凋亡的特征和分子标记
摘要
细胞凋亡具有一系列典型的形态学特征，例如细胞收缩、分裂成膜结合凋亡小体和邻近细胞的快速吞噬作用。本文回顾了目前关于细胞凋亡的分子机制的知识，这些机制与形态学特征有关，并有助于检测心脏组织中的细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶（称为胱天蛋白酶）的激活在细胞凋亡的执行中起着重要作用。这些蛋白酶选择性地裂解重要的细胞底物，导致细胞凋亡形态和选择性激活的 DNases 引起的 DNA 核小体间断裂。响应几种促凋亡信号，线粒体释放胱天蛋白酶活化因子，启动不断升级的胱天蛋白酶级联并导致细胞死亡。Bcl-2 癌蛋白家族的成员控制线粒体事件，能够预防或诱导凋亡和非凋亡类型的细胞死亡。这表明不同类型的细胞死亡在早期阶段具有共同的机制，而胱天蛋白酶的激活决定了细胞死亡的表型。目前，检测组织样本中的凋亡细胞依赖于 TUNEL 检测。TUNEL 阳性的心肌细胞表现出凋亡的形态特征和 DNA 电泳中的典型阶梯状图案。因此，只要染色方案经过仔细标准化，这种定量方法就能提供心脏样本中心肌细胞凋亡发生的可重复结果。最近，已经开发出基于 DNA 碎片分析或 caspase 活化证明的潜在更具体的检测方法。应测试这些检测方法是否适用于证明心肌细胞凋亡。
1. 简介
细胞凋亡的特征是一系列典型的形态学事件，例如细胞收缩、分裂成膜结合的凋亡小体和邻近细胞的快速吞噬作用 [1]。多年来，基因组 DNA 的核小体间碎片化一直是细胞凋亡的生化标志 [2]。细胞死亡过程以有组织的方式进行，反映了保存完好的分子途径的存在。最近，重要细胞底物的选择性蛋白水解被认为是细胞凋亡变化的关键分子机制。本文回顾了与细胞凋亡形态学特征、它们在检测细胞凋亡中的意义相关的当前知识。以及区分细胞凋亡和其他形式的细胞死亡。我们讨论了这些问题在评估心肌细胞凋亡中的意义。
2. 细胞凋亡的阶段和时间过程
在生理条件下，组织中发生细胞凋亡通常是一种罕见事件。因此，在任何时间点都只能看到少量的凋亡细胞。对以同步方式诱导细胞凋亡的细胞胞浆提取物的研究表明，细胞凋亡可分为生化和形态学上不同的阶段 [3,4]。在第一阶段，促凋亡刺激触发凋亡中心分子机制的激活（启动阶段）。在第二个committed阶段或效应阶段，分子执行机制被完全激活，如承诺细胞的细胞质提取物能够诱导细胞核中的凋亡变化所示 [3,4]。只有在这之后，即第三阶段或退化阶段，细胞凋亡的特征才会变得明显。这些包括形态学变化和 DNA 碎片化。细胞群中细胞凋亡死亡的异步性主要是由于起始阶段的持续时间高度可变。在细胞培养视频显微镜研究中，动态形态学变化在光学显微镜水平上，凋亡总是在 2 小时内发生 [5,6]。细胞凋亡的临界点出现在形态学特征出现前几个小时 [6,7]。在体内，凋亡细胞死亡的持续时间估计为 6 至 24 小时，尽管它可能因细胞类型而异 [1,8]。由于凋亡的时间很短，因此在单个时间点上只有少数细胞发生凋亡，因此凋亡的定量意义很容易被低估。
3. 凋亡的形态学特征
凋亡的定义首先基于电子显微镜下形态学特征的独特序列，由 Kerr 等人于 1972 年描述。[1,9]细胞凋亡的开始以细胞和细胞核的收缩以及核染色质凝结成轮廓清晰的团块为特征，这些团块沿着核膜边缘化。随后，细胞核逐渐凝结并碎裂（karyorrhexis）。细胞从周围组织分离，其轮廓变得convoluted并形成延伸物。“budding”一词是指延伸五分离和质膜密封以在分离的固体细胞物质周围形成单独膜的过程。这些凋亡小体挤满了紧密堆积的细胞器和细胞核碎片。包括膜和线粒体在内的精细结构在体内保存完好。凋亡小体被邻近细胞（包括巨噬细胞和实质细胞）迅速吞噬。凋亡小体可以在这些细胞内被识别，但最终会降解。如果碎裂的细胞没有被吞噬，它将经历类似于坏死的降解，这一过程称为继发性坏死 [1,9]。凋亡收缩、分解成凋亡小体和单个细胞的吞噬通常发生在没有相关炎症的情况下，炎症是细胞内内容物释放到组织中的结果。最近的研究表明，活化的 caspase 蛋白酶对一组关键蛋白质的蛋白水解切割在凋亡形态的形成中发挥作用（表 1）[10]。虽然这些蛋白质降解导致细胞凋亡形态的确切机制仍不清楚，但许多 caspase 靶蛋白参与膜相关皮质微丝细胞骨架的形成和调节，这是细胞形状的重要决定因素（表 1）[11-20]。caspase 裂解形式的 Gas2 或凝溶胶蛋白的过度表达会导致细胞形状发生显著变化，类似于细胞凋亡 [18,19]。其他蛋白酶，如钙蛋白酶 [11,14]，也参与了细胞骨架凋亡变化的信号传导。
| Protein | 功能/定位 |
|---|---|
| Actin | 微丝形成蛋白，具有多种定位和功能，例如调节皮质细胞骨架的细胞形状 |
| Spectrin/fodrin | 皮质细胞骨架中的肌动蛋白交联蛋白 |
| Beta-catenin | 细胞间连接位点的细胞内附着蛋白 |
| Gelsolin | 微丝剪切蛋白 |
| Gas2 | 微丝组织蛋白 |
| PAK2 | 参与细胞骨架调控的蛋白激酶 |
| MEKK-1 | 调节细胞在细胞-基质及细胞-细胞接触位点的存活和形态 |
| FAK | 调节细胞在细胞-基质及细胞-细胞接触位点的粘附 |
| Keratins 18 and 19 | 角质形成细胞中的中间纤维蛋白 |
| Rabaptin 5 | 调节细胞内囊泡运输的膜蛋白 |
| Lamin A and B | 形成核纤层的中间纤维蛋白 |
| NuMa | 核染色质-基质蛋白相互作用的介导蛋白 |
细胞间和细胞间基质之间的两种蛋白激酶附着位点也是 caspase 的靶点 [21,22]。胱天蛋白酶对它们的切割导致促凋亡信号进一步增强 [21]，并可能导致细胞与周围组织分离 [22]。核膜支撑结构核纤层的分解也是细胞凋亡中核破裂的重要特征 [3]。该过程依赖于胱天蛋白酶介导的核纤层蛋白 A 和 B 的降解 [23,24]。参与调节染色质结构 [25] 或染色质与核基质蛋白之间相互作用的蛋白质，例如核有丝分裂相关蛋白 (NuMa) [26]，也被切割。胱天蛋白酶蛋白酶甚至与磷脂酰丝氨酸的外化有关，磷脂酰丝氨酸介导邻近细胞识别凋亡小体 [15,27,28]。
在心肌细胞中，已在光学显微镜水平上报告了几种凋亡特征（图 1）（综述见 [29]）。这些包括细胞核凝聚、细胞质收缩、轮廓卷曲和与周围组织的分离。使用电子显微镜，已在退化传导系统心肌细胞 [30]、实验性心力衰竭 [31] 和人类冬眠心肌 [32] 中描述了凋亡的形态特征。还观察到了被巨噬细胞和心肌细胞吞噬的凋亡小体，但在此阶段无法识别凋亡小体的来源细胞类型 [30,31]。
4. 凋亡的生化标志
4.1.核小体间 DNA 碎片化
细胞凋亡的生化特征是内源性 DNases 降解 DNA，将核小体间区域切割成 180-200 个碱基对 (bp) 的双链 DNA 片段 [2]。DNA 片段包含平端 [33] 以及单碱基 39 突出端 [34]。
核小体间碎片化已被证实在各种情况和细胞类型中都具有特征明确的凋亡形态（综述见 [35]）。
多种 caspase 底物参与 DNA 结构、修复和复制的调节 [25]。
负责细胞凋亡过程中碎片化的 DNase 酶包括 DNA 碎片因子 (DFF40) [36]、caspase 激活的 DNase (CAD) [37,38]
以及造血细胞中的 NUC70 [39]。 DFF40 和 CAD 以无活性的异二聚体形式存在于正常细胞中，与抑制蛋白 DFF45 [40] 和 ICAD（CAD 抑制剂）[38] 一起存在。这些酶在被 caspase 3 [38,40] 或其他成员切割后被选择性激活。将细胞核暴露于活化的 CAD 或 DFF40 足以诱导细胞凋亡的典型核形态学变化 [36,37]。大尺寸（50-300 kbp）DNA 片段的形成先于核小体间碎裂，但上述 DNases 在此过程中的作用尚未研究 [35]。
核小体间 DNA 碎裂的证明是细胞凋亡检测的一大进步。DNA 片段在分离的 DNA 电泳中可检测为阶梯状 [2]。通过末端转移酶介导的 DNA 缺口末端标记 (TUNEL) 检测，含有 DNA 链断裂的细胞在光学显微镜分析中可见 [8]。组织样本中细胞凋亡的量化依赖于此或相关方法。
在几种生理和病理条件下的心脏组织样本中可以发现 TUNEL 阳性心肌细胞（综述见 [29,42]）。然而，在同一情况下的连续研究中获得的定量结果存在很大差异。TUNEL 检测作为检测细胞凋亡的方法的有效性甚至受到质疑 [43]。这些问题表明 TUNEL 检测存在方法学复杂性。DNA 损伤不是细胞凋亡的独特特征，但可能发生在坏死、可逆性损伤 DNA 修复过程中以及死后自溶过程中 [34,44]。末端转移酶将标记的核苷酸添加到各种 DNA 末端 [45]。TUNEL 检测的染色动力学取决于 DNA 链断裂对染色试剂的可及性。这因组织类型和组织制备程序而异，例如固定和蛋白水解预处理 [29]。因此，为了避免假阳性或阴性结果，仔细标准化染色条件非常重要 [29]。我们的经验 [46,47] 是，细胞凋亡的最佳阳性对照是用 DNase I 酶处理相邻的心肌组织切片以诱导 DNA 链断裂的形成。将组织切片在钠中加热um 柠檬酸盐（808C，30 分钟）并用
蛋白酶 K（10 mg/ml，378C，30 分钟）消化以暴露 DNA。
为了确认检测的最佳灵敏度和特异性，
应使用光学显微镜监测碱性磷酸酶染色
反应的发展，并在 DNase 处理的控制部分出现强阳性时终止。这些程序还使染色结果标准化，以适应试剂组织通透性的差异。
使用这种方法，定量结果是可重复的（重复程序结果的 r50.88）
[47] 并且 TUNEL 阳性心肌细胞显示出一些凋亡形态的特征，例如浓缩核 [46,47]（图 1）。相反，我们没有观察到 TUNEL 染色在表现出凝固性坏死特征的细胞中 [46]。在我们手中，当 TUNEL 阳性心肌细胞的比例超过约 0.04% [46] 时，心肌样本中就会出现 DNA 梯状结构（图 1）。其他人则表明，神经组织 48 小时的死后自溶 [48] 和心脏组织 24 小时的死后自溶 [49] 不会影响 TUNEL 检测的可靠性。
4.2. 胱天蛋白酶活化
白介素-1b 转换酶 (ICE) 在结构上与秀丽隐杆线虫细胞死亡蛋白 CED-3 相关，而 CED-3 是这种动物发生细胞凋亡所必需的，这一事实首次表明 ICE 和相关酶也可能与哺乳动物的细胞凋亡有关 [50,51]。 ICE 成为蛋白酶家族（caspase）的第一个成员 [52]，该家族在细胞凋亡的执行中起着重要作用 [53–58]。许多遗传和生化研究表明，caspase 活化对于细胞死亡的凋亡表型的发生至关重要 [59–61]。然而，细胞死亡本身并不一定依赖于 caspase，因为即使 caspase 活性受到抑制，细胞也会通过非凋亡形态死亡 [5,7,59,62]。
caspase 是半胱氨酸蛋白酶，可在天冬氨酸残基后特异性切割其底物蛋白（综述见 [63]）。它们是组成性形成的，通常以无活性的酶原形式存在。为了诱导完全的酶活性，它们需要在特定的内部天冬氨酸残基处进行切割，这些残基将大亚基和小亚基彼此分开 [63]。关于底物特异性、前结构域结构和生物学功能的研究表明[10,63–67]，caspase 在细胞凋亡过程中以自我扩增级联的方式被激活。促凋亡信号激活上游 caspase，如 caspase 2、8、9 和 10，导致下游或效应 caspase 3、6 和 7 的蛋白水解激活。效应 caspase 实际上会裂解一组重要蛋白质，从而启动和执行细胞凋亡降解阶段，包括 DNA 降解和典型的形态学特征。caspase 活化的两种主要途径已被描述（图 2）。一种是通过连接死亡受体（修订于 [68]）启动的，其中包括 Fas 和 TNF 受体。 Caspase 8 是该途径中最顶端的 caspase [65,66]，由受体上的信号复合物激活 [68]。另一条途径，即线粒体途径（综述见 [69,70]），整合了由各种细胞毒性剂、异常致癌基因表达 [71] 和 p53 [72] 引起的凋亡信号。它是 Bcl-2 家族一些凋亡调节蛋白的靶点 [73,74]。它还能扩增受体介导的凋亡 [75]。该途径的关键检查点是细胞色素 C 和其他 caspase 活化因子（如凋亡诱导因子 AIF）从线粒体跨膜空间释放到细胞溶胶中 [69,70,76,77]。 Caspase 9 是此线粒体凋亡途径中最上游的 caspase [67]。激活 pro-caspase 9 需要包括细胞色素 C 的胞浆复合物。
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2014 年 7 月 17 日在圣巴塞洛缪和皇家医院
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图 2。凋亡的主要分子途径以及凋亡和非凋亡细胞死亡之间的关系。死亡受体的连接和 caspase 活化因子（如细胞色素 C）从线粒体释放，分别通过启动 caspase 8 和 9 启动 caspase 级联。线粒体也会扩增受体介导的细胞凋亡。胱天蛋白酶的激活决定了细胞死亡的表型。然而，在某些情况下，细胞凋亡会发展为继发性坏死。Apaf-15凋亡蛋白酶活化因子，ROS5活性氧。线虫死亡基因CED-4同源物称为凋亡蛋白酶活化因子（Apaf-1）和dATP [78,79]。由于线粒体的形态保持完整[1]，细胞凋亡过程中细胞色素C释放的机制一直是讨论的主题。线粒体膜通透性有人提出，细胞凋亡的发生与细胞通透性转换相关，随后打开通透性转换相关孔 [70]，以及在线粒体基质肿胀、线粒体外膜破裂和通透性转换 [69,80] 之前打开选择性释放通道。
研究细胞凋亡存在的一种新方法是证明下游 caspase 的激活。这可以通过对已被 caspase 切割的靶蛋白进行蛋白质印迹检测，或通过酶测定证明 caspase 活性来检测。还产生了仅检测 caspase 底物的切割形式 [81–83] 或活化形式的 caspase 的切割位点特异性抗体 [84–86]。它们可用于通过光学显微镜检测组织切片中的凋亡细胞。
此外，caspase 抑制剂已用于研究细胞死亡是否依赖于 caspase。多项研究已提供心肌细胞死亡中胱天蛋白酶活化的证据。胱天蛋白酶 2、3 和 7 的活性形式在缺血再灌注心肌中产生 [87]。在氧化应激、缺血再灌注心肌、急性心脏移植排斥期间和移植失败的人类心脏中均观察到胱天蛋白酶 3 底物裂解 [87-90]。此外，已证实活化形式的胱天蛋白酶 3 与缺血再灌注心肌中的 TUNEL 阳性心肌细胞共定位 [84]。最近，在移植失败的人类心脏中 [90] 和氧自由基治疗反应中 [88] 观察到细胞色素 C（胱天蛋白酶的主要中间激活剂）从线粒体易位到细胞质。研究表明，胱天蛋白酶抑制剂可预防体外模拟缺血引起的心肌细胞死亡[91]，并可减少缺血再灌注心肌中的心肌梗死面积[87,92]。
5. 细胞凋亡和坏死：细胞死亡谱
细胞凋亡与其他类型细胞死亡之间的差异最近引起了人们的讨论[93]。
细胞凋亡通常与坏死形成对比，坏死被认为是细胞稳态迅速丧失（意外细胞死亡）后细胞死亡的一般表现[1,9,93]。细胞凋亡这一术语专门用于描述由缺血引起的细胞死亡[93]。这些类型的细胞死亡的特征是由于水和电解质积聚而引起的肿胀、早期质膜破裂和细胞器（包括线粒体）破坏。凋亡小体出芽和形成缺失，核染色质不规则地聚集。细胞内内容物的泄漏会诱发炎症反应。对死细胞残余物的吞噬作用会延迟，直到炎症细胞积聚。由此产生的病变包含连续的坏死细胞群，在稍后的时间点包含炎性白细胞。坏死细胞的确切形态变化很大，取决于病原体的特征。非凋亡细胞死亡的检测主要依赖于病变的形态外观和使用显示细胞膜损伤的检测方法，例如示踪染料的吸收或细胞内酶的泄漏。然而，坏死一词实际上是不精确的 [93]，因为它不仅指细胞死亡过程中发生的变化，还指细胞死亡后的降解。即使是凋亡细胞，在已经形成明显的凋亡形态后，也会经历继发性坏死 [1]。
最近的生化研究削弱了凋亡和坏死之间的强烈对比（图 2）[69,70]。
一种新兴的观点是，线粒体变化将是导致凋亡和非凋亡类型细胞死亡的关键步骤（图 2）。首先，线粒体通透性转变与细胞凋亡以及许多特征明确的坏死有关 [70]。其次，Bcl-2 家族的抗凋亡蛋白通过阻断细胞色素 C 的释放作用于线粒体水平，可防止凋亡和非凋亡细胞死亡 [5,7,62]。相比之下，促凋亡家族成员（如 Bax）可诱导两种类型的细胞死亡 [94]。因此，凋亡和坏死似乎在细胞死亡的早期阶段具有共同的机制。胱天蛋白酶的激活最终将决定细胞死亡在表型上是凋亡还是坏死 [59,69]。然而，ATP 的缺乏以及刺激强度的增加可能会导致细胞凋亡的中止，从而导致凋亡和坏死特征的混合 [69,95,96]。类似地，caspase介导的细胞死亡可以作为继发性坏死的前兆[69]。
缺乏统一的标准来区分细胞凋亡与其他类型细胞死亡之间的区别导致了在确定每种细胞死亡形式的相对贡献时产生混淆，特别是在细胞凋亡和坏死被认为共存的情况下。一个典型的例子是急性心肌缺血再灌注损伤[46,49,97-100]。
细胞死亡动力学非常迅速，因为在缺血发生后的最初几个小时至几天内，中心缺血区域会形成心肌坏死区域[97,98]。在中心缺血区域，凋亡DNA碎片在过程的早期阶段被发现，而在边界区域，则在后期被发现[46,98]。
此外，有一群细胞表现出核小体间DNA碎片和膜损伤，这分别是细胞凋亡和坏死的典型特征[98]。
缺血区域中凋亡细胞的比例变化很大。此外，在两项连续的研究中，经典的凋亡形态均未出现[99,100]。对此提出了几种可能的解释。首先，如果相同的刺激以剂量依赖性方式同时诱导细胞凋亡和坏死[96]，则中心区域缺血强度较高可能有利于坏死。其次，由于凋亡程序的完成需要能量，因此严重缺血组织中高能ATP的损失可能会中止该过程的进展[95]。甚至有人提出了细胞凋亡与再灌注之间的特定关联[99,101]。第三，有人提出，介导两种细胞死亡类型的生化途径可以在同一细胞中被激活[100]。 6. 对研究心肌细胞凋亡的意义
越来越多的证据表明，心肌细胞凋亡发生在各种疾病条件下。然而，凋亡和其他类型细胞死亡的确切意义仍有待研究。表 2 总结了在解释体外凋亡实验结果时必须考虑的一些心肌细胞特征。此外，为了解决这些问题，需要就凋亡的定义和与凋亡量化相关的方法问题达成共识。
为了量化组织样本中的凋亡心肌细胞，需要一种具有高信噪比的方法。
量化需要分析大量高倍显微镜视野，因为凋亡细胞的数量可能非常少 [47] 并且在样本的不同部分变化很大 [45]。凋亡细胞的心肌细胞来源应通过周围肌纤维的存在来确认（见图 1）。这可以使用非特异性复染或特异性抗体来完成，在凋亡小体非常小的情况下，这些抗体可能更敏感。目前用于量化凋亡的首选方法
特征
生物因素
技术因素
有丝分裂很少（如果有的话）
每个细胞有许多细胞核
有组织的收缩机制，具有高度专业化的功能
高、连续地利用 ATP 进行收缩工作
多细胞组织结构
高水平表达凋亡抑制剂，如 ARC [105]
不需要凋亡来平衡有丝分裂
核凋亡和细胞凋亡之间的关系？
可能影响形态，关键蛋白质可能与其他细胞类型不同
过度拉伸介导细胞凋亡
[106]
能量依赖性细胞凋亡的执行可能非常容易受到代谢状态紊乱的影响
细胞间信号作为细胞凋亡的介质？
凋亡细胞水平低
难以获得足够的组织样本
核凋亡检测的可靠性？
形态标准
可能不同于
其他细胞类型
基于检测
caspase底物降解的检测必须经过验证
体内能量条件标准化困难
细胞类型识别
必要
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A. Saraste、K. Pulkki/心血管研究 45 (2000) 528–537
心肌细胞的最佳检测方法是 TUNEL 检测，前提是
该检测经过仔细标准化（见上文）。
然后根据其他标准确认细胞凋亡，例如在电泳中显示核小体间 DNA 碎片或分析形态特征。电泳不能指定正在发生细胞凋亡的细胞类型，并且灵敏度不足以检测到微小的定量差异。形态学标准被认为是细胞凋亡最可靠的证据。然而，用单一方法证明完整的细胞凋亡形态学是困难的。
可以使用光学显微镜观察细胞核凝聚、细胞收缩和分裂成凋亡小体，这是可用于筛选大量细胞。需要电子显微镜来证明完整的细胞内结构的丢失。电子显微镜的主要限制是无法研究大量细胞。由于在单个时间点处于凋亡降解阶段的细胞比例很小，因此通过电子显微镜发现单个凋亡细胞可能很困难。另一方面，形态学标准的使用有一些固有的局限性。形态变化的确切顺序可能因细胞类型而异。例如，在具有僵硬细胞内结构的细胞中，凋亡小体的形成较少[9]。细胞凋亡的新检测方法包括原位连接测定和基于 caspase 活化的测定。通过使用 Taq 聚合酶的原位连接测定，可以检测凋亡细胞中的单碱基 DNA 悬垂[34]。这些 DNA 片段在坏死的肿瘤组织和非凋亡事件（例如用过氧化氢处理细胞或将其暴露于长时间的死后自溶）中均未发现 [34]。因此，使用 Taq 聚合酶的检测被认为对于检测组织样本中的细胞凋亡非常具有特异性。在心肌中，使用 TUNEL 和 Taq 聚合酶检测获得了相同的结果 [102,103]。胱天蛋白酶的活化是细胞凋亡的一个潜在特异性特征，因为它反映了潜在的分子变化。最近的研究表明，基于胱天蛋白酶活化的证明的方法可用于通过光学显微镜检测组织切片中的凋亡细胞。然而，这些检测的定量准确性和可重复性仍有待研究。除了检测细胞凋亡外，胱天蛋白酶抑制剂还可用于探测心肌细胞在各种凋亡刺激下死亡的胱天蛋白酶依赖性。
致谢
本研究得到了芬兰心脏协会、Aarne Koskelo 基金会、芬兰文化基金会和图尔库大学中央医院 EVO 基金的资助。感谢 Liisa-Maria Voipio-Pulkki 阅读手稿并激发讨论。