基因组都编码了少量膜蛋白。这些蛋白质由线粒体核糖体合成，并由 OXA 复合物插入内膜。线粒体编码的膜蛋白质与从胞质溶胶中输入的核编码膜蛋白组装形成功能性蛋白质复合物，例如用于产生能量的呼吸链复合物（见第 14 章）。细胞如何在线粒体和细胞核之间进行通信以确保构建内膜复合物的蛋白质的平等表达尚不清楚。
线粒体蛋白质在翻译后作为未折叠的多肽链输入
正如我们在前面的部分中了解到的，蛋白质转运到内质网通常发生在蛋白质由与内质网蛋白质转运蛋白紧密结合的核糖体合成时。蛋白质输入过程中核糖体与转运蛋白的结合使粗糙内质网具有其特征性外观。
受体
TOM 复合物 SAM
复合物
MIM1
复合物
TIM23 复合物 TIM22
复合物
OXA
复合物
胞质溶胶
基质
空间
膜间
空间
易位
通道
外线粒体
膜
内线粒体
膜
MBoC7 m12.21/12.48
导入
TPase
蛋白进入和穿过
线粒体膜
(A) (B)
核编码
蛋白
线粒体
编码
蛋白
图 12?8 线粒体膜中的蛋白质转运蛋白。 (A) TOM、TIM、SAM、MIM 和 OXA 复合物是多聚膜蛋白组装体，可催化蛋白质跨线粒体膜转运。
排列在输入通道上的 TIM22 和 TIM23 复合物的蛋白质成分在结构上相关，表明这两种 TIM 复合物具有共同的进化起源。在基质方面，TIM23 复合物与含有线粒体 hsp70 的多聚蛋白质复合物结合，后者充当输入 ATPase，利用 ATP 水解将蛋白质拉过孔隙。在动物细胞中，转运蛋白复合物的亚基组成存在细微变化，以使线粒体输入机制适应特定细胞类型的特殊需求。 (B) 在细胞溶胶中合成的新蛋白质可以使用多种途径到达最终目的地。通过不同蛋白质复合物的已知路线显示为绿线。蛋白质嵌入线粒体内膜和外膜的途径有多种，包括在基质空间中合成的线粒体编码蛋白质的途径之一。SAM = 分选和组装机制；OXA = 细胞色素氧化酶活性；TIM = 线粒体内膜转运蛋白；TOM = 外膜转运蛋白；MIM = 线粒体输入机制。
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 728 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 728 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
728 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 729 蛋白质进入线粒体和叶绿体的运输
相反，线粒体外膜中的蛋白质转运蛋白
不与核糖体结合，大多数线粒体蛋白质通过
翻译后机制导入。这就是为什么在
线粒体表面观察到的核糖体非常少。
与内质网易位一样，线粒体蛋白质的输入可以在试管中通过无细胞反应重建。在这样的实验中，将放射性标记的线粒体前体蛋白与纯化的线粒体混合，以允许其输入细胞器。通过改变试管中的条件，可以确定输入的生化要求、捕获过程中的中间体以及确定使用了哪些转运蛋白。我们对线粒体输入分子机制的大部分了解来自无细胞反应分析。线粒体前体蛋白在合成后不会立即折叠成其天然结构；相反，它们通过与其他蛋白质的相互作用在细胞溶胶中保持未折叠状态。这些相互作用蛋白中的一些是 hsp70 家族的一般伴侣（第 6 章讨论），而其他一些则专门用于线粒体前体蛋白并直接与其信号序列结合。所有相互作用蛋白都有助于防止前体蛋白在与线粒体外膜中的 TOM 复合物结合之前自发聚集或折叠。作为输入过程的第一步，TOM 复合物的输入受体结合线粒体前体蛋白的信号序列。然后，随着胞浆相互作用蛋白被剥离，未折叠的多肽链首先被信号序列馈送到 TOM 复合物内的转运通道。一旦转运蛋白突出到膜间隙，多肽链内的序列将决定接下来会发生什么。例如，前往基质或内膜的蛋白质与 TIM 复合物之一结合，并跨过或插入内膜。有可能快速冷却细胞外线粒体输入反应，以在转运过程中的中间步骤中阻止蛋白质。对被阻止进入基质的蛋白质进行检查的实验表明，它跨越了线粒体内膜和外膜：其 N 端信号序列已被位于基质中的信号肽酶去除，而蛋白质的 C 端部分仍然暴露在线粒体外。因此，我们可以得出结论，前体蛋白质可以同时穿过两个线粒体膜进入基质空间（图 12-9）。
MBoC7 e15.11b/12.49
前体
蛋白
信号
序列
外线粒体膜
内线粒体膜
胞质溶胶
基质
空间
裂解
信号肽
成熟
线粒体
蛋白
TIM23
复合物
通过 TOM 复合物插入
膜
结合
导入受体
通过信号肽酶裂解
通过 TIM23 复合物 TOM 复合物转位
进入基质
+
AT P
ADP P
胞质 hsp70
分子伴侣
图 12?9 线粒体导入蛋白质。线粒体前体蛋白的 N 端信号序列被 TOM 复合物的受体识别，而蛋白质的其余部分则由细胞质 hsp70 分子伴侣保持未折叠状态。然后，蛋白质通过 TIM23 复合物转移，从而暂时跨越两个线粒体膜（电影 12.5）。信号序列被基质空间中的信号肽酶切割，形成成熟的蛋白质。然后，游离信号序列迅速降解（未显示）。
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 729 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 729 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
730 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
尽管 TOM 和 TIM 复合物通常协同作用，同时将前体蛋白转运到两个膜上，但它们能够独立运行。例如，在分离的外膜中，TOM 复合物可以将前体蛋白的信号序列转运到膜上。同样，如果通过实验从分离的线粒体中去除外膜，暴露的 TIM23 复合物可以有效地将前体蛋白导入基质空间。通过实验将通常相连的过程解偶联，可以更详细地研究和理解每个步骤和转运系统。
蛋白质输入由 ATP 水解、膜电位和氧化还原电位提供动力 蛋白质的定向运输需要能量（图 12-0）。线粒体蛋白质输入利用四个离散位点的三种不同能量来源。ATP 是大多数生物系统中的常见燃料，在其中两个位置使用：线粒体外和基质内。另外两个能量来源由跨线粒体内膜的膜电位和电子传递链的氧化还原电位贡献。并非所有线粒体前体蛋白都需要这些能量来源才能到达最终目的地。
大多数线粒体前体蛋白在转运过程的初始阶段都需要能量，能量的初始使用有助于在输入之前将多肽保持在未折叠状态（见图 12-9）。如第 6 章所述，
减少要输入的蛋白质
SH SH
SH
SH SH SH
S S
S
SH
S
S
S
S
SH
Mia40 的识别和氧化
呼吸链的再氧化
Mia40 的还原，
输入蛋白质的氧化 Mia40
TOM 复合物
MBoC7 m12.23/12.50
+
+
?
++
?
+
?
+
枛
AT P ADP
P
+
?
+
?
+
?
+
?
+
+
?
+
?
+
?
+
枛
+
+
?
+
?
+
?
+
?
膜电位
内膜
内膜
内膜
外膜
(A) 来自膜电位的能量
(B) 来自 ATP 水解的能量
(C) 来自氧化还原电位的能量
线粒体
hsp70（进口 ATPase 的一部分）
进口 ATPase
TIM23 复合物中的能量依赖性构象变化
图 12?0 能量在蛋白质进口到线粒体中的作用。三种不同的能量来源用于将蛋白质导入线粒体。
（A）在信号序列和多肽链的相邻部分首次插入 TOM 复合体转位通道（未显示）后，信号序列与 TIM23 复合体（橙色）相互作用。然后，信号序列被转位到基质空间，这个过程需要跨内膜的膜电位中的能量。信号序列中带正电的氨基酸促进了这种膜电位依赖性转位反应。（B）线粒体 hsp70 是导入 ATPase 复合物的一部分，当多肽链区域暴露在基质空间中时，它会与这些区域结合，利用 ATP 水解的能量将蛋白质拉过转位通道。（C）具有多个半胱氨酸可以通过 TOM 复合物的部分易位采样膜间隙。在膜间隙中，这些半胱氨酸被酶 Mia40 氧化为二硫键，该酶在此过程中被还原。氧化的多肽现在部分折叠，防止其滑回细胞溶胶。还原的 Mia40 被呼吸链提供的电子重新氧化，因此它可以在输入反应中再次发挥作用。 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 730 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 730 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
730 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 731 蛋白质进入线粒体和叶绿体的运输
执行此任务的分子伴侣使用 ATP 结合和水解循环来
控制它们与新合成的多肽的相互作用。分子伴侣相互作用是防止细胞溶胶中过早折叠所必需的，而分子伴侣解离是允许通过 TOM 复合物进行运输所必需的。
一旦信号序列通过 TOM 复合物并与 TIM 复合物结合，进一步通过 TIM 转运通道的转运需要膜电位（图 12?0A），它是跨内膜的电化学 H + 梯度的电成分（见图 11?）。由内膜中的电子传输过程（在第 14 章中讨论）驱动，将 H+ 从基质空间泵送到膜间隙，从而维持电化学梯度。跨内膜的电化学 H+ 梯度中的能量通过电泳驱动带正电荷的信号序列通过 TIM 复合物的转运。相同的 H + 梯度还为线粒体内膜中的 ATP 合酶复合物提供大部分细胞 ATP 合成的能量。一旦前体蛋白的初始片段到达基质，线粒体 hsp70 对于完成输入过程至关重要，类似于 BiP 对于将翻译后蛋白质输入 ER 的作用。线粒体 hsp70 与 TIM23 复合物的基质侧结合，并充当将前体蛋白拉入基质空间的马达。与其胞浆表亲一样，线粒体 hsp70 对未折叠的多肽链具有很高的亲和力，并且一旦输入的蛋白质链从基质空间中的 TIM 转运蛋白中出现，它就会紧密结合该蛋白质链。然后，hsp70 经历 ATP 依赖性构象变化，在释放被输入的蛋白质之前对其施加拉力。这种能量驱动的结合、牵引和释放循环持续进行，直到蛋白质通过 TIM23 复合物完成输入（图 12-0B）。许多输入的基质蛋白被传递给另一种伴侣蛋白线粒体 hsp60，以帮助它们通过 ATP 水解循环折叠（见第 6 章）。某些含有半胱氨酸基序的膜间隙蛋白利用细胞质和线粒体之间的氧化还原电位差异作为能量来源。当这些蛋白质的一部分最初进入膜间隙时，它们与 Mia40 蛋白形成瞬时共价二硫键（图 12-0C）。这种相互作用可防止蛋白质通过 TOM 复合物倒退到细胞质中。输入的蛋白质最终以含有链内二硫键的氧化形式从 Mia40 中释放出来，结果？折叠蛋白现在被困在膜间隙中。Mia40 在此过程中被还原，然后通过将电子传递到线粒体内膜中的电子传输链而被重新氧化。这样，储存在线粒体电子传输链中的氧化还原电位中的能量就被用来驱动蛋白质的输入。
进入线粒体内膜的运输通过几种途径进行
线粒体内膜中的三种不同的转运蛋白（见图 12-8）都能够插入膜蛋白。不同亚群的线粒体内膜蛋白通过不同的途径到达这些转运蛋白之一，从而插入膜中。在最常见的转运途径中，从细胞质中开始的前体使用 TOM 和 TIM23 复合物开始输入基质中。然而，只有运输蛋白的 N 端信号序列才能真正进入基质空间（图 12-1A）。TIM23 复合物将位于 N 端信号序列之后的疏水性氨基酸序列识别为跨膜结构域。这允许跨膜结构域插入内膜并防止进一步转位到基质中，可能是通过类似于 ER 驻留 Sec61 转运蛋白中的侧门。蛋白质的其余部分通过 TOM 复合物进入膜间隙lex，信号序列在基质中被切割。
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 731 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 731 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
732 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
通往内膜的第二条运输路线专门用于代谢物特异性转运蛋白家族，它们将大量小分子转移到内膜上。这些转运蛋白为线粒体基质中的代谢酶（例如柠檬酸循环中的酶）提供底物，并将其产物运回细胞溶胶。这些多通道跨膜蛋白？蛋白利用内部信号序列通过 TOM 复合物进入膜间隙。它们与膜间隙分子伴侣结合，后者引导它们进入 TIM22 复合物，疏水性跨膜区域在此划分为内膜。此插入过程需要膜电位来确保蛋白质的适当区域被运输到基质侧，以便转运蛋白获得正确的拓扑结构（图 12-1B）。进入内膜的最终途径是使用 OXA 复合物。如前所述，OXA 复合物还插入在线粒体基质中编码和翻译的少数膜蛋白（图 12-1C）。因此，只能从膜的基质侧访问 OXA 复合物。因此，依赖 OXA 复合物插入的核编码膜蛋白必须首先使用 TIM23 转位到基质中（图 12-1D）。
在这里，N 端信号序列被移除以暴露疏水信号序列，然后 OXA 复合物使用该序列插入内膜。
裂解位点 信号序列 第二信号序列 MBoC7 m12.25/12.51 (D) (C) 信号序列 (A) 跨膜片段 (B) 胞质溶胶 内膜蛋白 内膜蛋白 TOM 复合物 TIM23 复合物 OXA 复合物 OXA 复合物 MA TRIX SP ACE 裂解位点 ++ +??膜间空间伴侣内膜蛋白 TIM22 复合物线粒体
蛋白质合成
内膜
蛋白
图 12?1 线粒体内膜蛋白的生产途径。（A）N 端信号序列
（红色）启动进入基质空间的输入（见图 12?9）。基质靶向信号序列后的疏水跨膜片段（蓝色）与内膜中的 TIM23 转运蛋白（橙色）结合并停止转运。蛋白质的其余部分随后通过外膜中的 TOM 转运蛋白被拉入膜间隙，跨膜片段被释放到内膜中，将蛋白质锚定在那里。（B）作为代谢物转运蛋白发挥功能的多通道内膜蛋白含有内部信号序列并以环状蜿蜒穿过 TOM 复合物。然后，它们与膜间隙中的分子伴侣结合，后者将蛋白质引导至 TIM22 复合物。TIM22 复合物专门用于插入多通道内膜蛋白。（C）OXA 复合物介导膜蛋白插入内膜，这些蛋白由线粒体基因组编码并在基质空间中翻译。（D）内膜中的 OXA 复合物可以介导蛋白质从基质空间插入。要进入这条路线，核编码蛋白质必须首先通过 TOM 和 TIM23 复合物完全转位到基质空间。用于初始转位的信号序列（红色）的裂解揭示了新 N 端相邻的疏水信号序列（蓝色）。然后，该信号将蛋白质引导到内膜中。 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 732 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 732 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
732 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 733 蛋白质进入线粒体和叶绿体的运输
细菌和线粒体使用类似的机制将“桶”插入其外膜
如本章前面所述，线粒体是从原始真核细胞内的祖先内共生细菌进化而来的。因此，线粒体外膜在进化上与革兰氏阴性细菌的外膜有关（见图 11-7）。两种膜均含有孔蛋白，这是一种丰富的成孔攮桶蛋白，可渗透无机离子和代谢物（但不能渗透大多数蛋白质）。TOM 复合物只允许含有疏水性 α 螺旋的蛋白质横向离开，因此不能将孔蛋白或其他攮桶蛋白整合到脂质双层中。相反，它们首先作为未折叠蛋白质通过 TOM 复合物运输到膜间隙。膜间隙中的特殊伴侣蛋白可防止攮桶蛋白聚集（图 12-2A），直到它们插入并由外膜中的 SAM 复合物折叠而成。
SAM 复合物的一个中心亚基与一种细菌外膜蛋白同源，该蛋白有助于将 β 桶蛋白插入细菌外膜。在细菌中，β 桶蛋白从周质空间插入，周质空间的拓扑结构相当于线粒体中的膜间隙（图 12-2B）。这种插入 β 桶蛋白的保守途径进一步强调了线粒体的内共生起源。值得注意的是，TOM 和 SAM 复合物的中心亚基本身就是 β 桶蛋白。
因此，需要预先存在的 TOM 和 SAM 复合物来复制更多这些必需的蛋白质转运蛋白。
两个信号序列将蛋白质引导至叶绿体中的类囊体膜 蛋白质进入叶绿体的过程类似于进入线粒体的运输。这两个过程都发生在翻译后，使用每个膜中的单独转运复合物，需要能量，并使用多种类型的信号序列将前体引导至适当的细胞器亚区室。然而，形成转运复合物的许多蛋白质成分是不同的。此外，线粒体利用其内膜上的电化学 H + 梯度来驱动运输，而叶绿体在其类囊体膜上有电化学 H + 梯度，但在内膜上没有，它使用 GTP 和 ATP 水解来为跨双层膜包膜的进口提供动力。因此，功能相似性源于趋同进化，反映了跨双层膜转运的共同要求。尽管输入叶绿体的信号序列表面上与输入线粒体的信号序列相似，但植物细胞可以同时拥有线粒体吗？线粒体和叶绿体，因此蛋白质必须在
MBoC7 m12.24/12.52
胞质溶胶
胞质溶胶
膜间
空间
基质空间
(B) (A)
TOM 复合物 SAM
复合物 BAM
复合物
完全折叠
蛋白质
伴侣 周质
伴侣
Sec
复合物
插入
细菌外膜
跨内膜（质膜）转位
外线粒体
膜
内线粒体
膜
图 12?2 孔蛋白整合到外线粒体和细菌膜中。 (A) 通过线粒体外膜中的 TOM 复合物转位后，桶状蛋白与膜间隙中的分子伴侣结合。 SAM 复合物随后将未折叠的多肽链插入外膜并帮助该链折叠。
(B) 革兰氏阴性细菌外膜中结构相关的 BAM 复合物催化桶状蛋白插入和折叠（见图 11-7）。
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734 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
两个细胞器。实验表明，如果细胞质蛋白质通过实验与线粒体蛋白质的
N 端信号序列连接，则可以特异性地定向到植物细胞的线粒体；与叶绿体蛋白质的 N 端信号序列连接的相同蛋白质最终进入叶绿体。
因此，每个细胞器上的输入受体区分不同的
信号序列。
线粒体中发现的相同隔间也存在于叶绿体中？
叶绿体分为多个细胞，每个细胞都有其独特的蛋白质组，这些蛋白质通过类似于线粒体系统的机制选择性地输送到细胞中。然而，叶绿体有一个额外的膜封闭区室，即类囊体。许多叶绿体蛋白质，包括光合作用系统和 ATP 合酶的蛋白质亚基（第 14 章讨论），都位于类囊体膜中。这些重要复合物的许多成分都编码在核基因组中，因此那些位于类囊体腔中的成分必须通过三个膜输入。这些蛋白质的前体利用二分信号序列分两步从细胞溶胶转移到最终目的地。首先，它们在 N 端叶绿体信号序列的引导下穿过外膜和内膜进入基质。在那里，基质信号肽酶去除 N 端叶绿体
信号序列，揭示前体蛋白序列中紧随其后的类囊体信号序列。 类囊体信号序列启动整合到类囊体膜或易位到类囊体空间
（图 12?3A）。
细胞溶胶
基质
GTP 或 ATP 依赖性
易位
到基质 暴露的类囊体
信号序列
将蛋白质转运到类囊体空间的三种途径
类囊体
膜
类囊体空间中的成熟蛋白质
叶绿体外膜 TOC 复合物
TIC 复合物
叶绿体内膜
叶类囊体前体蛋白 类囊体信号序列 叶绿体信号序列 TOC 复合物中的受体蛋白 MBoC7 m12.26/12.53
(A)
(B)
12 3 类囊体膜 类囊体空间能量需求 A TP + H + 电化学梯度 GTP + H + 电化学梯度 H + 电化学梯度 Sec 途径 OXA 途径 TA T 途径
叶绿体裂解 信号序列 类囊体基质 SRP 同源物
图 12?3 叶绿体前体蛋白转位到类囊体空间。 (A) 前体蛋白含有 N 端叶绿体信号序列 (红色)，紧接着是类囊体信号序列 (棕色)。叶绿体信号序列通过类似于线粒体前体蛋白转运到基质空间的机制启动转运到基质中，尽管转运蛋白复合物 (分别称为 TOC 和 TIC (代表叶绿体外膜和内膜中的转运蛋白)) 不同。然后信号序列被切掉，露出类囊体信号序列，从而启动跨类囊体膜的转运。 (B) 转位到类囊体空间或类囊体膜可通过至少三种途径中的任何一种发生：(1) Sec 途径，之所以这样称呼是因为它使用的成分是 Sec 蛋白的同源物，这些成分介导跨内质网和细菌质膜的蛋白质转位；(2) OXA 样途径，之所以这样称呼是因为它使用 OXA 转位酶的叶绿体同源物；(3) TAT（双精氨酸转位）途径，之所以这样称呼是因为两个精氨酸在引导蛋白质进入此途径的信号序列中至关重要，这取决于跨类囊体膜的 H+ 梯度。OXA 样途径利用缺乏 RNA 亚基的叶绿体 SRP。这种位于基质中的特化 SRP 可识别类囊体定向信号序列，并仅在翻译后发挥作用，因为它位于与制造类囊体前体蛋白的核糖体分开的隔室中。
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 734 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 734 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM
734 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 735 细胞核和细胞质之间的分子运输
类囊体膜中有三种不同的蛋白质转运蛋白，
每种蛋白转运蛋白识别不同类型的信号序列，处理不同的
类囊体前体子集，并以不同的方式使用能量（图 12?3B）。
正如我们之前所看到的，类囊体膜是从
内叶绿体膜发育而来的，而内叶绿体膜在进化上与细菌内膜有关。因此，类囊体膜中的三种转运蛋白均具有用于细菌转运或膜插入的同源物，这并不奇怪。
摘要
尽管线粒体和叶绿体有自己的遗传系统，但它们产生的自身蛋白质不到 1%。相反，这两个细胞器使用类似的机制从细胞质中导入大部分蛋白质。在这两种情况下，外膜和内膜中的多种蛋白质转运蛋白复合物识别不同类型的信号序列，以将前体引导至正确的细胞器亚区室。蛋白质通过翻译后机制以未折叠状态运输。细胞质 hsp70 家族的伴侣蛋白在转运前将前体蛋白保持在未折叠状态，基质空间或基质中的第二组 hsp70 蛋白将多肽链拉过内膜。转运到线粒体中的动力来自 ATP 水解、内膜上的膜电位和电子传递链的氧化还原电位。转运到叶绿体中的动力来自 GTP 和 ATP 水解以及类囊体膜上的膜电位。在叶绿体中，从基质到类囊体的输入可以通过几种途径进行，这些途径由蛋白质转运复合物和所用的能量源区分。
分子在细胞核和细胞质之间的运输
核膜包裹 DNA 并定义核区室。
该膜由两个同心膜组成，这些膜由核孔复合体穿孔（图 12-4）。虽然内核膜和外核膜是连续的，但它们保持不同的蛋白质组成。内核膜含有作为核层结合位点的蛋白质，核层是聚合蛋白质亚基的网状结构，称为核层蛋白。层蛋白是细胞骨架蛋白中间丝家族的成员（见第 16 章）。层为核膜、内核膜、外核提供结构支撑ar
膜
连接核层
和细胞骨架
ER 膜
ER
腔
核周
间隙
(B) (A)
核孔复合体
核层
染色质
MBoC7 e15.07/12.54
0.5 祄
图 12?4 核膜。
(A) 核膜的双层膜被核孔复合体穿透。
内核膜和外核膜中的跨膜蛋白将核层与细胞质
细胞骨架连接起来。
外核膜与内质网 (ER) 连续。图中未显示通常与内质网膜胞质表面和外核膜结合的核糖体。（B）核层是内膜下方的纤维蛋白网。核孔呈浅棕色。 （B，来自 Y.
Turgay 等人，Nature 543:261-64，2017 年。）
MBoC7 mp649/12.A
细胞核
过氧化物酶体
线粒体
质体
内质网
胞质溶胶
胞质溶胶
质膜和细胞外部
高尔基体
晚期内体
溶酶体
早期内体
分泌
小泡
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736 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
核膜并充当染色体和核孔复合物的锚定位点。层板还通过跨越核膜的蛋白质复合物与细胞质细胞骨架相连，从而提供 DNA、核膜和细胞骨架之间的结构连接。外核膜与 ER 膜连续，并布满了参与蛋白质合成的核糖体（见图 12-5）。这些核糖体上制造的蛋白质被运送到内核膜和外核膜之间的空间（核周空间），该空间与 ER 腔连续。核孔在细胞质和细胞核之间进行广泛的双向交通。许多在细胞核中起作用的蛋白质（包括组蛋白、DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、转录调节因子和 RNA 加工蛋白）被选择性地从它们产生的细胞质输入到核区室。同时，所有在细胞质中起作用的 RNA（包括 mRNA、rRNA、tRNA 和 miRNA）在细胞核中合成和加工后被输出。与输入过程一样，输出过程也是有选择性的；例如，mRNA 只有在细胞核中被 RNA 加工反应适当修饰后才会输出。在某些情况下，需要多个选择性运输步骤来组装复杂的结构。例如，核糖体由在胞质溶胶中合成的蛋白质组成，这些蛋白质被运送到细胞核中，只有在与新合成的核糖体 RNA 组装后才被输出回胞质溶胶。然后，这些前核糖体颗粒在胞质溶胶中完成组装成功能性核糖体，某些组装和运输因子返回细胞核，帮助组装下一个核糖体。
核孔复合物穿透核膜
所有真核生物的核膜上都有大型复杂的核孔复合物 (NPC)。每个 NPC 由一组大约 30 种不同的蛋白质或核孔蛋白组成。NPC 具有八重旋转对称性，中心核具有轴对称性。因此，每个核孔蛋白都存在于多个核膜中。细胞分裂成许多小分子，导致完全组装的 NPC 中存在 500?000 个蛋白质分子，酵母中估计质量为 6600 万道尔顿，脊椎动物中估计质量为 1.25 亿道尔顿（图 12?5）。大多数核孔蛋白由重复的蛋白质结构域组成，这些结构域只有几种不同类型的重复，这些结构域是通过大量基因复制进化而来的。一些与膜相邻的支架核孔蛋白（见图 12?5）在进化和结构上与囊泡外壳蛋白复合物有关，例如网格蛋白和 COPII 外壳（第 13 章讨论），它们形成运输囊泡。一种蛋白质甚至被用作 NPC 和囊泡外壳的共同组成部分。似乎一种有助于形成真核细胞复杂膜系统的祖先膜终止蛋白进化成一个蛋白家族，该家族可稳定核孔和萌芽运输囊泡处的急剧膜弯曲。
典型哺乳动物细胞的核膜包含 3000?000 个 NPC，
尽管该数字差异很大，从神经胶质细胞中的几百个到浦肯野神经元中的近 20,000 个。每个 NPC 每秒可以运输惊人的 1000 个大分子，并且可以同时双向运输。
每个 NPC 的内径约为 40 纳米，足以容纳核糖体亚基甚至病毒颗粒。然而，这个巨大的孔隙并不是空的；相反，它充满了由通道核孔蛋白贡献的非结构化蛋白质区域。
这些非结构化结构域含有大量苯丙氨酸-甘氨酸 (FG) 基序的重复序列，这些基序彼此之间亲和力较弱，在 NPC 内部形成凝胶状网状结构。该网状结构可充当筛子，限制大分子的扩散，同时允许较小分子通过。研究人员通过将不同大小的标记水溶性分子注入细胞溶胶，然后测量其扩散到细胞核中的速率，确定了筛子的有效尺寸。小分子（5000 道尔顿或更少）扩散得如此之快，以至于我们可以认为核膜可以自由渗透它们。屏障逐渐限制较大的分子，以至于直径大于 ~40,000 道尔顿或 ~5 纳米的蛋白质无法通过被动扩散进入。由于许多细胞蛋白质太大而无法被动扩散通过 NPC，因此核区室和细胞质可以维持不同的蛋白质组成？位置。例如，成熟的胞浆核糖体的直径约为 30 nm，
图 12-5 NPC 在核膜中的排列。（A）在脊椎动物 NPC 中，核孔蛋白排列具有惊人的八重旋转对称性。此外，免疫电子显微镜研究表明，构成 NPC 中心部分的蛋白质在核膜上对称排列，因此核侧和胞浆侧看起来相同。八重旋转和两重横向对称性解释了如此巨大的结构如何仅由大约 30 种不同的蛋白质形成：许多核孔蛋白以 8、16 或 32 个拷贝存在。根据它们在 NPC 中心部分的大致定位，核孔蛋白可分为 (1) 跨膜环蛋白，跨越核膜并将 NPC 锚定在核膜上； (2) 形成层状环状结构的支架核孔蛋白（一些支架核孔蛋白是膜弯曲蛋白，可稳定核膜穿透处的急剧膜曲率）；以及 (3) 排列在中心孔内的通道核孔蛋白。除了将蛋白质锚定在特定位置的折叠域外，许多通道核孔蛋白还含有广泛的非结构化区域，其中多肽链本质上是无序的。中心孔充满了高浓度的这些无序域，它们之间的弱相互作用形成凝胶，阻止大分子的被动扩散。无序区域含有大量苯丙氨酸-甘氨酸 (FG) 重复序列。原纤维从 NPC 的细胞质和细胞核两侧伸出。与 NPC 核心的双重横向对称性相比，面向细胞质和细胞核的纤维有所不同：在核侧，纤维在其远端汇聚形成篮状结构。组装后的 NPC 中单个核孔蛋白的精确排列仍是一个激烈争论的问题，因为 NPC 的庞大尺寸和柔韧性以及纯化足够量的均质材料的困难阻碍了原子分辨率分析。电子显微镜、计算分析和核孔蛋白亚复合物的晶体结构相结合已被用于开发当前的 NPC 架构模型。 (B) 卵母细胞核膜核侧的扫描电子显微照片，显示带有篮状纤维的 NPC。 (C) 显示两个 NPC 侧视图的电子显微照片（括号）；请注意，内核膜和外核膜在孔的边缘是连续的。（D）电子显微照片显示负染色的 NPC 正面视图。膜已通过洗涤剂提取去除。请注意，一些 NPC 的中心含有物质，这些物质被认为是通过这些 NPC 时被捕获的大分子。 （A，改编自 A. Hoelz 等人，Annu. Rev. Biochem.
80:613?43, 2011。B，？1992 M.W. Goldberg 和 T.D. Allen。最初发表于 J. Cell Biol. https://doi.org/10.1083/
jcb.119.6.1429。经洛克菲勒大学出版社许可。C，由 Werner Franke 和 Ulrich Scheer 提供。D，由 Ron Milligan 提供。）
内
核
膜
核
包膜
外核
膜
50 nm
核
层
核篮
胞浆
?brils
胞浆
核
(A)
(C) (D)
(B)
核孔复合体
0.1 祄 0.1 祄
0.1 祄
核
胞质溶胶
MBoC7 m12.08/12.55
膜环蛋白
支架折叠核孔蛋白
通道核孔蛋白
无序区域
通道核孔蛋白
MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 737 MBOC7_ptr_ch12_683-748.indd 737 02/12/21 12:32 PM 02/12/21 12:32 PM738 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
因此不能通过 NPC 扩散，将蛋白质合成限制在细胞质中。
但是细胞核如何输出新制造的核糖体亚基或输入大分子，例如 DNA 聚合酶和 RNA 聚合酶，它们的亚基分子量为 100,000?00,000 道尔顿？正如我们接下来讨论的那样，这些和大多数其他运输的蛋白质和 RNA 分子与特定的受体蛋白结合，这些受体蛋白将大分子运送通过 NPC。即使是组蛋白等小蛋白质也经常使用受体介导的机制穿过 NPC，从而提高运输效率。
核定位信号将蛋白质引导至细胞核
当通过实验从细胞核中提取蛋白质并将其重新引入细胞质时，即使是非常大的蛋白质也会有效地重新积累在细胞核中。
称为核定位信号 (NLS) 的分选信号负责此主动核输入过程的选择性。通过使用重组 DNA 技术，已精确定义了输入到细胞核中的许多蛋白质的信号（图 12-6）。最常用的信号由一个或两个富含带正电荷的氨基酸赖氨酸和精氨酸的短序列组成（见图 12-3），不同蛋白质的精确序列各不相同。一些核蛋白含有不同类型的信号，其中一些尚未被鉴定。
NLS 几乎可以位于氨基酸序列中的任何位置，并且被认为在蛋白质表面形成环或斑块。许多 NLS 甚至在作为短肽连接到胞浆蛋白表面时也能发挥作用，这表明信号在核蛋白氨基酸序列中的精确位置并不重要。此外，只要多组分复合物的一个蛋白质亚基显示核定位信号，整个复合物就会被输入到细胞核中。大分子跨 NPC 的运输与蛋白质跨其他细胞器膜的运输有着根本的不同：NPC 运输是通过一个大的、组成性开放的、网状填充的孔进行的，而不是通过一个小得多的蛋白质转运蛋白进行的，后者的水孔通常由被运输的蛋白质控制。因此，完全折叠的蛋白质和大型多蛋白复合物可以通过核孔向任一方向运输。相比之下，通过内质网、线粒体和叶绿体的细胞器蛋白转运蛋白的运输是单向的，通常需要蛋白质被广泛展开。
可以通过用核定位信号涂覆微小胶体金颗粒，将颗粒注入细胞质，然后通过电子显微镜跟踪它们的命运，来可视化核蛋白通过 NPC 的运输（图 12-7）。粒子首先到达从 NPC 边缘的支架核孔蛋白延伸到细胞质的触手状原纤维，然后穿过 NPC 的中心。这一观察结果表明，NLS 赋予大颗粒穿越核孔内无序网格造成的原本不可渗透的扩散屏障的能力。
Pro Pro LysL ys Lys Arg LysV al Pro Pro Lys Thr Lys Arg LysV al
(A) 含有正常核输入信号的 T 抗原的定位
(B) 含有突变核输入信号的 T 抗原的定位
MBoC7 m12.09/12.56
20 祄
100 nm 胞质溶胶 细胞核
核膜
(A)
(B)
(C)
(D)
MBoC7 m12.10/12.57
图 12?6 核定位信号的功能。免疫荧光显微照片显示含有或缺乏作为核定位信号的短序列的 SV40 病毒 T 抗原的细胞位置。 (A) 正常 T 抗原蛋白含有所示的富含赖氨酸的序列，并被导入细胞核中的作用位点，如用抗 T 抗原抗体进行的免疫荧光染色所示。
(B) 具有改变的核定位信号（苏氨酸取代赖氨酸）的 T 抗原仍留在细胞溶胶中。（来自 D. Kalderon 等人，Cell 39:499-09，1984。
经 Elsevier 许可。）
图 12-7 可视化通过 NPC 的主动导入。这一系列电子显微照片显示直径为 5 至 10 纳米的胶体金球（箭头）被含有核定位信号的肽包覆，这些肽通过 NPC 进入细胞核。金粒子被注射到活细胞的细胞质中，然后在注射后的不同时间固定并准备进行电子显微镜检查。（A）金粒子首先出现在 NPC 的细胞质原纤维附近。（B、C）然后它们出现在 NPC 的中心，仅在细胞质表面上。（D）然后它们出现在核表面。这些金粒子的直径比 NPC 中的扩散通道的直径大得多，并且通过主动运输导入。 （摘自 N. Pant 和 U. Aebi，Science
273:1729-732，1996 年。经 AAAS 许可。）
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738 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 739 细胞核和细胞质之间的分子运输
核输入受体与核定位信号和 NPC 蛋白结合
要启动核输入，核定位信号必须被核运输受体识别。这些受体中的大多数都属于一个称为核转运蛋白的大蛋白质家族。在酵母中，有 14 个基因编码核转运蛋白；在动物细胞中，这个数字要大得多。介导核输入的核转运蛋白家族成员称为核输入受体，而介导核输出（稍后讨论）的核转运蛋白家族成员称为核输出受体。每个输入受体都可以结合和运输包含适当核定位信号的货物蛋白子集（图 12-8A）。
核输入受体有时使用衔接蛋白，在输入受体和要运输的蛋白质上的核定位信号之间形成桥梁（图 12-8B）。一些衔接蛋白在结构上与核输入受体相关，表明它们具有共同的进化起源。
通过使用各种输入受体和衔接蛋白，细胞能够识别实现核蛋白上显示的核定位信号的广泛库。
输入受体是可溶性胞浆蛋白，含有多个低亲和力结合位点，用于在几种核孔蛋白的非结构化域中发现的 FG 重复序列。胞浆核孔蛋白原纤维中的 FG 重复序列最初用于将输入受体及其结合的货物蛋白招募到 NPC。
输入受体然后可以结合形成核孔内网格的 FG 重复序列，以破坏重复序列之间的相互作用。这样，受体复合物局部溶解凝胶状网格，并可以扩散到 NPC 孔内（图 12-9）。
可以在试管中重新创建由含有 FG 重复序列的非结构化多肽组成的凝胶。这种凝胶显示出惰性货物以与 NPC 扩散类似的尺寸依赖性方式受限扩散。与输入受体结合的货物扩散到这种人造凝胶中的速度要快 1000 多倍。以这种速率，与输入受体复合的货物可以在几毫秒内穿过 NPC，与 NPC 的速率一致。
图 12-8 核输入受体。
（A）不同的核输入受体结合不同的核定位信号，从而结合不同的货物蛋白。（B）货物蛋白 4 需要衔接蛋白与其核输入受体结合。衔接子在结构上与核输入受体相关，并识别货物蛋白上的核定位信号。它们还包含一个将它们与输入受体结合的核定位信号，但只有当它们装载货物蛋白时，这个信号才会暴露出来。图 12-9 核输入受体与 FG 重复序列的相互作用。
左图：核输入受体表面含有各种低亲和力 FG 重复序列结合位点。这有助于它们最初被募集到 NPC，因为它们与 NPC 胞浆原纤维上发现的 FG 重复序列相互作用。NPC 内部充满了含有 FG 重复序列的蛋白质网格，这些蛋白质之间的相互作用较弱，限制了蛋白质和其他大分子通过孔的非特异性扩散。右图：货物受体可以通过与 FG 重复序列相互作用并局部融化网格，快速进入 FG 重复网格。这种进入和离开网格的划分大大加速了货物受体（及其结合货物）通过 NPC 的扩散。没有表面 FG 重复结合位点的蛋白质无法融化网状物，并且它们通过 NPC 的扩散相对较慢。
货物
蛋白质 1
核输入
受体
核定位信号
货物
蛋白质 2
货物
蛋白质 3
货物
蛋白质 4
核输入
受体
(A) (B)
MBoC7 m12.11/12.58
核输入
衔接蛋白
胞质溶胶
核
FG 重复
输入
受体
FG 结合
位点
货物
胞质溶胶
?bril
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740 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
在细胞中观察到的运输。重要的是要意识到，在这个模型中，扩散不是定向的；相反，进口受体 si仅仅加速扩散，使货物能够进入核区。正如我们将看到的，正是 NPC 核侧货物的选择性解离赋予了进口过程方向性。然后，进口受体返回胞质溶胶，运输下一个货物。
Ran GTPase 通过 NPC 对核进口施加方向性
通过 NPC 进口核蛋白会将特定蛋白质集中在细胞核中，从而增加细胞内的秩序。细胞通过利用 GTPase Ran 的 GTP 水解能量来为这一排序过程提供动力，而核进口和出口都需要这种能量。
与其他 GTPase 一样，Ran 是一种分子开关，可以根据 GDP 或 GTP 是否结合而存在于两种构象状态中（图 3-3）。
两种 Ran 特异性调节蛋白触发两种状态之间的转换：胞浆 GTP 酶活化蛋白 (GAP) 触发 GTP 水解，从而将 Ran·TP 转化为 Ran·DP，核鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 促进 GDP 与 GTP 的交换，从而将 Ran·DP 转化为 Ran·TP。由于 Ran GAP 位于胞浆中，而 Ran GEF 位于细胞核中，因此胞浆中主要含有 Ran·DP，而细胞核中主要含有 Ran·TP（图 12-0A）。GAP 和 GEF 在细胞中胞浆和细胞核之间的分配是由于它们分别优先与胞浆细胞骨架和细胞核染色质结合。 Ran 两种构象形式的梯度驱动核运输朝适当的方向进行。在 FG-重复结合的促进下，输入受体加速了通过 NPC 通道内网状物的扩散。当输入受体到达孔复合物的核侧时，Ran-TP 与其结合并导致受体释放其货物（图 12-0B）。因为这只发生在
蛋白质与受体结合
Ran-GTP 与受体结合
GTP 水解，
Ran-GDP 与受体分离
蛋白质输送到
细胞核
核定位信号
核
输入
受体
胞质溶胶
核
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预期核蛋白
核
孔
Ran-GTP
Ran-GDP
P
(B) (A)
细胞核
胞质溶胶
Ran GAP
Ran-GTP
Ran-GDP
GT P
GT P
GDP
GDP
P
Ran GEF
染色质
图12?0 Ran-GDP 和 Ran-GTP 的区室化为核转运提供了方向性。
(A) Ran-GDP 在细胞质中的定位和 Ran-GTP 在细胞核中的定位源于两种 Ran 调节蛋白的定位：Ran GTPase 活化蛋白 (Ran GAP) 位于细胞质中，而 Ran 鸟嘌呤核苷酸交换因子 (Ran GEF) 与染色质结合，因此位于细胞核中。 Ran-GDP 通过其自身的进口受体 (未显示) 进入细胞核，该受体对 Ran 的 GDP 结合构象具有特异性。 Ran-GDP 受体在结构上与核转运受体的主要家族无关。 但是，它也与 NPC 通道核孔蛋白中的 FG 重复序列结合。
(B) 核进口受体与其货物之间的相互作用被 Ran-GTP 逆转。这意味着受体朿货物相互作用在细胞质中占优势，但在细胞核中则不利。这导致从细胞质到细胞核的净货物运输。
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740 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 741 细胞核和细胞质之间的分子运输
在核孔侧，Ran·TP 浓度较高，
输入过程被纠正（即单向），即使货物输入受体复合物通过孔的扩散受随机的来回扩散控制。
在细胞核中卸下货物后，空的 Ran-TP 结合的进口受体通过相同的促进扩散机制通过孔复合物运输回。当 Ran-TP 和进口受体的复合物到达细胞质时，Ran GAP 触发 Ran-TP 水解其结合的 GTP。产生的 Ran-DP 对进口受体缺乏亲和力，将其释放以进行另一轮核进口。因此，Ran-DP 允许货物在细胞质中结合，而 Ran-TP 刺激货物在细胞核中排出，从而赋予进口过程方向性。
核出口与核进口类似，但方向相反
大分子（如新的核糖体亚基和 RNA 分子）的核出口通过 NPC 进行，也依赖于选择性运输系统。运输系统依赖于大分子上的核出口信号？需要输出的 ecules。输出受体既直接或通过适配器与输出信号结合，又与 NPC 蛋白结合，以引导其货物进入细胞质。
正如从输入受体的结构和进化相似性所预期的那样rs 和输出受体，输入和输出运输系统的工作方式相似但方向相反：输入受体在细胞质中结合其货物分子，将其释放到细胞核中，然后输出到细胞质中重新使用，而输出受体则以相反的方式发挥作用（图 12-1）。
图 12-1 核输入和核输出都使用 Ran GTPase 循环。装载的核运输受体通过 NPC 的运动沿着某些 NPC 蛋白显示的 FG 重复序列发生。Ran-GTP 在细胞核中和 Ran-GDP 在细胞质中的差异定位为核输入（A）和核输出（B）提供了方向性（红色箭头）。Ran GAP 刺激 GTP 水解以在 NPC 的细胞质侧产生 Ran-GDP（见图 12-0A）。 Ran 介导的核输入和核输出之间的关键区别在于货物受体结合货物的性质。在核输入中，货物结合与 Ran-GTP 相互排斥；在核输出中，货物结合需要 Ran-GTP。因此，与核输入相比，核输出中货物被拾取和释放的位置完全相反。
Ran-GDP 与受体分离
Ran-GTP 与受体结合
核输入
受体
核输出
受体蛋白，带有核定位信号（货物）
胞质溶胶
胞质
?bril
核
Ran-GTP
蛋白，带有核输出信号（货物）
Ran-GTP
Ran-GDP
+
货物运送到胞质溶胶
MBoC7 m12.13/12.61
Ran-GDP
+
货物运送到细胞核
核输入 (A) (B) 核输出
P P
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742 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
出口受体反向工作的能力源于它们与 Ran GTPase 相互作用的方式。细胞核中的 Ran-TP 促进货物与出口受体结合，而不是像进口受体那样促进货物解离。一旦出口受体通过孔隙移动到细胞质，它就会遇到 Ran GAP，这会诱导受体将其 GTP 水解为 GDP。结果，出口受体翻转其构象并在细胞质中释放其货物和 Ran-DP。自由输出受体和自由 Ran-DP 使用核输入途径进入细胞核并完成循环。正如我们在第 6 章中详细讨论的那样，细胞控制 RNA 从细胞核的输出。snRNA、miRNA 和 tRNA 与核输出受体结合，它们使用 Ran-TP 梯度为运输过程提供动力。相比之下，mRNA 从细胞核输出使用不同的机制，不使用输出受体或 Ran GTPase 系统。相反，剪接和加工后的 mRNA 与几种核 RNA 结合蛋白组装在一起，其中一些可以结合 NPC 的核侧，另一些可以结合 FG 重复序列（见图 6-0）。然后，这种具有输出能力的 mRNA 核糖核蛋白 (mRNP) 复合物可以穿过 NPC 内的 FG 重复网格。位于 NPC 胞质侧的解旋酶复合物利用 ATP 水解的能量从 mRNP 中剥离几种蛋白质，包括 FG 重复结合蛋白。这可防止输出的 mRNA 重新进入 NPC，从而使输出过程单向。剥离的 RNA 结合蛋白被迅速输入回细胞核（使用输入受体和 Ran GTPase 系统）进行另一轮运输。
通过控制对运输机制的访问可以调节通过 NPC 的运输 一些蛋白质不断地在细胞核和细胞质之间来回穿梭。如果蛋白质足够小以扩散通过核孔，但包含一个不断将其检索到细胞核或细胞质的输入或输出信号，就会发生这种情况。其他蛋白质既包含核定位信号，也包含核输出信号。它们的输入和输出的相对速率阻碍了 ?了解此类穿梭蛋白的稳定定位：如果输入速率超过输出速率，则蛋白质将主要位于细胞核中；相反，如果输出速率超过输入速率，则蛋白质将主要位于细胞质中。因此，改变输入、输出或两者的速率可以改变蛋白质的位置。如第 7 章所述，细胞通过将某些转录调节剂保持在细胞核外直到需要它们为止来控制它们的活性（图 12-2）；同样，细胞可以通过将某些 mRNA 保留在细胞核中直到需要它们的蛋白质产物来控制它们的翻译。在许多情况下，细胞通过调节核定位和输出信号来控制运输——打开或关闭它们，通常是通过磷酸化靠近信号序列的氨基酸（图 12-3）。其他转录调节剂调节剂与抑制性胞浆蛋白结合，这些蛋白要么将它们锚定在胞浆中（通过与细胞骨架或特定细胞器的相互作用），要么掩盖它们的核定位信号，使它们无法与核输入受体相互作用。适当的刺激会将转录调节蛋白从其胞浆锚点或掩蔽物中释放出来，然后将其运输到细胞核中。一个重要的例子是潜在的转录调节蛋白，它控制胆固醇代谢基因的转录。该蛋白质以非活性形式制成并储存在内质网中的跨膜蛋白中。当细胞缺乏胆固醇时，蛋白质会从内质网运输到高尔基体，在那里遇到特定的蛋白酶，这些蛋白酶会切断胞浆结构域，将其释放到胞浆中。然后，该结构域被导入细胞核，在那里它激活胆固醇和胆固醇代谢所需的基因的转录。甾醇的吸收和合成（图 12-4）。在本章前面，我们讨论了一种控制未折叠蛋白反应 ATF6 臂激活的类似机制（见图 12-6）。
50 祄
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图 12-2 果蝇早期胚胎的核运输控制。此阶段的胚胎是合胞体，此处以横截面显示，许多细胞核位于共同的细胞质中，排列在外围，就在质膜下方。转录调节蛋白 Dorsal 在整个外周细胞质中均匀产生，但它只能在细胞核内起作用。 Dorsal 蛋白已用酶偶联抗体染色，产生棕色产物，表明 Dorsal 被排除在胚胎背部（顶部）的细胞核之外，但集中在胚胎腹侧（底部）的细胞核中。
Dorsal 进入细胞核的受控运输控制着动物背部和腹部之间的差异发育。
（由 Siegfried Roth 提供。）
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742 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 743 细胞核和细胞质之间的分子运输
核膜在有丝分裂过程中分解和重新组装
在动物细胞中，核膜在有丝分裂过程中被拆除，以便微管可以进入复制的染色体，以便在两个子细胞之间分离（第 17 章讨论）。在有丝分裂结束时，核膜重新组装，细胞质和细胞核之间细胞内容物的不对称分布重新建立。必须可逆地拆卸的主要结构是核层、NPC 和核膜。拆卸过程由在有丝分裂开始时激活的细胞周期蛋白依赖性激酶 (Cdk) 启动（第 17 章讨论）。 Cdk
胞浆
细胞核
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静息 T 细胞中 [Ca 2+ ] 较低
活化 T 细胞中 [Ca 2+ ] 较高
核输入
信号
核输出
信号受阻
基因转录激活
A TP + 活性
蛋白激酶
暴露
核输出
信号
NF-A T
钙调磷酸酶
(蛋白
磷酸酶)
P
P P
P P
P P
胆固醇
INSIG
SREBP
SCAP
高胆固醇
低胆固醇
ER
GOLGI
ER
位点 1 蛋白酶
位点 2
蛋白酶
核
释放的转录
调节蛋白
胆固醇生物合成酶
(A) (B)
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胞质溶胶
图 12?3 T 细胞活化期间核输入的控制。活化 T 细胞的核因子 (NF-AT) 是一种转录调节蛋白，在静息 T 细胞中，在胞质溶胶中处于磷酸化状态。
当 T 细胞被外来抗原激活时（第 24 章讨论），细胞内 Ca2+ 浓度会增加。
在高浓度的 Ca2+ 下，蛋白磷酸酶钙调磷酸酶与 NF-AT 结合并使其去磷酸化。去磷酸化暴露核输入信号并阻断核输出信号。
因此，NF-AT 和钙调磷酸酶的复合物被输入到细胞核中，NF-AT 激活 T 细胞活化所需的许多基因的转录。当 Ca2+ 水平降低时，反应会关闭，从而将 NF-AT 从钙调磷酸酶中释放出来。NF-AT 的再磷酸化使核输入信号失活并重新暴露核输出信号，导致 NF-AT 重新定位到细胞质中。一些最有效的免疫抑制药物，包括环孢菌素 A 和 FK506，抑制钙调磷酸酶去磷酸化 NF-AT 的能力，从而阻止 NF-AT 的核积累和 T 细胞活化（电影 12.6）。
图 12?4 胆固醇生物合成的反馈调节。（A）SREBP（固醇反应元件结合蛋白（SREBP）是一种控制胆固醇生物合成酶表达的潜在转录调节剂，最初合成为 ER 膜蛋白。如果膜中有足够的胆固醇，它会通过与由蛋白质 INSIG 和 SCAP（SREBP 裂解活化蛋白）组成的膜蛋白复合物相互作用而锚定在 ER 中，该复合物可与胆固醇结合。（B）如果 SCAP 上的胆固醇结合位点为空（胆固醇浓度低），SCAP 会改变构象并与 INSIG 分离。与 INSIG 分离会释放 SCAP 朣REBP 复合物，因此它可以一起包装到运输囊泡中，然后运送到高尔基体。在高尔基体中，两种高尔基体驻留蛋白酶裂解 SREBP 以将其胞质结构域从膜中释放出来。胞质结构域是一种转录调控蛋白，随后进入细胞核，与编码胆固醇生物合成相关蛋白质的基因启动子结合，并激活其转录。这样，当胆固醇浓度低于阈值时，就会产生更多的胆固醇。
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744 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
层蛋白 核孔
复合体
DNA
内核膜
外核膜 核膜
层蛋白和
NPC 蛋白的磷酸化
层蛋白的去磷酸化
包膜
融合
完成
核膜
片段重复
染色体
子
染色体
磷酸化
层蛋白
间期核
前期末期
MBoC7 m12.18/12.65
核孔复合体蛋白
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
磷酸化核孔蛋白、层蛋白和内核膜蛋白，从而破坏它们之间的相互作用以及与染色质的相互作用。在此过程中，一些 NPC 蛋白与核输入受体结合，这在有丝分裂末期 NPC 的重组中起着重要作用。核膜膜蛋白不再与孔复合体、层蛋白或染色质结合，而是分散在整个 ER 膜上。沿着微管移动的动力蛋白（第 16 章讨论）在有丝分裂早期被招募到外核膜并施加拉力。将外核膜与内核膜和层板连接在一起的跨膜蛋白有助于传递这种力并将核膜从染色质上拉下来。这些过程共同打破了通常将细胞核和细胞质分开的屏障，未与膜或染色体结合的核蛋白与细胞质的蛋白质完全混合（图 12-5）。即使在核膜破裂后，Ran GEF 仍与染色质结合。这意味着靠近染色质的 Ran 分子主要处于其 GTP 复合物构象。相比之下，由于胞浆 Ran GAP 的作用，较远的 Ran 分子处于 GDP 稳态构象。因此，有丝分裂细胞中的染色体被 Ran TP 云包围，这对于组装有丝分裂纺锤体非常重要，纺锤体将染色体分离到新形成的子细胞中（第 17 章讨论）。染色体分离后，Cdk 失活，使核孔蛋白、层蛋白和核膜蛋白去磷酸化。这会触发每个子细胞中整套染色体表面的核膜重新组装。将核膜成分募集到染色体的定位标记是周围的 Ran TP 云。Ran TP 将 NPC 蛋白从核输入受体中释放出来，使其接近细胞核。结合到染色体上。游离的 NPC 蛋白附着在染色体表面，在那里组装成新的 NPC。同时，去磷酸化的层蛋白再次与染色质结合并通过内 ER 膜募集 ER 膜
图 12-5 有丝分裂期间核膜和层蛋白的分解和重组。层蛋白的磷酸化触发核层蛋白的分解，从而引发核膜的分裂。层蛋白的去磷酸化逆转了这一过程。内核膜的一些核孔蛋白和蛋白质会发生类似的磷酸化和去磷酸化循环，其中一些去磷酸化事件也参与了重组过程。层蛋白网络开始在单个解聚子染色体的区域周围重新形成。层蛋白募集内核膜中含有相互作用的层蛋白受体的膜。最终，随着解聚的进行，这些膜结构融合形成一个完整的细胞核。
有丝分裂中核膜破裂发生在所有后生动物细胞中s。然而，在许多其他物种中，例如酵母，
核膜在有丝分裂期间保持完整，并且细胞核通过裂变分裂。
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744 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选 745 细胞核和细胞质之间的分子运输
驻留在其中的核膜蛋白。内质网逐渐包裹
整个染色体组，直到内质网形成密封的核膜，吞噬染色体和与其结合的蛋白质（电影 12.7）。
新形成的内核膜紧密贴合在染色体表面，富含内核膜蛋白，排除除最初与有丝分裂染色体结合的蛋白质以外的所有蛋白质，从而赋予吞噬过程高度的选择性。由于 Ran-TP 在细胞核内，而 Ran-DP 留在细胞核外，因此含有核定位信号的蛋白质可以通过 NPC 单向输入。这样，核蛋白质含量得到补充，而所有其他大蛋白质（包括核糖体）则被排除在新组装的细胞核之外。
摘要
核膜由内核膜和外核膜组成，它们在核孔复合体 (NPC) 形成的穿孔处相互连接。外核膜与 ER 膜连续，内核膜和外核膜之间的空间与 ER 腔连续。在细胞核中产生的 RNA 分子和在细胞核中组装的核糖体亚基被输出到细胞质；相反，所有在细胞核中起作用的蛋白质都是在细胞质中合成，然后被输入。
细胞核和细胞质之间的大量物质运输通过 NPC 进行，NPC 提供了穿过核膜的直接通道。NPC 的内部包含一个非结构化蛋白质网，允许小分子通过，但施加了扩散屏障，需要大分子主动运输。
通过 NPC 运输的蛋白质的核定位信号和核输出信号由相应的核运输受体识别。这些受体的功能是选择性地在核膜的一侧结合其货物，增加通过 NPC 的扩散速率，并在另一侧选择性地释放货物。单体 GTPase Ran 水解 GTP 的自由能被利用来为核运输提供方向性。
信使 RNA 作为大型核糖核蛋白复合物的一部分通过 NPC 从细胞核输出；它们使用不同的运输路线，利用 ATP 水解重塑 NPC 胞浆侧的复合物。细胞通过控制这些分子进入运输机制来调节核蛋白和 RNA 分子通过 NPC 的运输。由于核定位信号没有被移除，核蛋白可以反复输入，这是每次有丝分裂后细胞核重新组装时所必需的。
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746 第 12 章：细胞内组织和蛋白质分选
问题
哪些陈述是正确的？解释为什么或为什么不正确。
12？与内质网腔一样，细胞核的内部在拓扑上与细胞外部相同。
12？内质网 - 结构和功能相同的有核和游离核糖体，仅在它们恰好在特定时间制造的蛋白质上有所不同。
12？信号序列与核糖体上的疏水位点结合，导致蛋白质合成减慢，而当 SRP 与信号序列结合时，蛋白质合成又恢复。
12? 过氧化物酶体仅存在于少数几种特殊类型的真核细胞中。
12? 核编码蛋白质通过 TIM23 复合物插入线粒体内膜所需的两个信号序列在不同的线粒体区室中从蛋白质上切下。
12? 为了避免在允许通过单个孔进行双向交通时发生的碰撞，核孔复合物是专门的，以便一些介导进口，而另一些介导出口。
讨论以下问题。
12? 在免疫反应中，T 细胞受体信号转导期间，生物分子凝聚物在膜下形成。三个成分至关重要：跨膜蛋白 LAT（T 细胞激活连接子），其在三个胞质酪氨酸残基（pY）处被磷酸化；Grb2，其含有一个 SH2 结构域和两个 SH3 结构域；Sos1，其含有四个 SH3 结构域结合位点（图 Q12?A）。
当您将磷酸化的 LAT（pLAT）插入人工脂质双层中时并添加 Grb2 和 Sos1，微米级缩合物在双层下方形成（图 Q12?B）。但是，如果您使用仅包含一个 SH3 域（Grb2?SH3）而不是两个的 Grb2 形式，则不会形成缩合物（图 Q12?B）。您为什么认为 Grb2 支持缩合物形成，而仍然是多价的 Grb2?SH3 不支持？ 12? 没有分选信号的蛋白质的命运是什么？ 12? 在所有 ER 膜蛋白中，与质膜结合的蛋白质是常见的还是罕见的？一些简单的考虑可以让人回答这个问题。在每 24 小时分裂一次的典型生长细胞中，每天必须通过 ER 的相当于一个新的质膜的物质。如果内质网膜面积是质膜面积的 20 倍，那么内质网中质膜蛋白与其他膜蛋白的比例是多少？（假设所有前往质膜的蛋白质在离开之前平均在内质网停留 30 分钟，并且内质网和质膜中蛋白质与脂质的比例相同。）
12?0 图 Q12? 中示意性地显示了具有多个跨膜片段的多次跨膜蛋白。方框代表跨膜片段，箭头代表信号序列的切割位点。成熟蛋白质的 N 端和 C 端位于哪些隔室（胞质溶胶或内质网腔）中？
MBoC7 nQ12-101/Q12-1
Y Y
P
P
Y
P
pLAT (A)
(B)
Sos1
SH2
Grb2
SH3 SH3
Grb2?SH3
SH2 SH3
Sos1 + Grb2
pLAT
Sos1 + Grb2?SH3
2 祄
Sos1
pLAT
图 Q12?
T 细胞受体信号转导过程中的凝聚物形成（问题 12?）。
(A) 关键分子成分。
(B) 当关键成分存在时，出现小凝聚物（亮点）。 （根据 X. Su 等人在 Science 352:595?99, 2016 中的图 1A 和 D 修改。经 AAAS 许可。）
图 Q12? 具有可裂解信号序列的多次跨膜蛋白（问题 12?0）。
5 4 C 23 N 1
MBoC7 nQ12-103/Q12-2
12?1 所有新磷脂都添加到 ER 膜的胞质小叶中，但 ER 膜在其两个小叶中具有不同磷脂的对称分布。相比之下，最终从 ER 接收其所有膜成分的质膜具有非常不对称的磷脂分布？脂质双层的两个小叶中都含有磷脂。内质网膜中的对称性是如何产生的，质膜中的不对称性是如何产生和维持的？
12?2 具有功能性过氧化物酶体的细胞将 9?1'-苯乙烯)壬醇 (P9OH) 掺入膜脂质中。
这些细胞暴露于紫外线 (UV) 光会导致细胞死亡，因为会产生有毒的活性氧。不产生过氧化物酶体的细胞缺乏一种负责将 P9OH 掺入
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