电压门控钠离子通道
2.1 电压门控钠通道的功能作用
2.1.1 动作电位的产生和传播
神经、肌肉和内分泌细胞中的电信号传导依赖于电压门控钠通道对动作电位的启动，正如电压钳技术所揭示的那样。通过对鱿鱼巨型神经轴突的膜施加快速去极化，结果表明钠 (Na+) 通道快速激活（1 毫秒内），然后快速失活（5 毫秒内）。通道激活产生的内向 Na+ 电流的短暂脉冲是动作电位快速上升（去极化）阶段及其沿神经和肌肉纤维快速传导的原因。这些研究首次揭示了瞬态 Na+ 电流是动作电位启动和传播的机制。
2.1.2 激活、传导和失活的两个阶段
Hodgkin 和 Huxley 的电压钳研究还揭示了 Na+ 通道的三个基本功能：电压依赖性激活、快速失活和选择性 Na+ 传导。他们表明，鱿鱼巨轴突的 Na+ 电流的激活高度依赖于跨膜电压，并具有 S 形激活动力学，这与激活过程中三个带电“门控粒子”跨膜电场移动的要求一致。相反，快速失活遵循指数时间过程，就好像单个门控粒子控制该过程一样。他们的 Na+ 通道门控动力学 m3h 公式作为 Na+ 电流的定量描述，已经经历了六十年的考验。
电压依赖性门控的本质是门控电荷（实质是Na+ 通道蛋白结构的一部分）在膜电场中的移动。这种基本的门控电荷运动是通过电压钳法直接测量的。在没有渗透离子的情况下，在鱿鱼巨型轴突中检测到电容电流，该电流与 Na+ 通道的激活密切相关。随后使用更高分辨率方法的研究表明，驱动 Na+ 通道激活的门控电荷运动相当于 12-16 个正电荷在整个膜电场中的传输。这种电压驱动的门控电荷运动与构象变化相结合，在 1 毫秒内打开 Na+ 通道的孔。
一旦打开，Na+ 通道对离子具有高度选择性。Na+ 的渗透性是钾离子的十倍，是 Ca2+的50 倍 (Hille 1971, 1972)。对无机和有机单价阳离子的渗透、饱和和阻断的详细研究使 Hille 得出了 Na+ 通道选择性过滤器的模型，该模型是一个高场强位点，其中一个或多个羧基准备以特定方式替换 Na+ 离子的部分或全部水合水，并在渗透的 Na+ 离子越过一系列四个势能屏障并与一系列三个配位位点相互作用时对其进行协调 。这种 Na+ 渗透和选择性的概念模型与 Na+ 通道离子选择性过滤器的新兴结构模型非常吻合（见下文）。除了 Hodgkin 和 Huxley 发现的快速失活过程外，Na+ 通道还有第二个缓慢失活过程，该过程在数百毫秒到数秒的时间尺度上的长时间单次去极化和重复去极化序列中进行。在生理环境中，这种缓慢失活过程对于限制发放频率、确定神经和肌肉中动作电位序列的长度以及保护细胞免受兴奋毒性损伤非常重要。在中枢神经系统中，缓慢失活过程直接有助于在动作电位序列的频率和持续时间中编码信息。
2.1.3 持续钠电流和复苏钠电流
除了经典的瞬时 Na+ 电流外，Na+ 通道还有两种其他描述清楚的活动模式。瞬时 Na+ 电流在神经和肌肉细胞中不完全失活，留下小的、持续的 Na+ 电流，其幅度在峰值 Na+ 电流幅度的 1% 范围内。这种持续的 Na+ 电流在神经元树突和细胞体中很重要，它会增加兴奋性突触后电位的大小，并有助于在动作电位序列trains of action potentials期间将细胞带到阈值。许多类型的神经元也会产生复苏的 Na+ 电流，这些电流在电压钳脉冲或动作电位后表现为反弹内向电流rebound inward current 。这些电流是由从关闭或失活状态重新打开 Na+ 通道引起的，因此不同于由先前打开的 Na+ 通道的长时间活动引起的持续性 Na+ 电流。复苏的 Na+ 电流也有助于重复激发动作电位，这是通过在瞬时 Na+ 电流失活和 K+ 电流使细胞复极后提供去极化驱动来实现的。持续和复苏的 Na+ 电流可以与缓慢失活共同作用，在中枢神经元中产生复杂的动作电位激发模式 (Do 和 Bean 2003)。
2.2 钠通道蛋白的发现和生化特性
2.2.1 钠通道的鉴定、纯化和重建
由于 Na+ 通道导向的神经毒素在动作电位产生中起着重要作用，它们在浮游生物、海葵和其他腔肠动物、海洋蜗牛、鱼、两栖动物、蜘蛛和蝎子中发现的海洋甲藻中独立进化。
这些毒素通过作用于 Na+ 通道上的六个不同受体位点来阻止神经传导并引起麻痹（表 2.1）。由于它们与 Na+ 通道相互作用的特异性以及它们以高亲和力结合 Na+ 通道的能力，这些神经毒素已被用作通道结构和功能的分子探针。蝎毒多肽毒素的光反应性衍生物与大脑完整神经细胞膜中的 Na+ 通道共价连接，从而可以直接识别 Na+ 通道的蛋白质成分（Beneski 和 Catterall 1980）。这些实验揭示了 260 kDa 的大 α 亚基和 30-40 kDa 的小 β 亚基（Hartshorne 和 Catterall 1984；图 2.1 左）。石房蛤毒素和河豚毒素与其共同受体位点的可逆结合被用作通道蛋白的生化检测方法。用非离子洗涤剂溶解脑膜可释放 Na+ 通道，溶解的通道通过色谱技术纯化，该技术根据大小、电荷和共价连接的碳水化合物的组成分离糖蛋白（Catterall 1984；图 2.1 右）。 Na+ 通道 α 亚基也经过纯化
| 结合位点 | 药物举例 |
|---|---|
| 位点1 | 河豚毒素Tetrodotoxin、石房蛤毒素Saxitoxin、μ-玉螺毒素μ-Conotoxin |
| 位点2 | 藜芦定Veratridine、箭毒蛙毒素Batrachotoxin、Grayanotoxin、乌头碱Aconitine |
| 位点3 | α-蝎毒素、海葵毒素Sea anemone toxins |
| 位点4 | β-蝎毒素、狼蛛毒素Tarantula toxins |
| 位点5 | Brevetoxins、Ciguatoxins |
| 位点6 | δ-玉螺毒素 |
电压门控钠通道的亚基结构。左图。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳图
显示了脑 Na+ 通道的 α 和 β 亚基。 （左图）从大鼠脑中纯化的 Na+ 通道，显示 α、β1 和 β2 亚基及其分子量（Hartshorne 和 Catterall 1984）。如图所示，α 和 β2 亚基通过二硫键连接。河豚毒素和蝎毒素与 Na+ 通道的 α 亚基结合，如图所示，并用作分子标签来识别和纯化脑中的 Na+ 通道蛋白（Beneski 和 Catterall 1980；Hartshorne 和 Catterall 1984）。（插图）由单个纯化的 Na+ 通道传导的单通道电流，该通道被整合到平面双层中（Hartshorne 等人 1985）。右图。基于生化数据绘制的脑 Na+ 通道亚基结构（Catterall 1984）。从鳗鱼电斑中纯化了类似的 α 和 β 亚基复合物，并从骨骼肌中纯化了该复合物（Agnew 等人，1980 年；Barchi，1983 年）。纯化膜转运蛋白研究的一个重要步骤是在纯状态下重建其功能。这是通过重建磷脂囊泡和平面磷脂双层中的 Na+ 通道来实现的（Catterall，1984 年；Hartshorne 等人，1985 年）。单个纯化脑 Na+ 通道的 Na+ 电流记录表明，它们保留了天然通道的电压依赖性、离子选择性和药理学特性，证实了活性 Na+ 通道蛋白以功能形式得到纯化（Hartshorne 等人，1985 年；图 2.1，插图）。
2.2.2 钠通道亚基的一级结构
Na+通道α、β1和β2亚基的氨基酸序列是通过克隆与其mRNA互补的DNA来确定的，使用抗体和寡核苷酸探针，这些探针是从纯化的Na+通道上发展而来的（Noda等人，1984年）。
电压门控钠通道的一级结构。圆柱体代表可能的α螺旋片段。粗线代表每个亚基的多肽链，其长度大约与脑Na+通道亚型中的氨基酸残基数量成比例。β1和β2亚基的细胞外结构域显示为免疫球蛋白样折叠。Ψ，可能的N连接糖基化位点； P 以红色圆圈和菱形表示，经 PKA（圆圈）和 PKC（菱形）磷酸化的蛋白位点；绿色，孔衬片段；白色圆圈，形成离子选择性过滤器和河豚毒素结合位点的氨基残基的外环和内环（DEKA）；黄色，S4 电压传感器；h 以蓝色圆圈表示，失活门环中的失活粒子；蓝色圆圈，与形成失活门受体有关的位点。还显示了 α 和 β 蝎毒素的结合位点以及 α 和 β1 亚基之间相互作用的位点。河豚毒素是 Na+ 通道孔的特异性阻断剂，而 α 和 β 蝎毒素分别阻断快速失活并增强活化，从而产生持续的 Na+ 电流，导致神经传导的去极化阻滞。河豚毒素已被用作探测 Na+ 通道孔的工具，而蝎毒素则被用作电压传感器功能的探针。（插图）溶液中失活门的结构由 NMR 确定。（改编自 Rohl 等人 1999 年；Catterall 2000 年。）
这些亚基的结构在图 2.2 中以跨膜折叠模型的形式说明（Numa 和 Noda 1986 年；Catterall 2000 年）。大型 α 亚基由 1800-2100 个氨基酸组成，包含四个重复结构域，每个结构域包含六个跨膜 α 螺旋和一个膜折返环，形成跨膜孔的外口（见下文）。
较小的 β1 和 β2 亚基由一个大的细胞外 N 端片段组成（与Ig 折叠相似的结构），一个跨膜片段和一个短的细胞内片段。
只有 Na+ 通道的主要 α 亚基是功能所必需的，但 β 亚基会增加细胞表面表达水平并改变电压依赖性门控，从而赋予表达的 α 亚基更多生理上正确的功能特性。这些结果表明，电压门控 Na+ 通道的主要 α 亚基在功能上是自动的正常，但辅助 β 亚基可改善细胞表面表达，有助于确定亚细胞定位并调节生理特性（。
2.2.3 绘制钠通道功能所需的分子成分
了解 Na+ 通道亚基的主要结构可以详细测试它们的功能特性。编码野生型和突变型通道的 cDNA 克隆在受体细胞中表达，并通过电压钳方法研究所得离子通道。通过分析突变、特异性抗体、药物和毒素对受体细胞中表达的 Na+ 通道的影响，从其 cDNA 中了解到很多有关 Na+ 通道功能的分子基础。这些见解以图 2.2 中 Na+ 通道功能的颜色编码分子图的形式说明（Catterall 2000）。
电压传感器由每个域中的 S1–S4 片段组成（图 2.2，白色，黄色）。S4 片段包含四到八个重复基序，在两个疏水残基之间有一个带正电荷的氨基酸残基（通常是精氨酸）（图 2.2，黄色，+）。这些精氨酸残基的突变会改变门控的电压依赖性并降低其电压依赖性的陡度，表明它们就是所谓的门控电荷，可感知跨细胞膜电场的变化并启动 Na+ 通道的激活。所有四个域中的电压传感器都参与电压感应过程，但 S4 段的向外移动是连续的，域 I、II 和 III 移动迅速但按顺序移动，然后域 IV 移动得更慢。S5 和 S6 段以及它们之间的 P 环形成中央孔（图 2.2，绿色）。孔基序首先通过确定与孔阻塞毒素河豚毒素结合所必需的氨基酸残基来识别。随后的实验表明，这些氨基酸残基还控制 Na+ 通道的离子选择性。快速失活门由连接 Na+ 通道 α 亚基 III 和 IV结构域 的细胞内环形成，在打开后几毫秒内使 Na+ 通道失活（图 2.2）。它由针对它的抗肽抗体识别，可阻断快速失活过程，并通过定点诱变进一步研究。该环被认为折叠成 Na+ 通道结构并在失活期间从细胞内末端阻塞孔。快速失活门肽的结构是通过核磁共振（NMR）方法在溶液中确定的。它由一个刚性 α-螺旋组成，氨基酸序列前面有两个环，其中包含保守的疏水基序异亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸 (IFM)。失活门在铰链甘氨酸残基处弯曲，关键的 IFM 基序折叠成孔细胞内口附近的受体位点，紧密结合并充当分子闩锁以保持失活门关闭。
2.3 钠通道的三维结构
2.3.1 细菌钠通道的结构
人类基因组分析表明，有 143 种离子通道蛋白的成孔片段与 Na+ 通道相关，并且它们与至少十个不同的辅助亚基家族相关。电压门控离子通道及其分子亲属是膜信号蛋白最大的超家族之一，也是用于治疗人类疾病的药物最突出的靶点之一。电压门控 Na+ 通道是这个大型超家族的奠基者，Hodgkin 和 Huxley 发现了它们的功能，后来 Na+ 通道蛋白本身也被发现。令人惊讶的是，Na+ 通道家族在进化上也很古老（Ren 等人，2001 年）。细菌 Na+ 通道 NaChBac 及其原核亲属由单个亚基的同源四聚体组成，其结构类似于脊椎动物 Na+ 通道的一个域（Ren 等人，2001 年）。这些细菌 Na+ 通道很可能是真核生物中较大的四域 Na+ 通道的进化祖先，而类似的细菌通道可能是 Ca2+ 通道的分子祖先。
通过确定来自 Arcobacter butzleri 的通道 NaVAb 的结构，揭示了 Na+ 通道的三维结构。这种古老的 Na+ 通道具有非常简单的结构：四个相同的亚基，每个亚基都类似于哺乳动物 Na+ 通道的一个同源结构域，但没有哺乳动物蛋白质的大细胞内和细胞外环。该结构揭示了大量有关电压依赖性门控、离子选择性和电导的结构基础以及治疗重要药物阻断通道的机制的新信息。从顶部看，NaVAb有一个中央孔，周围环绕着四个由 S5 和 S6 段组成的成孔模块以及中间的孔环（图 2.3a，蓝色）。由 S1–S4 片段组成的四个电压感应模块与孔模块的外缘对称相关（图 2.3a，绿色/红色）。 NaVAb 的跨膜结构表明相邻亚基已交换其功能域，因此每个电压感应模块与其邻居的孔形成模块最紧密相关（Payandeh 等人，2011 年；图 2.3b、c）。这种域交换排列很可能强制 Na+ 通道的四个亚基或域协同门控。
2.3.2 孔包含一个高场强羧基位点和两个羰基位点
整体孔结构包括一个大的外部前庭、一个窄离子选择性过滤器（其中包含决定脊椎动物 Na+ 和 Ca2+ 通道离子选择性的氨基酸残基）、一个由 S6 段排列并充满水的大型中央腔，以及在膜细胞内表面 S6 段交叉处形成的细胞内活化门（Payandeh 等人，2011 年；图 2.3d）。活化门在 NaV Ab 结构中紧密关闭（图 2.3e），没有空间让离子或水通过。这种一般结构类似于电压门控 K+ 通道（见第 4 章）。
尽管 Na+ 和 K+ 通道的整体孔结构相似，但它们的离子选择性过滤器的结构以及离子选择性和电导机制是完全不同。 K+ 通道通过与一系列四个离子配位位点直接相互作用来选择 K+，这些位点由组成离子选择性过滤器的氨基酸残基的主链羰基形成。K+ 通道的离子选择性过滤器中不涉及带电氨基酸残基，并且没有水分子介入 K+ 和其相互作用的主链羰基之间。
相反，NaVAb 离子选择性过滤器在其细胞外端有一个高场强位点，该位点由四个谷氨酸残基形成，位于脊椎动物 Na+ 和 Ca2+ 通道关键部分（图 2.2）。考虑到其尺寸约为 4.6 Å 见方，具有两个平面水合物的 Na+ 可以适合这个高场强位点。这个外部位点后面是两个由主链羰基形成的离子配位点（图 2.3g）。这两个羰基位点的设计非常适合结合具有四个平面水合物的 Na+，但对于直接结合 Na+ 来说太大了。事实上，NaVAb 选择性过滤器足够大，可以将 K+ 通道离子选择性过滤器的主链放入其中。因此，Na+ 选择性和电导的化学性质与 K+ 的相反：带负电荷的残基与 Na+ 相互作用以去除其大部分（但不是全部）水合物，而 Na+ 作为水合物离子通过其结合水的内壳与孔相互作用进行传导。 Na+ 选择性、饱和度和阻断的理论考虑预测，在四屏障、三位点选择性过滤功能模型中，外部高场强位点将部分脱水渗透离子，两个内部位点将传导和再水化渗透 Na+ 离子 (Hille 1975)。这种理论和结构的一致性清楚地洞察了 Na+ 渗透的化学和生物物理学。哺乳动物 Na+ 通道的离子选择性过滤器已经进化为包含不同的高场强位点，如下所述。
2.3.3 电压传感器结构
正如 Hodgkin 和 Huxley (1952) 指出的那样，Na+ 通道激活的陡峭电压依赖性意味着“带电粒子”必须响应膜电位的变化而穿过膜，从而为打开 Na+ 通道提供驱动力。在高分辨率电压钳研究中，这些门控电荷的预测跨膜运动被检测为小的电容门控电流，首先是在鱿鱼巨型轴突中，后来在其他类型的细胞中（Armstrong 和 Bezanilla 1973）。Na+ 通道的每个同源域中的 S4 片段用作电压传感器，S4 氨基酸序列中间隔 3 个带正电的精氨酸和赖氨酸残基用作门控电荷。NaV Ab 通道的 X 射线晶体结构提供了激活电压传感器的高分辨率模型（图 2.3h；Payandeh 等人 2011）。四个跨膜螺旋排列成两个螺旋发夹，由 S1-S2 和 S3-S4 跨膜片段组成。 S4 段中的四个带电荷门控精氨酸残基（NaVAb 中的 R1–R4）按顺序排列在膜上（图 2.3h）。就在四螺旋束中心的细胞内侧，一簇疏水残基（包括高度保守的苯丙氨酸残基（NaVAb 中的 Phe56））形成疏水收缩位点 (HCS)，该位点密封电压传感器以防止水和离子的跨膜移动（图 2.3h，绿色）。类似的 Phe 残基对于 KV通道中的电压传感器功能至关重要（Tao 等人，2010 年）。门控电荷 R1–R3 位于 HCS 的细胞外侧，其精氨酸侧链与细胞外负电荷簇 (ENC；图 2.3h，红色) 的带负电荷的侧链相互作用。图 2.3i 显示了细胞外侧电压传感器中面向水样裂隙的门控电荷阵列。门控电荷 R4 位于 24 HCS 的细胞内侧，与细胞内负电荷簇 (INC；图 2.3h，红色) 相互作用。总体而言，电压传感器的结构似乎旨在催化 S4 门控电荷通过 HCS 的移动，在 INC 和 ENC 之间交换离子对伙伴。NaV Ab 结构中的电压传感器在 HCS 的细胞外侧有三个门控电荷 (图 2.3h；Payandeh 等人，2011 年)。这种构象与 KV 1.2 通道结构中电压传感器的构象几乎相同，处于开放状态（Long 等人，2007 年）。然而，NaV Ab 的激活门被 Ile217 和 Met221 侧链的相互作用紧密关闭（图 2.3d、e）。因此，这种 NaV Ab 结构很可能捕获了预开放状态，这是激活过程中的预期中间体，其中所有四个电压传感器都已通过去极化激活，并且细胞内激活门仍然关闭，但准备在所有四个亚基的协同构象变化中快速打开。
2.3.4 电压依赖性激活涉及滑动螺旋机制
从结构功能研究和结构建模中，我们已经对电压依赖性门控过程有了很大的了解。毒素结合研究表明，Na+通道域II和IV中电压传感器的S3–S4连接体可用于将大型亲水性蝎子分子与xin 多肽（60-70 个残基）在静止和激活状态下均存在（Rogers 等人，1996 年；Cestèle 等人，1998 年）。这些结果将 S4 片段置于静止和激活状态下的跨膜位置。在巧妙的实验中检测到了 Na+ 通道电压传感器中 S4 片段的向外移动，该实验通过分析特定化学反应在那些取代的半胱氨酸处的功能效应来测量取代 S4 中天然氨基酸的化学反应性半胱氨酸残基的运动（Yang、George 和 Horn，1996 年）。这些结果与电压感应的滑动螺旋模型一致，在该模型中，S4 段中的门控电荷向外移动并交换离子对伙伴，以允许门控电荷移动的低能量路径（图 2.4a、b；Yarov-Yarovoy 等人，2012 年；Wisedchaisri 等人，2019 年）。S4 螺旋的这种移动被认为会在预开放状态下在每个域中引发更普遍的构象变化。在所有四个域发生构象变化后，跨膜孔可以以协同方式打开并传导离子（Wisedchaisri 等人，2019 年）。该结构模型表明，S4 段及其门控电荷通过一个狭窄的门控孔移动，该孔将跨膜电场聚焦到距离膜约 5 Å 的法向距离（Starace 和 Bezanilla 2004），并允许门控电荷从细胞内的水性前庭移动到细胞外的水性前庭，并短暂穿过 HCS（图 2.4a、b；Yarov-Yarovoy 等人 2012 年；Wisedchaisri 等人，2019 年）。这种在激活过程中向外移动的滑动螺旋机制得到了使用二硫键锁定方法对门控电荷与 INC 和 ENC 中的离子对伙伴的离子对相互作用的广泛研究的支持（Yarov-Yarovoy 等人 2012 年）。 2012 年，研究该问题的实验室达成共识，支持钠通道和钾通道的这种模型（Vargas 等人，2012 年），最近的结构研究为这种机制提供了进一步的决定性证据（Wisedchaisri 等人，2019 年）。
了解电压传感器功能的关键是确定其在静息状态下的结构，但这很有挑战性，因为静息状态仅存在于强负膜电位下。通过插入突变，将静息状态稳定在 0 mV，并将门控的电压依赖性转移到正膜电位范围，可以通过二硫键锁定捕获静息状态并确定其结构（Wisedchaisri 等人，2019 年）。这种令人惊讶的结构详细揭示了电压感应的滑动螺旋模型的分子基础（图 2.4a、b；Wisedchaisri 等人，2019 年）。
电压门控钠通道
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图 2.4
钠通道激活和孔门控模型。（a）VS 的结构显示为骨干卡通。
S0–S3 显示为灰色，S3–S4 环显示为红色，S4 显示为洋红色。静息状态下，S1–S2 和 S3–S4 螺旋–环–螺旋之间的水样裂隙更宽更浅，而激活状态下的裂隙更深。（b）门控电荷运动。四个 Arg 门控电荷，R1–R4（蓝色）；E32 和 N49(K) 的细胞外负电荷 (ENC) 簇和 E59 和 E80 的细胞内负电荷 (INC) 簇（红色）；
疏水收缩位点 (HCS，绿色) 中的 Phe；保守的 W76 (灰色) 和 E96 (黄色) 显示为棒状。S4 (洋红色) 向外移动 11.5 A，通过 HCS 转移两个门控电荷。为清晰起见，省略了 S3 的一部分。 (c) (a) 中结构的底部 (细胞内) 视图，为清晰起见省略了 S0-S3。
S4-S5 接头 (蓝色) 发生大的构象变化，在静止状态 (红色，关闭) 下收紧 S5 和 S6 段周围的孔圈，并在激活状态 (绿色，打开) 下松开孔圈。
(d) 来自面板 (c) 的孔在关闭 (红色) 和打开 (绿色) 状态下的细胞内口的空间填充视图。
（改编自 Wisedchaisri 等人，2019 年。）
在这种静息状态结构中，S4 段被拉向膜的细胞内侧近 12 Å，在其细胞内端形成一个急剧弯曲的肘部，该肘部突出到细胞质中（图 2.4a、b，左）。S4 段及其连接的 S4-S5 连接子的这种运动扭曲了形成激活门的 S6 段的细胞内末端，并紧密关闭了门（图 2.4c、d）。在其静止位置，电压传感器就像一把上膛的枪，正的 S4 门控电荷被拉向内，准备在负的内部膜电位去极化后迅速向外射出（图 2.4a、b，右）。在电压驱动下，S4 螺旋向内滑动至静止构象，捕获了 S4、S4-S5 和 S 的新构象中的电场静电能6 个节段，去极化后 S4 螺旋向外运动将能量与孔的协同打开耦合。
2.3.5 虹膜状运动打开孔
当膜去极化时，将 S4 节段保持在向内位置的力被释放，允许 S4 节段向外射出，拉直 S4-S5 接头中的肘部，扭转 S4-S5 接头和 S6 节段，并打开孔（图 2.4a
d；电影 1；Lenaeus 等人 2017 年；Wisedchaisri 等人 2019 年）。S4-S5 接头的构象变化很大，在膜平面上扭转这些节段。 S4–S5 连接体中这种大的构象变化导致 S6 片段发生更细微的弯曲和扭曲运动，从而通过将 Ile217 (I217) 的疏水侧链移出渗透途径来打开孔隙（图 2.4c、d；Lenaeus 等人，2017 年；Wisedchaisri 等人，2019 年）。从这些结构模型中，可以看到电压门控 Na+ 通道门控中完整的一系列构象变化（电影 1；Wisedchaisri 等人，2019 年）。 2.4 缓慢失活过程中孔隙塌陷
除了 Hodgkin 和 Huxley 在其经典著作中发现的快速失活过程外，在 100 毫秒到秒的时间尺度上进行的单独缓慢失活过程也会终止 Na+ 通过 Na+ 通道的流入 (Rudy 1978；Vilin 和 Ruben 2001)。该过程在神经和肌肉细胞中重复产生动作电位时进行，并限制重复动作电位序列的长度。已确定结构的细菌 Na+ 通道具有缓慢的失活过程 (Pavlov 等人 2005)，即使它们的同源四聚体结构意味着它们没有类似于脊椎动物通道的细胞内环连接域 III 和 IV 的结构成分，这些结构成分介导快速失活。缓慢失活的细菌 Na+ 通道的结构表明，孔已部分塌陷，两个相对的 S6 片段向孔的中心轴移动，而两对相邻的 S6 片段也相应地远离轴线移动（图 2.5a-d；Payandeh 等人，2012 年）。在孔细胞外端的选择性过滤器（图 2.5a）、中心腔（图 2.5b）和孔细胞内端的激活门（图 2.5c、d）处观察到了这种运动。孔的这种不对称塌陷伴随着电压传感域围绕孔域圆柱形外表面的细微旋转（Payandeh 等人，2012 年）。孔隙塌陷可能对通道在缓慢失活状态下的稳定很重要，而这需要强烈、长时间的超极化才能恢复到静息状态。
2.5 药物阻塞钠通道的孔隙
许多用于治疗的药物作用于离子通道。局部麻醉剂用于在牙科和外科手术中止痛，它们结合在神经中 Na+ 通道的内孔中并阻塞它们 (Hille, 1977; 图 2.5e-g)。此外，相关的 Na+ 通道阻断药物用于治疗癫痫和心律失常。定点诱变、结构研究和分子建模相结合的结果表明，这些药物与 Na+ 通道结构域 I、III 和 IV 中 S6 片段特定位置的氨基酸残基形成的受体位点结合，如图 2.5e 所示（Ragsdale 等人，1994 年；Yarov-Yarovoy 等人，2002 年）。这些氨基酸的芳香和疏水侧链与药物分子的芳香和取代氨基接触，并将它们结合在其受体位点，在那里它们阻止离子通过孔隙移动。 NaV
Ab 的结构将此药物受体位点置于三维环境中（Payandeh
电压门控钠通道
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图 2.5
Na+ 通道孔中的缓慢失活和药物受体位点。 (a) NaV
Ab 缓慢失活期间孔塌陷的顶视图。两个 S6 段沿孔的中心轴向内移动，两个向外移动以产生不对称、部分塌陷的构象。选择性过滤器结构已从 NavAb/I217C 的预开放状态下的近正方形变为 NaV
Ab/WT-CD 失活状态下的部分塌陷平行四边形。 (b) 中央腔部分塌陷。 (c) 激活门紧密关闭，但在 WT-AB 中塌陷为不对称构象。 (d) 比较激活门处孔衬残基的等效 Cα 位置之间的距离NaV
Ab/I217C 前开放构象中的 S6 片段。（改编自 Payandeh 等人，2012 年。）(e) 哺乳动物 Na+ 通道 IS6、IIIS6 和 IVS6 跨膜片段中局部麻醉药和相关抗癫痫药和抗心律失常药的结合位点模型。参与药物结合的氨基酸侧链ng 以空间填充格式显示。
黄色，结合的依替卡因，一种局部麻醉剂。（f）通过 NaV
Ab 结构中的孔模块的侧面视图，说明开窗（孔门户）和疏水进入中央腔。Phe203 侧链，黄色棒。NaV
Ab 残基的表面表示与与药物结合和阻断有关的残基对齐。
Thr206，蓝色；Met209，绿色；Val213，橙色。膜边界，灰线。（g）选择性过滤器下方的顶视图；颜色与 (e) 中的颜色相同。（改编自 Payandeh et al. 2011.)
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et al. 2011; 图 2.5f、g）。形成 Na+ 通道阻滞剂受体位点的氨基酸残基排列在 S6 段的内表面上，形成三维药物受体位点，其占据会阻塞孔隙（图 2.5f、g）。值得注意的是，开孔从膜的脂质相侧向通向药物受体位点，为药物结合提供疏水性通道（孔隙门户；图 2.5f、g）。这种从膜相结合的药物形式在早期研究中被预测为不同大小和疏水性的局部麻醉剂阻断 Na+ 通道的机制（Hille 1977）。从膜磷脂双层进入 NaV
Ab 通道中的药物受体位点受到单个氨基酸残基侧链的限制（NaV
Ab 中的 Phe203；图 2.5 f、g，黄色）。该氨基酸残基位于与脑 Na+ 通道 IVS6 区段中控制局部麻醉药从其受体流出的氨基酸残基类似的位置，并且靠近控制细胞外 Na+ 通道阻滞剂进入心脏和脑 Na+ 通道中其受体位点的氨基酸残基 (Qu et al., 1995)。
2.6 哺乳动物钠通道的进化添加
通过低温电子显微镜确定的哺乳动物神经、骨骼肌和心脏 Na+ 通道的结构 (Shen et al. 2019; Pan et al. 2018; Jiang et al. 2020) 与细菌 Na+ 通道在其功能性跨膜区域密切相关 (均方根偏差 <3 埃，接近结构数据分辨率的极限)。然而，哺乳动物 Na+ 通道是更大的蛋白质复合物，其所有 24 个跨膜片段都组织在单个多肽的四个同源结构域中，而不是同源四聚体中（图 2.2 和 2.6）。这些哺乳动物 Na+ 通道还具有连接其四个结构域的大型非结构化细胞内环，其 β 亚基在跨膜位置相关联，与通道蛋白的细胞内和细胞外表面相互作用（图 2.2 和 2.6）。哺乳动物 Na+ 通道的电压感应模块的结构与 NaV Ab 非常相似，但在离子选择性过滤器和快速失活门方面存在重要的进化特化（图 2.6）。快速失活门由连接结构域 III 和 IV（III-IV 连接子）的细胞内连接子形成。它被锁定在哺乳动物 Na+ 通道结构中的失活位置（图 2.6a；Shen 等人 2019；Pan 等人 2018；Jiang 等人 2020）。作为失活门闩锁的 IFM 基序结合在作为其受体的疏水口袋中（图 2.6a、b，橙色）。它通过将 IFM 基序转换为 QQQ 的突变释放（Jiang 等人 2021）。它与所有氨基酸残基相互作用，这些氨基酸残基先前通过对哺乳动物 Na+ 通道的诱变研究确定为失活门受体的一部分（见第 2.2.3 节）。离子选择性过滤器中的高场强位点由四种不同的氨基酸残基 Asp–Glu–Lys–Ala 形成，代替了 NaV
Ab 中的四种 Glu 残基（图 2.6c、d）。
令人惊讶的是，Lys 残基对于 Na+ 选择性是绝对必要的，没有其他残基可以替代（Favre、Moczydlowski 和 Schild 1996；Sun 等人 1997）。结构分析表明，该 Lys 残基与策略性放置的骨架羰基形成三个氢键，使其孤电子对将其部分负电荷指向离子通透性途径，以便与 Na+ 相互作用（图 6e）（Jiang 等人 2020）。
这种独特的化学性质可能对 Na+ 选择性至关重要。
电压门控钠通道
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图 2.6
哺乳动物 Na+ 通道的结构。 (a) 具有 β1 亚基的 NaV
1.4 结构。黄色，电压传感器；橙色，具有快速失活门和 IFM 基序的域 III-IV 接头。 (b) 结合 IFM 基序的高分辨率视图。 (c、d) 离子选择性过滤器的高分辨率顶视图，其中高场强下的关键氨基酸残基选择和传导标记并叠加在 NaV
Ab 上的钠。（改编自 Pan et al. 2018.） (e) 心脏 NaV
1.5 通道的离子选择性过滤器的侧视图。注意 t 的独特构象K1421 的 ε-氨基将其孤电子对投射到离子渗透途径中。（改编自
Jiang 等人，2020 年。）
2.7 钠通道多样性
在人类和其他哺乳动物中，电压门控 Na+ 通道 α 亚基由
10 个基因编码，这些基因在不同的可兴奋组织中表达（表 2.2；Goldin 等人，2000 年；
Yu 和 Catterall，2004 年）。NaV
1.1、NaV
1.2、NaV
1.3 和 NaV
1.6 是中枢神经系统中的主要 Na+ 通道。NaV
1.7、NaV
1.8 和 NaV
1.9 是周围神经系统中的主要 Na+ 通道。 NaV
1.4 是骨骼肌中的主要 Na+ 通道，而
NaV
1.5 是心脏中的主要通道。这些 Na+ 通道中的大多数在其主要组织之外也有显著的表达水平。第十个 Na+ 通道蛋白不是电压门控的，并且参与盐感应。总共有四个 NaV
β 亚基的小家族。
β1 和 β3 与 α 亚基非共价结合，并且在氨基酸序列上彼此最相似，而 β2 和 β4 与 α 亚基形成二硫键，并且彼此也非常相似（Catterall 2000；Brackenbury 和 Isom 2011）。NaV
β 亚基在转染细胞中与 α 亚基的结合是混杂的，但局部表达和 β2 和 β4 形成二硫键的机会有限
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