讨论:从DNA到蛋白质

总论

• DNA不直接指导蛋白质合成，而是先通过转录（Transcription）产生RNA，RNA再被翻译（Translation）产生蛋白质，这种过程从细菌到人类一直被遵循，被称为分子生物学的中心法则（Central Dogma）。
• 由RNA翻译产生蛋白质时，直接进入蛋白质的氨基酸一般有20种，在特定情况下还有两种氨基酸也会被加入。
• 翻译产生蛋白质后，它还要被不同细胞器进行多种切割、修饰才能成为有功能的蛋白质。
• 从DNA到蛋白质的每一步，都有可能发生各种各样的调控。

转录

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图1：细菌中的转录

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图2：真核生物中的转录

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图3：真核生物的常见启动子

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图4：真核生物中转录还需其它蛋白启动

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图5：内含子切割

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图6：RNA切割

• 转录发生在细胞核中（细菌中在拟核区），它是根据双链DNA的一条链上的一小段（称为模板，Template），合成与之反向互补的RNA。（参见核酸的结构）
• 由这个过程的特点，RNA在细胞中几乎总是单链，而且长度比DNA短很多，最多几千个核苷酸。
• 同DNA复制一样，转录始于DNA的双螺旋结构部分解开，这是由RNA多聚酶（RNA Polymerase）完成的，因为RNA的合成方向是5‘→3’，所以模板的解链方向一定是3‘→5’。
• 在合成的同时，已合成部分逐步脱离DNA，DNA恢复双螺旋结构。
• RNA合成的原料是三磷酸核糖核苷酸（ATP、UTP、CTP、GTP）。
• 同一个基因可以同时进行多次转录。
• RNA多聚酶不需要引物启动合成，但精度不高，约每10⁴个碱基出一次错。（它的纠错机制只有一层）
• 不像DNA多聚酶，RNA多聚酶在合成过程中不可以和模板脱离。
• RNA多聚酶和DNA多聚酶都以NTP为底物，所以它们都需要Mg²⁺才能发挥活性。
• RNA多聚酶和DNA多聚酶的结构很不相同，因此认为核酸多聚酶在生物进化过程中出现了两次，一次造就了DNA多聚酶、病毒反转录酶和少数病毒RNA多聚酶；另一次造就了所有细胞生物中的RNA多聚酶。
• 并不是所有转录出的RNA都指导蛋白质合成，只有mRNA（Messenger RNA）履行这一职责，其它RNA有：
  • rRNA（Ribosomal RNA）：核糖体RNA，用于组建核糖体。
  • tRNA（Transfer RNA）：用于翻译过程中传递氨基酸。
  • snRNA（Small Nuclear RNA）：小核RNA，在细胞核中发挥多种功能。
  • snoRNA（Small Nucleolar RNA）：小核仁RNA，用于修饰rRNA。
  • miRNA（Micro RNA）：用于RNA翻译调控，见调控RNA。
  • siRNA（Small Interference RNA）：一般是外源RNA，但是也在植物中发现了转录出的siRNA，用于RNA翻译调控，见调控RNA。
  • piRNA（Piwi-interacting RNA）：在生殖细胞中用于对抗转位子，见调控RNA。
  • lncRNA（Long Non-coding RNA）：见调控RNA。
• 转录出的一条RNA称为一个转录单位（Transcription Unit），在真核生物中一般只含一个基因，但在细菌中一般有多个相邻基因。
• 细菌中的转录启动：
  • 细菌只有一种RNA多聚酶，其完全形式（Holoenzyme）由核心酶和一个σ因子组成。
  • RNA多聚酶与DNA相遇时，两者结合不紧密，酶快速在DNA上滑动，但是当遇到特定的启动子（Promoter）时，σ因子与DNA紧密结合，转录开始。
  • 酶将一小段DNA双螺旋打开，形成转录空泡（Transcription Bubble），它只有约10个碱基长，σ因子通过与不作为转录模板的一条链结合来稳定这一结构。
  • 最初转录的方式是酶在原地不动，将DNA的5‘端向活性中心拉，一边拉一边转录，结果每转录约10个碱基，RNA就与DNA完全脱离，转录重新开始，同时DNA分子中会积累张力，最终张力造成σ因子与DNA分离，酶开始向5‘端运动。
  • 每转录一个碱基，酶向前移动一个碱基，同时转录空泡的后端封闭一个碱基。
  • 酶遇到终止子（Terminator）时，与DNA分离，释放转录完成的RNA。
  • 多数终止子由两段互补序列，中间夹着一串A和T交替的序列组成，转录这一段后RNA形成发夹结构，它与酶相互作用引起酶脱离DNA。
  • 细菌在不同生存条件下产生不同的σ因子，识别不同的启动子，每个启动子又略有不同，影响转录的频率；终止子同样是种类丰富。
• 真核生物中的转录启动：
  • 真核生物至少有三种RNA多聚酶，植物中还有另外两种。（用罗马数字表示）
  • mRNA都是由酶II转录的。
  • rRNA中，5S rRNA是由酶III转录的，其它都是由酶I转录的。
  • tRNA是由酶III转录的。
  • snRNA大部分是由酶II转录的，少部分是由酶III转录的；snoRNA都是由酶II转录的。
  • miRNA大部分是由酶II转录的，少部分是由酶III转录的。
  • siRNA若是外源的，则一般都是酶II转录的；若是内源的，则是酶IV转录的，其发挥功能有时需要酶V合成其它RNA。
  • piRNA的起源尚未研究清楚。
  • lncRNA是由酶II转录的。
  • 研究最多的是酶II，它需要多种通用转录因子（General Transcription Factor）才能开始转录，这些因子有TFIIA,TFIIB,TFIIC,TFIID,TFIIE,TFIIF,TFIIH。
  • 对于大多数基因而言，转录启动子的最重要部分是TATA序列，它被TFIID的TBP亚基识别，TFIIA帮助TFIID与TATA结合。（TATA是这种序列花式的名字，其序列一般是TATAAAA）
  • TFIID还能识别一些其它启动子序列，如INR和DPE，它们是由TAF亚基识别的。（它们都在TATA的下游）
  • TFIIB识别TATA上游的BRE序列，并据此将酶II精确摆放至转录起始碱基。
  • 酶II在空闲时与TFIIF结合，它帮助酶与TBP和TFIIB结合，并吸引TFIIE和TFIIH。
  • 最初这个酶也和细菌的RNA聚合酶一样，要经历反复合成短RNA的过程。
  • TFIIH将酶的C端一个丝氨酸残基磷酸化，将酶从启动子解放出来。
  • 然后，所有通用转录因子被释放，转录正式开始。
  • 在通用转录因子组装前，需要先有活化子（Activator，一个蛋白）与增强子（Enhancer，一段DNA序列）结合，将酶吸引过来，并通过中介复合体（Mediator）对酶进行调控。（每个基因有它自己的活化子和增强子，不一定要在基因编码位置附近）
  • 转录还需要染色质重塑复合体（Chromatin Remodeling Complex），用于打开染色质的超螺旋；组蛋白修饰酶，用于打开核小体。
• 转录过程中，延长因子（Elongation Factor）防止RNA聚合酶与DNA脱离。
• 转录区域前方会产生正超螺旋，而后方产生负超螺旋，这被认为有助于打开染色质。
• 真核生物的RNA在转录出后要进行修饰：
  1. 酶II合成的所有RNA的5’端都要加上G帽，只有mRNA的G帽是甲基G帽。
  2. mRNA中所有的内含子都要被切出，有趣的是一个转录单位可以多种方式切出外显子，不同切法就会产生不同的蛋白质。
  3. mRNA的3‘端要加上多聚A尾巴。
• mRNA的切割（又称剪接，Splicing）：
  • 每次切割去除一段内含子，通过两次取代反应完成。（参见常见酶促反应类型）
  • 切割需要很多其它RNA和蛋白质参与，消耗大量ATP。
  • 切割需要识别三个位点：内含子的5’端、3‘端位置、切割下的环状内含子的成环位置，它们都有各自的序列，但变化很多，正是这一点使得分析基因组困难重重。
  • 切割由以snRNA为核心的剪接体（Spliceosome）完成，snRNA有五种，为U1,U2,U4,U5,U6。
  • 本质上，剪接体是核酶，但是剪接体的活性位点是由RNA和蛋白质共同组成的，这一点很罕见。
  • 切割位点的选择并不完全是以序列决定的，其它因素有：
    • SR蛋白能与外显子中特定序列结合，从而将剪接体吸引至外显子的边界。（因为外显子的长度通常都在150碱基左右）
    • 外显子通常分布在核小体周围，有实验证据显示染色质结构会影响剪接结果。
• 只有完成切割，5’端有甲基G帽，3‘端有多聚A尾巴的mRNA才会被输出细胞核，进行翻译。
• 古菌只有一种RNA多聚酶，工作方式更接近于真核生物的酶II，但它同时又产生多种与细菌的σ因子同源的蛋白质，相当于通用转录因子。

翻译

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图7：翻译密码表（通用）

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图8：tRNA与氨基酸结合

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图9：核糖体的工作机制

• 翻译的基本原则是：核糖体从5’端开始阅读mRNA，以连续三个碱基为一个密码子，根据密码表选择对应的氨基酸添加到正在合成的多肽的C端，即从N端向C端合成多肽；当遇到终止密码子时，翻译结束。
• 在绝大多数生物中，密码表都是一致的，但是在一些生物中密码表有微小变化，在质体和线粒体中这些变化特别多，由此可以追踪质体在细胞中内共生的历史。
• 密码子是通过tRNA被识别的。
  • tRNA的结构见核酸的结构，这里只说明它的合成过程。
  • tRNA的前体被转录出后，首先折叠成四叶草形，然后被切除内含子，这里不是用剪接体切除，而是有专门的蛋白质酶。
  • 氨酰tRNA合成酶（Aminoacyl tRNA Synthetase）将氨基酸加至tRNA的3‘端，一般每个氨基酸各有一个这样的酶，适用于所有携带这种氨基酸的tRNA。
  • 在细菌中不是每个氨基酸都对应有这样的酶，有些氨基酸是先将其它氨基酸加至3’端，再被化学修饰成正确的氨基酸。
  • 连接氨基酸分两步，先将氨基酸与ATP连接（释放焦磷酸），然后再将氨基酸与tRNA相连（释放AMP）。
  • 氨基酸与tRNA相连的键能量很高，在合成肽链时已合成部分的C端残基是和tRNA共价相连的，利用此键能使反应向着延长肽链的方向进行。
  • tRNA合成酶识别tRNA的方式有两种：直接识别和间接识别。
  • 直接识别就是反密码子的碱基直接与酶的结合位点特定区域互补；间接识别就是酶识别tRNA的其它位置，如D柄和可变环。
  • 从结构上，tRNA合成酶又可分为两类：I类一般是单体，活性中心有罗斯曼折叠（Rossman Fold）；II类一般是二聚体，有时是四聚体，其活性中心是α螺旋和β折叠片的混合。
• 原核生物和真核生物的核糖体都由大亚基和小亚基组成，分别的功能也相同，但结构不同，不合成蛋白质时它们是分离的。
• 小亚基提供mRNA的结合位点，两个亚基共同提供tRNA的结合位点，大亚基催化成肽键的反应。
• 核糖体有三个tRNA结合位点，依次称为E,P,A。
• 向一个正在合成的肽链上添加一个氨基酸要经过四步：
  1. 肽链C端的tRNA位于P位点，新氨基酸的tRNA位于A位点，其反密码子与mRNA互补结合。
  2. 大亚基催化P和A位点的氨基酸之间形成酰胺键，P位点的tRNA与氨基酸脱离。
  3. 大亚基向3‘端移动，P位点的tRNA进入E位点。
  4. 小亚基向3’端移动，A位点的tRNA进入P位点，E位点的tRNA离开核糖体。
• tRNA与mRNA的配对不一定要完全一致，第三个碱基可以是摇摆配对（Wobble Pair），即G可以和U配对，而I（次黄嘌呤核苷）可以和U,C,A配对，这样细菌中最少可以只有31个tRNA，但人体中有500多个tRNA。
• 延长因子（Elongation Factor）协助合成肽链：
  • 细菌中的延长因子是EF-Tu和EF-G；真核生物中对应的是EF1和EF2。
  • 它们通过水解GTP促进反应向正方向发生。
  • EF-Tu与新进入的tRNA结合，然后小亚基的蛋白质检测密码子-反密码子配对是否正确，只有结合正确时，构象改变，EF-Tu水解GTP然后和tRNA分离，合成反应才能继续。
  • 如果的确有不正确的氨基酸被加入肽链，后续错误几率会大大增加，结果多肽很快被提前释放，然后被蛋白质酶体降解。
• 核糖体识别mRNA中的起始密码子，并从此处开始合成肽链，最常见的起始密码子是AUG，在真核生物中是甲硫氨酸，在原核生物中是甲酰甲硫氨酸。
  • 真核生物中，其它的起始密码子非常罕见，在哺乳动物中发现过以CUG（亮氨酸）为起始。
  • 原核生物（和线粒体、质体）中则有较多其它起始密码子，主要是GUG和UUG，也发现过AUU和CUG。
  • 起始的这个甲硫氨酸在很多时候被蛋白酶切除。
• 真核生物中，翻译起始不仅需要Met-tRNA，还需要起始因子（eIF），在它们的帮助下Met-tRNA直接与核糖体小亚基的P位点结合。（此时大小亚基尚未结合）
• 大小亚基结合后，与mRNA的5‘端G帽结合，并向3’端运动，至第一个AUG处停下开始合成。
• 有约10%的情况，核糖体会跳过第一个AUG，这是因为它扫描的并不只是AUG，而是ACCAUGG，如果AUG两侧的碱基序列与此相差太大，有一定几率核糖体会跳过。
• 这一现象会造成一个mRNA能产生两种不同的蛋白，如果跳过的这一段编码的是信号肽，则会造成同一个蛋白质进入两个不同的细胞区间。
• 细菌的mRNA没有G帽，核糖体与之结合时识别的序列是AGGAGGU（称为Shine-Dalgarno序列），这个序列可以出现在mRNA内部，这与细菌的mRNA常同时编码多个蛋白相吻合。
• 核糖体遇到UAA,UAG,UGA这三个密码子时，释放因子（Release Factor）与A位点结合，翻译终止。（它们依次被称为赭石密码子、琥珀密码子、乳白密码子，之所以这样命名是因为第一个发现的是UAG，被以发现人的名字命名，恰好是Amber（琥珀），后来就遵循了以石头名称命名的惯例）
• 同转录一样，mRNA也可同时被多个核糖体翻译。
• 转码（Recoding）：对于某种生物特定的密码表而言，一个密码子本应编码这个氨基酸，在实际中对于特殊的mRNA却编码那个氨基酸甚至被跳过不编码的情况。
  • UGA有时编码硒半胱氨酸（Selenocysteine，Sec，U），它是将半胱氨酸的S换为Se的结果，真核生物、细菌、古菌中都有这种现象，但植物中没有。
  • Sec-tRNA比正常的tRNA长，主要是T柄长，Sec是通过修饰Ser得到的。
  • UGA是否被解读为Sec是通过密码子下游的二级结构确定的，更具体地说，要存在SECIS元素。
  • 细菌中，SECIS元素紧邻UGA密码子，而在古菌和真核生物中它在3‘端不翻译部分中。
  • SelB蛋白和SECIS元素结合，同时又和Sec-tRNA结合，这样Sec才能被加入多肽。
  • 古菌和真核生物不仅有SelB蛋白，还有SBP2蛋白，才能正常加入Sec。
  • 厚游仆虫（Euplotes crassus）中发现，UGA既可编码半胱氨酸又可编码Sec，产生两种蛋白。
  • 一些古菌和细菌中，UAG有时编码吡咯赖氨酸（Pyrrolysine，Pyl，O）。
  • 吡咯赖氨酸出现于甲胺甲基转移酶（Methylamine Methyltransferase）的活性中心。
  • Pyl-tRNA比较短，缺少U8核苷酸，D环和可变环较短。
  • Pyl进入多肽的选择机制尚不清楚。
  • 移码（Frameshifting）即核糖体跳过了一个或多个碱基（注意是碱基不是密码子）。
  • 移码有两种情况：有些特定mRNA序列会使A位点的tRNA向3’端或5‘端移动一个碱基；有些变异的tRNA的密码子是四个碱基而不是三个。
  • 核糖体有时会跳过（Bypassing）一大段mRNA，这种现象非常少见，典型例子是噬菌体T4的基因60。（就是以其翻译过程中跳过60个碱基而命名的）
  • 细胞营养不良时，偶尔会观察到跳过现象。
  • 细菌和线粒体中，如果因某种原因，核糖体卡住无法继续合成多肽，则有tmRNA帮助核糖体与mRNA分离。
  • tmRNA有两部分，前一段是Ala-tRNA，后一段是mRNA，它编码一段信号肽，使合成的蛋白质被蛋白质酶降解。
  • tmRNA现象蕴含着一个极端罕见的现象，即多肽可以由两个mRNA共同编码。
• tRNA基因变异可以抵消其它基因变异，因此tRNA的变种被称为抑制子（Suppressor）。
  • 根据tRNA变异后识别的密码子是终止密码子还是正常密码子，tRNA抑制子又分为无义抑制子（Nonsense Suppressor）和转义密码子（Missense Suppressor）。
  • 每一种终止密码子都有对应的无义抑制子，不过并不总是由反密码子环变异而来，例如一种识别UGA的tRNA是由D柄的一个变异引起的，它使tRNA带有奇怪构象，允许C和A配对。
  • 在抑制某个基因变异的同时，变异tRNA必然引起其它多肽合成出现错误，事实上变异tRNA总是和正常识别该密码子的tRNA竞争，并且变异tRNA不能处于竞争上风。
  • 识别UAG（琥珀）的无义抑制子在竞争中可以较强，这是因为UAG是三个终止子中出现频率最低的；转义抑制子是竞争力最弱的。

翻译之后

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图10：伴侣素的工作机制

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图11：蛋白质酶体

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图12：引起蛋白质降解的方式

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图13：蛋白质在细胞各区间的运输

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图14：SRP与SRP受体的功能

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图15：蛋白质也可在合成完后被运入内质网

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图16A：跨膜蛋白进入内质网的方式

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图16B：跨膜蛋白进入内质网的方式

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图17：C端嵌入内质网膜的方式

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图18：核孔复合体的结构

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图19A：Ran蛋白保证核孔运输方向的正确性

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图19B：Ran蛋白保证核孔运输方向的正确性

• 多肽需要折叠（Folding），即形成正确的构象，才能发挥作用。
• 分泌到细胞外的蛋白，还要形成正确的二硫键，但是细胞内的蛋白一般没有二硫键，这是因为细胞内还原性物质较多，二硫键不能稳定存在。
• 多肽折叠在核糖体正在合成多肽时就已经开始了，有时需要分子伴侣（Molecular Chaperone）帮助。
  • 从功能上分，分子伴侣有三类：
    1. 稳定器（Stabilizer）：它们与新合成或折叠错误的多肽结合，防止它们与其它多肽相互作用聚集沉淀，识别折叠错误多肽的标志是它们暴露的内部疏水氨基酸残基；稳定器与多肽结合不需要能量，但它也不帮助多肽折叠正确。
    2. 伴侣素（Chaperonin）：它在结构上像一个桶，将已合成完的多肽装入其中，通过改变构象促使多肽重新折叠，直至折叠正确，其工作需要大量ATP。
    3. 酶：例如蛋白质二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase）和肽基脯氨酰顺反异构酶（Peptidyl Prolyl Cis-trans Isomerase）。
  • 大部分分子伴侣属于热激蛋白（Heat Shock Protein，因细胞在受热等极端条件下大量合成这些蛋白而得名），它们是一些进化上高度保守的蛋白，主要成员有：
    • HSP70是稳定器，但它还有帮助蛋白质进出内质网、线粒体、质体的功能、帮助一些蛋白寡聚化、将蛋白质递给伴侣素的功能。
    • sHSP是稳定器，功能比较简单，此外眼睛的眼角膜、晶状体中所含的α晶状体球蛋白（α-Crystallin）在结构上也是sHSP，但没有sHSP的功能。
    • HSP60出现于细菌细胞质和线粒体、质体的基质，属于伴侣素，在原核生物中称为GroEL。（这个“桶”的盖子是另一个蛋白，原核生物中是GroES，真核生物中是HSP10）
• 无法在分子伴侣的帮助下折叠正确的蛋白，则被送往蛋白质酶体（Proteosome）降解。
  • 蛋白质酶体非常丰富，占细胞中所有蛋白的1%，细胞质和细胞核中都存在。（进入内质网的错误折叠蛋白则需被送回细胞质然后被降解）
  • 蛋白质酶体的核心是20S复合体，形态是一个中空圆柱；两头各有一个19S复合体的帽子，是一个有狭长管道的复合体，19S复合体中的AAA蛋白通过水解ATP使多肽解开折叠，以线状通过此管道进入。
  • 只有被泛素（Ubiquitin）标记的蛋白才会被送入蛋白质酶体，泛素标记一般是由E3蛋白加上的。
• 多肽的许多氨基酸残基需要被修饰，常见修饰方式有：
  • 磷酸化（Phosphorylation）：一般都发生于丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，罕见情况下有天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸。
  • 乙酰化（Acetylation）：最常见于赖氨酸和丙氨酸；除了天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸外都有可能发生。
  • 泛素化（Ubiquitylation）：一般都发生于赖氨酸，罕见情况下有甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸。
  • 糖基磷脂酰肌醇（GPI）：常连接于丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸。
  • 甲基化（Methylation）：最常见于赖氨酸和精氨酸；除了酪氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬氨酸外都有可能发生。
  • 生物素（Biotin）只能和赖氨酸结合。
  • FMN可以和苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸结合；FAD可以和酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸结合。
  • ADP一般和精氨酸结合，偶尔和半胱氨酸、组氨酸、天冬酰胺结合。
  • 蛋白聚糖和天冬氨酸结合。
• 蛋白质在细胞各分区间的转运：
  • 蛋白质进出各区间的方式有三种：
    • 门控运输（Gated Transport）：通过核孔复合体进出细胞核。
    • 蛋白质转位（Protein Translocation）：通过转位器直接跨过膜，如进出内质网、线粒体、质体、过氧化物酶体，以及膜蛋白；在此过程中蛋白质必须解开折叠。
    • 囊泡运输（Vesicular Transport）：蛋白质被装入有单层膜的囊泡中，然后被运输。
  • 蛋白质被运输，一般需要有被细胞识别的信号肽（Sorting Signal）。
  • 进入内质网是唯一在翻译过程中就开始进行的转运过程，其信号肽也是第一个被发现的信号肽。
    • 细胞质中有SRP蛋白（Signal Recognition Particle），它是一个含RNA的复合体。
    • 进入内质网的信号肽的位置和具体序列差异很大，共同特征是含有8个或更多非极性氨基酸。
    • SRP识别正在合成的多肽的信号肽，并与核糖体结合，将翻译暂停，暂停期间将核糖体拖至内质网膜上，与SRP受体（SRP Receptor）结合。（注意，必须是正在核糖体上合成的多肽才会被SRP结合）
    • 然后，正在合成的多肽通过一个转位器进入内质网，转位器的核心是Sec61复合体，平时其通道被一个α螺旋盖住，转位器与信号肽结合后通道打开。
    • 在整个转运过程中，转位器都是与信号肽结合的，之后信号肽被切下释放入内质网膜，被那里的蛋白酶降解。
    • SRP、SRP受体、Sec61复合体都是在原核生物中就已存在的，进化保守的蛋白复合体。（原核生物中它们的功能是将蛋白质运出细胞膜）
    • 核糖体与转位器结合后，SRP和SRP受体被释放，去处理其它多肽。
    • 细菌和真核生物中，有时也会观察到蛋白质被合成完后才被运入内质网，此时要求多肽合成结束后与稳定器（分子伴侣）结合，不折叠。
    • 内质网的单次跨膜蛋白有三种情况：
      • 信号肽在N端，多肽内部有一个终止转位信号，只有N端至此信号的一段进入内质网，结果N端在膜内，C端在膜外。
      • 信号肽在多肽内部，它与转位器结合后又分N端进入和C端进入内质网两种情况。
    • 多次跨膜蛋白，一般信号肽在多肽内部，且内部有多个起始转位和终止转位的信号。
    • 有些蛋白，其大部分结构在细胞质中，只有C端一小段嵌入内质网膜，这种蛋白不是通过上述机制进入内质网的，而是合成完后被Get3蛋白识别，运至内质网膜的。（SRP蛋白必须结合正在合成的多肽，所以信号肽不可能出现在C端）
  • 进入细胞核是通过核孔复合体（Nuclear Pore Complex）实现的：
    • 核孔复合体由若干种核孔蛋白（Nucleoporin）的大量拷贝组成，结构高度对称。
    • 核孔复合体一秒能运输超过1000个大分子（RNA或蛋白质），而且能同时双向运输，机制不明。
    • 对于小分子而言，核孔复合体是可以自由扩散的通道。
    • 核孔复合体的结构：
      • 最外层是跨膜蛋白，将其它蛋白固定。
      • 跨膜蛋白与骨架蛋白（Scaffold Nucleoporin）结合，它在核孔外侧围成多层。
      • 最里层是通道蛋白（Channel Nucleoporin），它向通道中伸出大量富含苯丙氨酸和甘氨酸的不折叠的丝（FG丝）。
      • 骨架蛋白向细胞核内和细胞质伸出大量的丝，其中细胞核内的丝在远处汇聚集中形成小篮结构。
    • 将蛋白引导入细胞核的信号肽称为核定位信号（Nuclear Localization Sequence），位置差异很大，大部分的特征是富含赖氨酸和精氨酸。
    • 核定位信号与细胞质中的输入蛋白（Importin）结合，输入蛋白再与核孔复合体中央的FG丝结合，通过核孔，在核内输入蛋白与被转运蛋白分离，输入蛋白离开细胞核。
    • Ran蛋白确保核孔运输向正确方向进行：
      • Ran既能和GTP结合又能和GDP结合，细胞核中有GEF蛋白将其结合的GDP换为GTP；细胞质中有GAP蛋白将其结合的GTP变为GDP。
      • 结果，细胞核中Ran-GTP较高，而细胞质中Ran-GDP较高。
      • 与被转运蛋白结合的输入蛋白，必须遇到Ran-GTP才能与结合的蛋白释放，这样就保证了蛋白转运的方向性。
    • 也有些蛋白带有输出细胞核的信号，作用方式类似上述介绍。
    • 还有些蛋白同时有进入细胞核和输出细胞核的信号，它们会在核膜两侧反复穿梭。
  • 进入线粒体、质体的方式：
    • 进入线粒体基质的蛋白，其信号肽通常是N端的一段两亲α螺旋，这种信号肽有时被称为导肽。
    • 所有线粒体外膜蛋白、大部分内膜和膜间隙蛋白，都没有导肽，其信号肽在多肽内部。
    • 跨过线粒体外膜和内膜分别需要TOM和TIM复合体，嵌入外膜和内膜又分别需要SAM和OXA复合体。
    • 将蛋白质运过线粒体内膜，既消耗ATP也消耗质子浓度梯度。
    • 将蛋白运入质体的方式类似，也是用导肽，但不消耗质子浓度梯度。
  • 过氧化物酶体的一部分蛋白质来自细胞质，一部分来自内质网的囊泡。
  • 分泌到细胞外的蛋白都来自内质网的囊泡。