HCN通道
12.1 简介
膜超极化引起的缓慢激活电流首次在 20 世纪 70 年代和 80 年代在杆状光感受器、心脏起搏器和传导组织以及海马神经元中得到表征。不同组织中的这些电流最初被称为If（表示有趣电流）、Ih（超极化激活电流）或 Iq（奇异电流），反映了它们由膜超极化、慢门控动力学、对环核苷酸的敏感性和混合阳离子电导引起的非典型激活。近二十年后，在 20 世纪 90 年代末，潜在的超极化激活环核苷酸敏感（HCN）离子通道被克隆。HCN 通道有时被称为起搏器通道，因为它们在心脏起搏器细胞和自发活动神经元中表达。然而，HCN 通道广泛表达于全身，它们根据细胞环境对兴奋性产生复杂的影响。
12.2 基本结构组织和亚基多样性
尽管 HCN 通道具有不寻常的特性，但它们具有熟悉的结构，类似于电压门控 K+ (Kv) 通道的结构。因此，这些通道是四聚体，其中每个亚基具有六个跨膜域 (S1-S6)，具有细胞内氨基和羧基末端（图 12.1A）。虽然 HCN 通道是由膜超极化激活的，但它们具有与去极化激活通道相似的电压传感器结构。S1-S4 段形成电压感应域，带正电的 S4 段在细胞膜的电场中移动。 S5–S6 段形成孔域，类似于 Kv 通道的孔域，电压依赖性门位于 S6 段的下部。
与大多数电压门控 K+、Na+ 和 Ca2+ 通道的结构不同，HCN 通道中的电压传感器域是非域交换的。也就是说，HCN 通道中每个亚基的电压传感域与同一亚基的孔域相关联。在域交换通道中，长螺旋 S4–S5 接头将电压传感器域的构象变化与孔域的门控偶联。相比之下，HCN 通道只有短的非螺旋 S4–S5 接头，这些接头不是通过超极化激活通道所必需的，这表明电压传感器和门之间的耦合机制不同。然而，单独的非域交换架构不足以通过超极化进行门控；在包括 EAG、ELK 和 ERG 通道在内的 KCNH 去极化激活通道家族中也发现了类似的排列。此外，HCN 通道的 S4 跨膜段比其他电压门控通道的 S4 段长得多，在细胞质侧延伸了两个额外的螺旋圈并与相邻亚基的 C 连接体接触。HCN 通道的环核苷酸敏感性由细胞内羧基末端的近端部分介导，该部分由 C 连接体结构域和环核苷酸结合结构域 (CNBD) 组成（图 12.1B）。CNBD 与环核苷酸门控通道的 CNBD（见第 11 章）、分解代谢基因激活蛋白和 cAMP 活化蛋白激酶（蛋白激酶 A）高度同源。它由一个初始 α 螺旋 (A-螺旋) 、随后的八链反向平行 β-螺旋 (β1–β8)、一个短B 螺旋和一个长 C-螺旋组成。环状核苷酸在 β-螺旋内结合，也与C 螺旋相互作用。不同的环状核苷酸以相反的方向结合到同一位点。
环状核苷酸结合引起的构象变化被传递到通道孔和电压感应域通过 C 连接子的六个 α 螺旋 (A 到 F) 连接，它不仅连接到 S6，还接触 N 端 HCN 域和 S4-S5 连接子。
如下所述，功能性 HCN 通道的第一个结构揭示了这一共同总体规划中的许多独特特征，这些特征为 HCN 通道的一些不寻常特性提供了基础见解。其中一种情况是独特的三螺旋结构，称为 HCN 结构域 (HCND)，由 N 端近端位于 S1 之前约 45 个氨基酸形成 。在完整的通道中，HCND 位于电压传感器和细胞质域之间。它与来自同一亚基的电压传感器的 S4 段以及来自相邻亚基的 C 连接子和 CNBD 接触。
HCN 通道存在于整个动物界，包括无脊椎动物和脊椎动物。在哺乳动物中，HCN 通道家族由四种亚型组成（HCN1-4）。HCN1-3 主要在神经系统中表达，而 HCN4 是心脏窦房结起搏细胞中的主要亚型。亚基之间的差异主要存在于远端 N 端和 C 端区域，它们在长度和序列上都存在差异；而核心跨膜结构域和近端 N 端和 C 端在亚型之间得到了很好的保守。从功能上讲，HCN1–4 在激活和失活速率以及对环状核苷酸的反应方面有所不同。在异源表达系统中，哺乳动物 HCN 通道异构体可以结合形成功能特性略有改变的异聚通道。尽管多种 HCN 通道异构体在许多组织中表达，但通常单一异构体占主导地位。在大多数情况下，不知道天然通道是异聚体还是同聚体。
12.3 门控
HCN 通道由质膜的超极化门控，激活发生在负至约 -40 mV 的电位下，具体取决于组织和实验条件（图 12.2A、B）。与环状核苷酸门控 (CNG) 通道不同，环状核苷酸与 CNBD 的结合并不直接门控 HCN 通道，而是转移超极化激活门控的电压范围。哺乳动物 HCN 通道异构体在超极化电压步骤期间不会显示明显的电流失活。然而，海胆 HCN 通道在没有 cAMP 的情况下失活。
导致 HCN 通道响应 S4 运动而反转门控极性的分子机制尚未完全解决。几个结构特征似乎有所贡献，包括长 S4 段；孔和电压传感器域的非域交换排列；以及 S4、S5 和 S6 的紧密堆积。已知带电螺旋 S4 片段在超极化过程中向下移动，然后分裂成两个螺旋，上螺旋相对于膜保持相当垂直，下螺旋呈现更水平的构象，与膜平行。S4 的这种独特超极化构象被认为有助于通道开放，因为它伴随着 S5 相对于 S6 的较大位移。
HCN 通道的门控也因其非常慢的激活和失活速度而引人注目，时间常数在 100 毫秒到秒的范围内，具体取决于异构体。在哺乳动物的 HCN 通道中，HCN1 激活和失活速度最快，HCN2 和 HCN3 具有中等速率，而 HCN4 最慢。窦房HCN4 同工型的缓慢门控使其在整个心动周期中保持开放，从而有助于其在窦房结肌细胞中驱动起搏器活动 。在更短的神经元动作电位期间，更快的 HCN 通道同工型也可能出现类似现象。
12.4 离子通透性
HCN 通道通过混合阳离子电流，单通道电导率非常低（~2 pS）（DiFrancesco，1986）。HCN 通道的选择性过滤器包含一致的GYG 基序，这是 K+ 选择性通道的标志。然而，HCN 通道也传导 Na+，K+：Na+ 通透性比约为 4:1。 HCN 通道传导 Na+ 的能力源于 GYG 基序周围残基的差异，这导致保守的 Tyr 残基在 HCN 通道中的取向不同。因此，HCN 通道的选择性过滤器只有两个 K+ 结合位点，而不是 K+ 选择性通道中的四个，这一特征被认为允许 Na+ 通过。HCN 通道以电压依赖性方式被 Cs+ 阻断，并且它们不能渗透 Ca2+ 或其他二价离子。
混合的 Na+/K+ 渗透性使生理溶液中的 HCN 通道产生约 -30 mV 的净反转电位。因此，HCN 通道在许多细胞中具有很大的兴奋作用。然而，反转电位与慢门控一起允许HCN 通道在响应生理电压刺激（如窦房结动作电位）时传导内向和外向电流。这允许 HCN 通道通过在其中间反转电位附近向两个方向提供驱动力来驱动膜电位振荡。
12.5 调节和细胞生物学
环核苷酸是研究最深入的 HCN 通道调节剂。它们与CNBD 结合，以典型地将电压依赖性激活转移到更正的电位，加快激活速度，并减慢失活速度（图 12.2）。虽然 cAMP是完全激动剂并且具有最高亲和力，但其他环核苷酸，如 cGMP 和cCMP，也可以结合并调节 HCN 通道。环核苷酸的作用是同工型特异性的。在 HCN2 和 HCN4 中，cAMP 导致电压依赖性去极化偏移 10-20 mV。相比之下，HCN1 对 cAMP 的反应变化较小（2-6 mV），而 HCN3 对环状核苷酸不敏感。
环状核苷酸结合和门控之间的变构耦合仍然是一个活跃的研究领域。环状核苷酸的结合会诱导 CNBD 和 C 连接体的构象变化，从而通过一系列分子内相互作用影响电压依赖性门控。这些包括 C 连接体与 S6 跨膜结构域的直接连接以及 C 连接体与 S4 以及可能的 HCND 之间的接触（图 12.1）。CNBD 的缺失部分模拟了 cAMP 结合的影响，导致电压依赖性发生正向转变并加速通道激活。因此，人们认为未配体的 CNBD 会抑制通道门控，而 cAMP 结合会缓解这种“自身抑制”（Wainger 等人，2001 年）。有趣的是，CNBD 的缺失不会重现由环核苷酸结合引起的失活减慢，这表明不同的分子途径介导 cAMP 对激活和失活的影响（Wicks 等人，2011 年）。已证明许多蛋白质与 HCN 通道相关，以调节其表达和门控。研究最深入的 HCN 通道相互作用伙伴是脑特异性蛋白 TRIP8b（含 TPR 的 Rab8b 相互作用蛋白），该蛋白于 2004 年首次发现（Santoro 等人，2004 年）（图 12.3A）。TRIP8b 以 1:1 的化学计量结合并调节所有四种哺乳动物 HCN 通道同工型。有两个不同的相互作用位点具有不同的作用。TRIP8b 的上游位点与 CNBD 相互作用并通过拮抗 cAMP 结合来调节门控。下游位点由 TRIP8b 的 TPR 结构域组成，与 C 端的三个末端氨基酸相互作用以调节表面表达。TRIP8b 受到广泛的替代剪接，预计会产生至少十种不同的翻译蛋白。据报道，不同的变体会增加或减少 HCN 通道表面表达，这在一定程度上取决于细胞环境。然而，所有已知的剪接变体都充当 cAMP 的竞争性拮抗剂。TRIP8b 变体被认为是树突中 HCN 通道富集表达的重要决定因素。TRIP8b 对 HCN 通道的调节有助于学习和记忆、重度抑郁症和癫痫。
人们对其他 HCN 通道调节蛋白知之甚少。ER 跨膜蛋白肌醇 1,4,5-三磷酸受体相关蛋白 (IRAG) 和淋巴限制膜蛋白 (LRMP，也称为 IRAG2) 是最近发现的 HCN4 异构体特异性调节剂，它们对通道激活产生相反的影响 (Peters 等人，2020 年)。IRAG 通过去极化基础电压依赖性来增强 HCN4，而 LRMP 通过降低 cAMP 依赖性激活转变来抑制 HCN4（图 12.3B）。
IRAG 与 HCN4 一起在窦房结中以非常高的水平表达，并且可能在心率调节中发挥作用。
MiRP1（MinK 相关肽）和 KCR1（K+ 通道调节剂）是跨膜蛋白，可调节多种不同的离子通道。据报道，这两种蛋白都对 HCN 通道表达和功能具有同工型特异性影响，包括调节激活率和电压依赖性。其他蛋白相互作用因子，如 Filamin
A、Mint2 和 Tamalin 被认为有助于表达和亚细胞定位离子通道。
与大多数离子通道一样，HCN 通道也受膜磷酸肌醇（如 PIP2）调节。PIP2 可以增强或抑制 HCN 通道。直接应用 PIP2 会导致 HCN 通道电压依赖性发生较大的去极化偏移。
然而，受体介导的磷脂酶 C 激活导致 PIP2 耗竭也会导致去极化偏移，这表明体内 PIP2 对 HCN 通道的调节可能由局部池介导。尽管 PIP2 和 cAMP 的作用可能相似，但它们似乎通过不同的分子途径起作用。PIP2 被认为与 HCN 通道的跨膜结构域和 C 连接体结合。 MiR1 microRNA 以及
Tbx3（T-box 转录因子 3）和 NRSF（神经元限制性沉默因子）转录因子对 HCN 通道进行转录控制。翻译后修饰（如磷酸化）可能有助于
调节天然细胞中的 HCN 通道，尽管它们尚未得到广泛描述。蛋白激酶 A 可以直接磷酸化 HCN4，从而引起电压依赖性的去极化偏移。Src 酪氨酸激酶通过磷酸化 C 连接体中保守残基来加速多种 HCN 通道异构体的激活速度。
12.6 药理学
已经描述了许多结构多样的 HCN 通道阻滞剂，包括
西洛布雷定、ZD7288、扎替布雷定和伊伐布雷定。所有药物都是亲和力在低微摩尔范围内的孔道阻滞剂，并且均等地阻滞 HCN1–4 亚型。所有已知的 HCN 通道阻滞剂均通过阻滞窦房肌细胞中的奇异电流引起心动过缓；然而，没有一种药物对 HCN 通道具有特异性，导致在较高浓度下出现心律失常。在这些化合物中，伊伐布雷定是唯一经美国食品药品管理局批准作用于 HCN 通道的药物。它用于治疗某些类型的心力衰竭和心绞痛。伊伐布雷定通过电压依赖性门从细胞内侧进入孔道来阻滞 HCN 通道。其治疗益处在于降低心率并因此增加心室充盈时间。虽然伊伐布雷定不会穿过血脑屏障，因此副作用有限，但脱靶阻滞视网膜 HCN 通道会导致视觉副作用。伊伐布雷定
还会阻断电压门控 Na+、Ca2+ 和 K+ 通道，包括 hERG，这限制了它作为研究工具的价值。
几种阻断其他类型离子通道的药物也会阻断 HCN 通道，例如全身麻醉药丙泊酚。丙泊酚对 HCN 通道的神经元阻断被认为是其麻醉特性的原因，而窦房 HCN 通道的阻断可能是其心动过缓副作用的原因。局部麻醉药利多卡因对 HCN 通道的阻断可能同样有助于其麻醉效果。右美托咪啶和可乐定等镇痛药也会阻断 HCN 通道并具有心动过缓副作用。
12.7 生理作用
不同的 HCN 通道亚型广泛表达于全身组织中，它们调节细胞兴奋性并经常有助于产生自发性动作电位。
12.7.1 心脏起搏
HCN 通道可能以其在心脏起搏中的作用而闻名。事实上，HCN4 被用作窦房结肌细胞 (SAM) 的分子标记。在 SAM 中，HCN 通道产生funny current (If)，有助于产生自发性动作电位 (AP；图 12.4)，从而有助于确定心率。HCN4 突变会导致窦房结心律失常（图 12.5），阻断 If 会减慢心率，这表明 HCN4 和 If 在起搏中起着关键作用。整体或心脏特异性敲除 HCN4 会导致胚胎死亡，因为起搏电位受损，而条件性敲除 HCN4 的小鼠会出现窦性停搏、心动过缓和房室结阻滞。
长期以来，人们一直认为，在窦房 AP 的超极化阶段，If激活会产生内向电流，从而导致自发性舒张去极化。然而，If在起搏中的确切作用仍然是个谜，因为通道激活的电压范围相对于窦房结的 AP而言相当负，通道的激活速率相比于心动周期又相当慢。因此，在舒张期只能打开一小部分通道。然而，最近的一项研究表明，尽管 If 的开放概率很低，但它在起搏器周期中贡献了相当一部分净电荷运动，因为这些通道在收缩期不会失活 (Peters 等人，2021)。
HCN 通道和 If 对交感神经战斗或逃跑心率增加的贡献也仍未解决。Stimulation of β-adrenergic receptors on SAMs causes a depolarizing shift in voltage dependence of If and increases the fraction of net current during the sinoatrial AP. 然而，携带 HCN4 CNBD 突变的小鼠在交感神经刺激下仍表现出心率有所增加，这表明战斗或逃跑反应是由几种 cAMP 敏感电流引起的，包括 If。
12.7.2 HCN 通道在神经系统中的功能
在神经元中，HCN 通道产生超极化激活电流 Ih，这是静息膜电位和兴奋性的重要决定因素。一般来说，HCN 通道往往对神经元有兴奋作用。它们在静息膜电位下活跃，产生内向电流，稳定亚阈值范围内的静息电位。这种行为表现为响应超极化电流阶跃的膜电位特征性的“sag”——注入的电流导致 Ih 激活，由此产生的内向电流将膜电位推回到其原始值 （图 12.4）。
重要的是，Ih 还可以通过充当分流电流在神经元中产生抑制作用。在这种情况下，静息电位下的 Ih 活动会降低输入电阻，因此需要更多来自其他通道的电流来激发细胞。最终，HCN 通道的净兴奋或抑制作用取决于它们的表达水平、调节途径和细胞中其他电流的净活动。HCN 通道在神经元中的功能通过其定位到不同的亚细胞区室而进一步细化。例如，沿树突的 HCN 通道表达梯度塑造了新皮质和海马神经元兴奋性的时间曲线 (Magee, 1998)。HCN 通道的轴突特异性表达确保了 GABA 能中间神经元中 AP 的快速可靠传播 (Roth and Hu, 2020)。HCN 通道在不同亚细胞区室中的差异分布被认为部分由与辅助亚基 TRIP8b 及其许多剪接变体的相互作用控制。
在中枢神经系统中，HCN 通道广泛表达，包括皮质、丘脑、脑干、基底神经节和海马的神经元。它们与多种大脑功能有关。在丘脑皮质中继神经元中，Ih 调节注意力不集中和睡眠期间的突发放电（McCormick 和 Pape，1990 年）。 HCN 通道还在小脑浦肯野细胞的运动学习和神经元整合中发挥关键作用（Nolan 等人，2003 年），并且它们对运动皮层的运动反应很重要。在中枢听觉神经元中，HCN 通道在编码时间信息和声音定位方面起着根本性的作用。视网膜中的 HCN 通道对于快速刺激的时间分辨率同样重要。有趣的是，HCN 通道是一些内在感光视网膜神经节细胞中非典型光转导所必需的，这些神经节细胞介导非成像视觉，涉及昼夜节律和瞳孔光反射等过程（Jiang 等人，2018 年）。Ih 也被认为是节律性呼吸频率的调节器。在周围神经系统中，背根神经节神经元中的 HCN 通道表达会因神经损伤而增加，HCN 通道抑制剂会减轻疼痛反应。表达 HCN4 的胃肠道神经元会调节逆行蠕动，缺乏 HCN2 的小鼠胃肠功能异常，从而降低食物消耗和胃肠道蠕动。
12.8 通道病、疾病和治疗机会
HCN 通道的广泛组织分布和敲除小鼠的表型为了解可能与通道相关的一系列病理提供了广泛的见解。HCN1 的敲除会增加癫痫发作的易感性并导致运动异常。HCN2 敲除更为严重，动物表现出共济失调和自发性失神性癫痫以及胃肠道功能障碍。 HCN3 基因敲除小鼠具有轻微的
表型，对情境的处理受损信息。最后，HCN4 的整体和心脏特异性敲除在胚胎期是致命的，而 HCN4 的脑特异性敲除会减缓与警觉状态相关的皮质和丘脑振荡。HCN1、HCN2 和 HCN4 中描述了 HCN 通道病。HCN1 和 HCN2 中的功能获得性突变与癫痫密切相关。这些变异被认为通过去极化静息电位和增加兴奋性而导致癫痫发作。HCN4 中的突变与窦房结功能障碍密切相关，尽管一些变异也与其他心律失常有关，例如心房颤动。 HCN4 编码区突变主要聚集在孔域和
细胞内 C 端，而与癫痫相关的 HCN1 突变则分布在整个通道中 (Verkerk 和 Wilders，2015；Marini 等人，2018)（图 12.5）。
HCN 通道已被确定为治疗多种疾病的高优先级药物靶点，其中最明显的例子是通过
HCN4 异构体进行心率控制。如前所述，非特异性 HCN 通道阻滞剂伊伐布雷定被批准用于治疗心绞痛和心力衰竭，其作用是减慢心率。
原则上，HCN4 特异性激活剂也可用于增加心率以治疗与年龄相关的窦房结功能障碍。然而，HCN1 或 HCN2 的特定靶向已被确定为神经性和炎症性疼痛以及抑郁和焦虑的潜在治疗方法。不幸的是，由于缺乏异构体特异性化合物、HCN 通道激活剂和穿过血脑屏障的药物，新药的开发受到限制。由于现有的药理学工具都充当 HCN 通道孔阻滞剂，因此对这些化合物的修饰不太可能产生实质性进展。因此，新的方法将需要针对通道的非孔域，以潜在地充当通道活性的变构调节剂。
12.9 结论
超极化激活的环核苷酸敏感 (HCN) 通道是不寻常的电压门控通道。尽管 HCN 通道的结构类似于电压门控 K+ 通道（后者对 K+ 具有选择性并通过去极化激活），但 HCN 通道对 Na+ 和 K+ 均具有渗透性，并且通过超极化激活。HCN 通道的电压依赖性门控也受环状核苷酸的变构调节。四种哺乳动物 HCN 通道异构体广泛表达于全身，其不同寻常的特性使它们成为细胞兴奋性的重要决定因素。HCN 通道对于心脏窦房结的心脏起搏至关重要。在神经系统中，HCN 通道有助于睡眠/觉醒周期、运动学习和疼痛。HCN 通道的独特性质和组织分布使它们成为治疗从心力衰竭和癫痫到神经性疼痛和抑郁症等各种疾病的诱人药物靶点。