蛋白质含量测定
基于测定原理分类，大致可以分为两大类：
- 总氮（凯氏定氮法）
- 吸光度：蛋白质浓度A∝浓度C（朗伯-比尔定律）
凯氏定氮法
经典的蛋白质定量法,在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。
在三聚氰胺事件后，凯氏定氮法的弊端暴露，现已逐渐少用。
- 理论基础:蛋白质含量=含氮量/16%，(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)。
- 还有一种亚硝酸的，亚硝酸反应产生的氮气一半来自蛋白质所以需要*1/2.（见后面Van-Slyke法）
Van-Slyke定氮法（范斯莱克法）
本法利用α-氨基酸可与亚硝酸反应的特性计算游离氨基的含量。实际上，任何伯胺都可与亚硝酸反应，包括Lys的ε-氨基、乙撑亚胺加工过的Cys等等。反应释放，其中的氮原子来自氨基。
紫外吸收测定蛋白质含量
近紫外(280nm)
蛋白质280nm的吸收主要取决于色氨酸和酪氨酸，少量取决于苯丙氨酸和二硫键。
百分之几的核酸就足以对280nm的吸收产生极大影响。
- A280 (1 mg/mL) = (5690nw + 1280ny + 120nc)/M
- nw、ny、nc分别是单位质量M中色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸残基数目。
远紫外
肽键在190nm处的吸收最强，但由于190nm处有氧气的干扰以及技术的限制，一般使用205nm。
各种侧链，包括 Trp、Phe、Tyr、His、Cys、Met 和 Arg 的侧链（按降序排列），对 A205 有贡献。
和A280相比，在不同蛋白质之间的改变很小，但缺点包括需要在远紫外条件下精确校准分光光度计。许多缓冲液和其他成分，如血红素或吡哆醛基团，在该区域吸收很强。
Lowry法测定蛋白质含量
- 复合物形成试剂：碳酸钠+硫酸铜+酒石酸钾钠，即用即配
- Folin–Ciocalteu 试剂：磷钨酸+磷钼酸（可使Trp、Tyr还原并显色）
- 碱性条件下蛋白质与铜生成复合物，复合物还原磷钼酸-磷钨酸生成蓝色复合物。
- 先加复合物形成试剂，静止十分钟，再在涡旋振荡中加Folin-Ciocalteu试剂，静止30-60分钟。
- Folin–Ciocalteu 试剂在碱性下不稳定，但反应只在碱性条件下发生，因此涡旋振荡保证快速混匀。
BCA法测定蛋白质含量
BCA法类似lowry法，利用碱性条件下Cu2+被还原为Cu+，BCA可以结合Cu+。但BCA在碱性条件下稳定，因此可以一步完成。
Cu的还原有两种途径：被色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸还原，或者被肽键还原。前者不受温度的影响，但后者在高温下加强。[1]
产物紫色，吸收峰562nm。
- 试剂A：BCA、碳酸钠、酒石酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠
- 试剂B：硫酸铜
- 工作液：试剂A与试剂B混合，苹果绿色，可保存一周。
- 工作液与蛋白质混合后在60℃孵育30分钟。
糖基化蛋白会被考马斯亮蓝法低估，被BCA和Lowry法高估。其中，BCA是最接近的。[2]
考马斯亮蓝法（Bradford法）
亮蓝通过范德华力与蛋白质结合，可以绘制标准曲线，可以用于PAGE染色。
有两种考马斯亮蓝（CCBCBB），G250和R250。G250比R250多了两个甲基，常用于计算蛋白质浓度。而R250常用于电泳染色。但是实际上G250对蛋白质的染色灵敏度不如R250。
- 记忆：G用来“G算浓度”，R用来“Ran色”。
以G250为例，含有两个磺酸基和三个氮原子。磺酸基几乎永远带负电。
- 三个氮全带正电，共带一个正电，呈现红色。
- 两个带正电，共不带电，呈现绿色。
- 一个带正电，共带一个负电，呈现蓝色。
- 都不带正电，共带二负电，呈现粉红色。
当溶液为酸性，G250主要为红色，但与蛋白质结合的G250的蓝色形式被稳定。
该染料似乎与蛋白质的精氨酸和赖氨酸残基结合最强，并且在较小程度上与组氨酸和芳香族残基（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）结合最强。
- 配置：G250溶解在乙醇中，再加入磷酸。
与蛋白质结合的蓝色形式G250吸收峰从590移动到620，但因为测定环境中pH值一般为绿色形式（650nm），因此测定的595nm是误差和准确性的权衡之举。
考马斯亮蓝不与游离的精氨酸、赖氨酸等反应，也不和3000Da一下的肽反应，因此不用于测定一些生物活性肽的含量。
BSA对CBB的反应比一般蛋白质要强，可能会低估样品中蛋白质的含量。牛γ-球蛋白能避免这一问题。
| 方法名称 | 原理 | 波长（如果需要测吸光度） | 优点 | 缺点 | 其它 |
|---|---|---|---|---|---|
| 双缩脲法 | 蛋白质肽键（≥2个）在碱性条件下与Cu²⁺反应生成紫色络合物 | 540nm | 操作简便，无需特殊设备，常用于血清、体液等样本的常规总蛋白质测定 | 灵敏度低 | 双缩脲即两分子尿素缩合而成的化合物，由一个非肽键酰胺键连接，会和蛋白质有类似反应（不过这么说有点爸爸像儿子了，双缩脲法就是因为双缩脲命名的） |
| 凯氏定氮法 | 有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量，蛋白质含量=含氮量/16% | / | 准确度高、重复性好 | 测的实际上是N而不是蛋白质，假设“测定物质中的氮全来自蛋白质”其实并不一定可靠，所以可以骗……（如三聚氰胺案件） | / |
| Lowry法（Folin-酚法） | 双缩脲基础上加了个第二步folin-酚试剂（磷钼酸盐-磷钨酸盐（是磷钼酸而不是磷壁酸，磷壁酸是G⁺特有的细胞壁成分）），Y、W、C可以将其还原，产物由蓝色变成深蓝色 | 660nm | 改良双缩脲，灵敏度高 | 较复杂，需标曲；试剂不稳定（光、热敏感），干扰因素多（糖、氨基酸也可能反应） | / |
| BCA法 | 在碱性环境下，蛋白质与Cu²⁺络合并将其还原成Cu⁺，2BCA（原色苹果绿）与1Cu⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物 | 562nm | 灵敏度高，抗去垢剂（如SDS、TritonX-100）干扰，操作简便稳定性强（可重现） | 受还原剂（如DTT）和螯合剂干扰，反应时间较长 | 目前常用 |
| Bradford法 | 考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色 | 595nm | 灵敏度高，操作简便，干扰因素少（不受Tris缓冲液、糖类、甘油、巯基乙醇等干扰） | 蛋白质类型依赖性（R和芳香族氨基酸） | 目前常用，用的是G250，比R250（电泳染色）多俩甲基 |
| 磺基水杨酸法（磺柳酸法） | 是在略低于蛋白质等电点的酸性环境下，磺基水杨酸根离子与蛋白质氨基酸阳离子结合，形成不溶性蛋白盐而沉淀。沉淀量或溶液反应后的浑浊程度，可反映蛋白质的含量 | / | / | / | 为尿蛋白定性或半定量检查方法 |
- ↑ Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times
- ↑ Fountoulakis, M., Juranville, J. F., and Manneberg, M. (1992) Comparison of the coomassie brilliant blue, bicinchoninic acid and lowry quantitation assays, using nonglycosylated and glycosylated proteins. J. Biochem. Biophys. Meth. 24, 265–274.