讨论:常见酶促反应类型

总论

• 酶是细胞用于催化反应的有机物，大多数酶是蛋白质，少数是RNA（核酶，Ribozyme），后来发现有些DNA分子也有催化反应的能力（脱氧核酶，Deoxyribozyme），但没有发现它被用作酶。
• 酶催化的反应可分为五类：取代反应（Displacement）、加成反应（Addition）、消去反应（Elimination）、缩合反应（Condensation）、异构反应（Isomerization）。
• 有些酶需要金属离子或有机物帮助催化反应，其中与酶共价结合的称为辅基（Prosthetic Group），与酶非共价结合的称为辅酶（Coenzyme）。

取代反应

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图1：常见酶促取代反应

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图2：取代反应

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图3：SAM向肾上腺素转移甲基

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图4：尿嘧啶的甲基化

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图5：转糖基反应

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图6：双取代反应理论

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图7：正碳中间体理论

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图8：溶菌酶

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图9：溶菌酶的一种可能机制

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图10：各种β糖苷键水解酶

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图11：丝氨酸蛋白酶

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图12：丝氨酸蛋白酶与底物结合

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图13：普遍承认的丝氨酸蛋白酶作用机制

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图14：半胱氨酸蛋白酶

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图15：N端亲核蛋白酶的催化二联体

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图16：糖基天冬氨酸的水解

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图17：N端亲核蛋白酶的特殊结构是自催化水解形成的

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图18：天冬氨酸蛋白酶

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图19：金属蛋白酶

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图20：P原子上的取代反应

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图21：伪旋转反应

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图22：偏磷酸反应

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图23：碱式磷酸酶

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图24：酸式磷酸酶

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图25：核糖核酸酶A

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图26：核酶

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图27：自切割内含子

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图28：微球菌核酸酶

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图29：磷酸葡糖变位酶

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图30：激酶

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图31：核苷酸转移酶

• 酶促取代反应的一般机制：
  • 一个亲核基团B^-靠近一个亲电子基团（亲核中心），其中心通常是C、S或P原子。
  • B-和亲核中心成键，同时与一个原有基团-Y断键，形成Y^-（离去基团，Leaving Group）。
  • 断键一般是C-O，C-N，C-S，C-P。
  • 酶给Y^-提供一个质子，形成YH。
  • 多数时候B^-和质子来自同一个分子BH， 被酶电解，如果它是水分子，此酶称为水解酶（Hydrolase）；如果它是其它分子，此酶称为转移酶（Transferase）。
  • 在手性中心发生的取代反应总是会造成分子手性改变。（图2）
• 影响取代反应发生的因素：
  • 化学平衡：细胞中富含水，所以水解酶几乎总是倾向催化水解，而在有机溶剂中它们几乎总是倾向催化水合反应。
  • 亲核基团的亲核性：决定基团亲核性的首要因素是碱性，但也受到很多其它因素的影响。
    • 氢氧根的碱性比羧酸根强，因而亲核性也强，但在生理pH条件下氢氧根浓度极小，而羧酸根可大量存在，所以羧酸根更容易被选作亲核基团。
    • 原子半径较大或成双键的原子，极化性（Polarizability）一般较大，亲核性较强，如I^- > Br^- > Cl^-。
    • 若亲核中心直接与有孤电子对的原子相连，则其亲核性会明显增强，此现象称为α效应（Alpha Effect）。
  • 离去基团：必须要能接受一对电子，通常要带负电荷。如甲基就是极难离去的基团，而碘就很容易离去。
  • 酶：酶可以根据底物的特定结构，根据结构降低过渡态的能量（活化能），提高亲核基团的表观亲核性。
• 常见酶促取代反应有4种：（图1）
  • 饱和碳原子的取代反应。
  • 酯基（Ester）、硫酯基（Thioester）、酰胺基（Amide）中的羰基碳原子的取代反应。
  • 磷原子的取代反应。
  • 硫原子的取代反应。
• 转甲基反应：
  • 转甲基反应（Transmethylation）是典型的饱和碳原子取代反应。
  • 若与碳原子直接连接的一个原子带正电荷，转甲基反应很容易发生。
  • 因此最常见的甲基供体是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），与甲基相连的S原子带正电荷。
  • 其它甲基供体有叶酸衍生物和钴胺素的钴原子。
• 转糖基反应：
  • 在糖基的1号碳原子（异头碳）上发生取代反应，也是饱和碳原子的取代反应。
  • 转糖基反应又可分为：水解反应（Hydrolysis）、磷酸解反应（Phosphorolysis）、糖基交换反应（Glycosyl Exchange）。
  • 作用于多糖的酶，根据发生取代的糖基的位置，分为内糖苷酶（Endoglycanase）和外糖苷酶（Exoglycanase）。
  • 外糖苷酶只攻击分子末端的糖基，通常攻击非还原端。
  • 通常，转糖基酶会改变糖基异头碳的手性，称为翻转酶（Inverting Enzyme），但也有很多不会改变，称为保留酶（Retaining Enzyme）。
  • 有两种理论解释保留酶现象：双取代反应（Double Displacement）和正碳离子（Carbocationic Intermediate）。
  • 双取代反应理论中，酶的某一基团先攻击糖基，这会使异头碳手性改变，然后另一分子再攻击糖基，完成反应，同时将异头碳手性恢复。（大多数磷酸解酶都是这种机制）
  • 双取代反应的特点：（以蔗糖磷酸解酶为例）
    • 反应动力学符合乒乓式酶的动力方程。
    • 若酶的浓度很小，而果糖（无标记）浓度很大，将蔗糖用放射性记号标记，则可观察到带放射性的蔗糖减少，而带放射性的果糖增加。
    • 砷酸解现象（Arsenolysis）：砷酸根和磷酸根高度相似，可以替代磷酸根作为底物，但砷酸糖高度不稳定，会立刻分解成自由的糖和砷酸根，若在底物中加少量砷酸根，则可观察到葡萄糖-1-磷酸大量分解成葡萄糖，这是因为酶催化逆反应产生的中间体迅速被砷酸根亲核攻击产生葡萄糖-1-砷酸，它迅速分解。
    • 直接检测反应中间物，可测得糖基和酶共价结合的中间物。
  • 正碳离子理论中，被取代的基团先离开糖基，留下一个带正电荷的离子（Oxocarbenium），然后亲核基团再与该原子反应，其异头碳手性可由酶根据需要确定。（此反应机制类似S_N1取代反应）
  • 正碳离子反应的特点：
    • 此机制较少见。
    • 正碳中间体环中的的1,2,5号碳原子和氧原子几乎在一个平面上，此构象称为沙发式构象（也叫半椅式构象）。
• 溶菌酶：
  • 溶菌酶的活性中心能容纳6个N-乙酰葡糖胺或N-乙酰胞壁酸组成的糖链，它催化的反应是水解其中第4个和第5个之间的糖苷键，它也是饱和碳原子的取代反应。
  • 溶菌酶是保留酶，采用的机制是正碳中间体反应。（目前有很多证据认为它采用双取代反应，但没有决定性证据）
  • 首先35号谷氨酸残基提供质子，使糖苷键断裂，然后正碳中间体被52号天冬氨酸残基稳定，最后水分子亲核攻击正碳中间体，完成反应。
  • 若将谷氨酸残基替换为谷氨酰胺，则溶菌酶活性完全丧失，但若将天冬氨酸替换为天冬酰胺，则活性只降低5%，因此天冬氨酸不是催化反应必要的残基，鹅的溶菌酶缺少该残基。
  • 胞壁酸的乙酰氨基也参与稳定正碳中间体，此现象在与溶菌酶结构相似的几丁质酶（Chitinase）中较明显。
  • 第4个残基需要被拉伸到沙发式构象才能便于反应进行，拉力被认为由氢键产生的电场提供。
• 其它糖基转移酶：
  • 纤维素酶（Cellulase）和其它β糖苷键水解酶：
    • 纤维素是自然界中最丰富的大分子，因而纤维素酶种类非常多，结构各不相同。
    • 纤维素酶既有内切酶，也有外切酶；既有从还原端外切的酶，也有从非还原端外切的酶；既有翻转酶，也有保留酶；活性中心的亲核基团既可是天冬氨酸，也可是谷氨酸。
    • 能消化纤维素的细菌通常能产生多种纤维素酶，它们聚合在一起组成纤维素消化体（Cellusome）。
    • 翻转酶和保留酶的活性中心都有两个酸性残基，但作用不同：
      • 两者都至少有一个残基作为亲核基团攻击糖苷键。
      • 保留酶中另一个残基要么也是亲核基团（双取代反应），要么稳定正碳中间体（正碳离子反应）。
      • 翻转酶的另一个残基距离较远，功能是促进水分子电离提供氢氧根。
    • 大多数β糖苷键水解酶催化的都是β1,3和β1,4糖苷键的水解。
  • 糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase）：参见糖类代谢
• 蛋白酶（Protease或Proteinase）：
  • 蛋白酶催化的反应是水解酰胺键，它是典型的羰基碳原子取代反应。
  • 类似于糖基转移酶，蛋白酶也分为内切酶和外切酶（又称肽酶，Peptidase）。
  • 外切酶根据切割的末端又分为氨肽酶（Aminopeptidase）和羧肽酶（Carboxypeptidase）。
  • 蛋白酶根据活性中心的结构分为丝氨酸蛋白酶（Serine Protease）、半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease）、天冬氨酸蛋白酶（Aspartic Protease）、金属蛋白酶（Metallo Protease）、N端亲核水解酶（N-terminal Nucleophile Hydrolase），其中研究最多的是丝氨酸蛋白酶。
  • 每种内切酶都有对底物有特定要求，如肽键N端或C端须有某种残基，这是由结合位点的结构决定的。
• 丝氨酸蛋白酶：
  • 丝氨酸蛋白酶种类很多，人体消化酶中就有胰蛋白酶（Trypsin）、糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶，Chymotrypsin）、弹性蛋白酶（Elastase）、蛋白酶E（Proteinase E）四种。
  • 所有的丝氨酸蛋白酶都有催化三联体（Catalytic Triad）结构，包括丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸。
  • 异氮磷（Diisopropylfluorophosphate）能不可逆地抑制丝氨酸蛋白酶，后来发现异氮磷中的磷酸根会和催化三联体中的丝氨酸共价结合，由此确定丝氨酸是这类酶的亲核中心。
  • 催化三联体在进化中多次独立出现，是趋同进化的范例，在胰蛋白酶及类似物中它们是195号，57号，102号残基；在细菌中（枯草杆菌蛋白酶）它们是221号，64号，32号残基；在小麦羧肽酶中它们是146号，397号，338号残基。
  • 组氨酸侧链的2个N原子分别和丝氨酸和天冬氨酸的侧链羟基形成氢键，组成电荷中继系统（Charge-relay System）。
  • 天冬氨酸的羧基埋在蛋白内部，它的电离会促进丝氨酸的羟基电离。
  • 丝氨酸蛋白酶的催化过程包含两次取代反应：丝氨酸先和酰胺键的C原子反应，取代N端肽链，然后水分子和C原子反应，取代丝氨酸，整个过程包含7步。
  • 羰基O原子会和蛋白酶的另外两个残基形成氢键，形成氧离子空穴（Oxyanion Hole）结构，帮助稳定中间物。（消化酶原之所以活性很低，主要原因是氧离子空穴无法形成）
  • 组氨酸先从丝氨酸的电离获得质子，又将它提供给离开的氨基。
• 其它蛋白酶：
  • 半胱氨酸蛋白酶的亲核基团是半胱氨酸的巯基，一个组氨酸帮助巯基电离，还有一个天冬氨酸残基起到和丝氨酸蛋白酶中的天冬氨酸相似的作用。
  • 半胱氨酸蛋白酶最早发现于热带水果，包括木瓜中的木瓜蛋白酶（Papain）、菠萝中的菠萝蛋白酶（Bromelain）、无花果中的无花果蛋白酶（Ficin）、猕猴桃中的猕猴桃蛋白酶（Actinidin）。
  • 溶酶体中的蛋白酶称为组织蛋白酶（Cathepsin），大部分是半胱氨酸蛋白酶，最多的是组织蛋白酶B；免疫系统中主要是组织蛋白酶S；破骨细胞中富含组织蛋白酶K，它的缺陷会造成致密性成骨不全（Pycnodysostosis）。
  • 细胞凋亡中起重要功能的胱天蛋白酶（Caspase）也是半胱氨酸蛋白酶。
  • 寄生虫和细菌常利用半胱氨酸蛋白酶保护自己，锥虫能分泌Cruzain，牙龈卟啉单胞菌能分泌牙龈蛋白酶（Gingipain）。
  • 某些人类腺病毒也有半胱氨酸蛋白酶。
  • 蛋白质酶体（Proteosome）中的蛋白酶是N端亲核水解酶。
  • 细菌中的蛋白质酶体只有一种N端亲核水解酶，真核生物的有至少三种，它们的催化机制相同，底物选择不同。
  • 除了蛋白酶，一些和氨基酸有关的酶也采用N端亲核水解酶的催化机制，如糖基天冬氨酸酶（Glucosylasparaginase）。
  • N端亲核水解酶的名称来源于其亲核基团，即α链N端的苏氨酸的羟基，它与苏氨酸的氨基组成催化二联体。
  • N端亲核水解酶的N端不是合成时就有的，而是分子内催化产生的，此时亲核攻击的基团是苏氨酸N端的残基，也是苏氨酸，协助它的羟基电离的是苏氨酸C端的残基，是组氨酸。
  • 胃蛋白酶（Pepsin）和反刍动物胃中的凝乳蛋白酶（Chymosin）属于天冬氨酸蛋白酶。
  • 人体的肾素（Renin）、组织蛋白酶D和E也是天冬氨酸蛋白酶。
  • HIV病毒利用天冬氨酸蛋白酶攻击T细胞膜。
  • 天冬氨酸蛋白酶的活性中心有两个天冬氨酸残基，它们和同一个水分子形成氢键，促使其电离，然后氢氧根亲核攻击肽键的羰基，最后其中一个天冬氨酸残基提供质子（来自水分子）。
  • 人体的羧肽酶需要锌离子，属于金属蛋白酶，锌离子可被替换为钴离子或镍离子（某些金属蛋白酶还可用锰离子）。（钙蛋白酶需要钙离子，但不属于金属蛋白酶，而属于半胱氨酸蛋白酶）
  • 锌离子和肽键羰基的O原子形成配位键，极大提高羰基的亲电子性。
  • 金属蛋白酶的作用机制尚未研究清楚，可能是谷氨酸引起水分子电离，氢氧根亲核攻击，也可能是谷氨酸直接亲核攻击。
  • 一些蛋白酶需要ATP才能工作，蛋白质酶体降解蛋白质需要ATP，但不一定用于催化；在细菌中有确认必须要ATP才能催化的蛋白酶，原因暂不明。
• 转磷酸根反应：
  • C原子只能成4个键，而P原子可以成5个键，所以P原子上的取代反应和C原子上的略有不同。
  • 亲核基团攻击P原子后，形成一个三角双锥形的过渡态，它比C原子取代反应中的过渡态稳定很多，之后还要经历一个不稳定的过渡态。（图20）
  • 一般情况下，三角双锥过渡态中亲核基团和离去基团恰好处于顶点（Apical Position），此时反应较快。
  • 偶尔处于顶点的是亲核基团和一个羟基，此时分子要先经过伪旋转反应（Pseudorotation）使离去基团达到顶点位置，反应较慢。（还有其它调整方式）
  • 还有一种类似上述正碳离子理论的反应机制，称为偏磷酸（Metaphosphate）反应。（图22）
  • 亲核基团带负电荷，而磷酸根在生理pH下也带负电荷，两者会互相排斥，酶解决此问题的方法有如下几种：
    • 酶自身携带Zn2+等离子，中和磷酸根的负电荷。
    • 需要ATP的酶通常要求ATP和Mg²⁺离子结合才能作为底物，它能中和ATP的负电荷。
    • 活性中心有精氨酸残基，它与磷酸根形成氢键。
    • 采用偏磷酸反应。
• 磷酸酶（Phosphatase）：
  • 磷酸酶催化磷酸基团从分子上水解。
  • 磷酸酶有非专一性和专一性两类，非专一性的磷酸酶有酸式磷酸酶（Acid Phosphatase）和碱式磷酸酶（Alkaline Phosphatase）。（植物没有碱式磷酸酶）
  • 专一性磷酸酶参与很多代谢通路，如糖异生（葡萄糖-6-磷酸酶、果糖-1,6-二磷酸酶）。
  • 非专一性磷酸酶主要用于为某些生理过程提供磷酸根。
  • 细菌的碱式磷酸酶集中在壁膜间隙，人的碱式磷酸酶集中在肾细胞、小肠绒毛、造骨细胞、破骨细胞。
  • 碱式磷酸酶需要Zn²⁺，能被Mg²⁺别构激活，亲核基团是丝氨酸，反应机制采用双取代反应。（图23）
  • 细菌的酸式磷酸酶也在壁膜间隙，人的酸式磷酸酶集中于前列腺和破骨细胞。（血浆中酸式磷酸酶上升是前列腺癌的重要指标）
  • 酸式磷酸酶的中心有Zn²⁺和Fe³⁺，有些还含Mn³⁺，磷酸根的一个氧原子先和Zn²⁺成配位键，然后与Fe3+配位的水分子电离出羟基，亲核攻击磷酸根。
  • 用于解毒的有机磷水解酶（Phosphotriesterase）和酸式磷酸酶相似，但它的中心是2个Zn²⁺离子。
• 核糖核酸酶A（Ribonuclease A）：
  • 核糖核酸酶A是一种胰消化酶，用于降解RNA。
  • 它的活性中心由赖氨酸、苏氨酸、两个组氨酸残基组成。
  • 一个天冬氨酸残基帮助组氨酸残基达到正确位置，若干赖氨酸和精氨酸残基帮助固定RNA的核糖骨架。
  • 它采用的机制分两步：
    • 首先，核糖的2‘羟基被一个组氨酸残基攻击电离，也可能是组氨酸使赖氨酸的氨基电离，然后氨基攻击羟基。
    • 羟基电离的同时，亲核攻击磷酸基团，使之与前一个核苷酸的核糖5’端断开，组氨酸残基协助此反应。（此步称为酯基转移，Transesterification）
    • 一个水分子电离后亲核攻击磷酸基团，得到游离的核苷酸，磷酸基团与3’相连。（此步即水解）
  • 核糖核酸酶A是第一种被人工合成的酶。
• 核糖核酸酶P（Ribonuclease P）和其它核酶：
  • 目前已知的所有核酶功能都是切割RNA，但结构各不相同，机制也略有不同，核糖核酸酶P是唯一一种在活细胞中能催化多次反应的核酶，因而在一定意义上是唯一的“核酶”。
  • 核糖核酸酶P在tRNA合成中起关键作用，它是第一种被发现的核酶。
  • 细菌、古菌、真核生物都有核糖核酸酶P，都由RNA和蛋白质两部分组成。
  • 对若干种模式生物的实验表明，核糖核酸酶P的活性只需RNA部分就能表现，但活细胞内它必须要有蛋白质部分才能正常工作。（真核生物的RNA部分最近才被证明具有催化活性）
  • RNA部分需在高盐环境下才能工作，蛋白质部分的功能可能是提高局部金属离子浓度以加快反应、提高底物亲和度、加速产物释放。
  • 核糖核酸酶P所用的亲核基团是氢氧根，利用核糖骨架的负电荷将水分子电离获得。
  • 小核酶来源于植物和动物基因组中的卫星RNA，目前已知4种：锤头酶（Hammerhead）、发夹酶（Hairpin）、HDV酶（HDV表示丁肝病毒）、VS酶（Varkud Satellite）。
  • 小核酶能借助特殊的酶进行滚轮式复制（见病毒的结构和分类），它们的酶活性就是将复制出的RNA切割为若干个小核酶。
  • VS酶是已知最大的核酶。
  • 小核酶利用的亲核基团是被切割的磷酸基团边上的2‘羟基，机制类似核糖核酸酶A。
  • 自切割内含子（Self-splicing Intron）也是一类重要的核酶，这些内含子能自动将自己从mRNA中剪出去，并将两端的外显子接合。
  • 自切割内含子还能将自己接入两端RNA之间，因而可在生物之间传递遗传信息。
  • 自切割内含子有两类，催化机制不同。
  • I类内含子首先和一个鸟苷分子结合，利用鸟苷的核糖3’羟基攻击内含子的5‘端磷酸基团，于是内含子5’端断裂，鸟苷被加至内含子的5’端。
  • 然后5‘端的外显子，其末端核苷的3‘端羟基攻击内含子3’端的磷酸基团，于是内含子完全离开mRNA，同时两段外显子共价结合。
  • II内含子采用的亲核基团是它内部的一个腺苷，内含子离开时其5‘端与该腺苷共价相连，形成套索形结构（Lariat-like Structure）。（剪接体催化的反应也会产生套索形结构）
  • 核糖体很多功能也是由RNA催化完成的，如它的肽基转移酶（Peptidyl Transferase）。
  • 实验室中发现，有些DNA分子也能催化反应（脱氧核酶，Deoxyribozyme），但没有在自然界中发现它们被用作酶。
  • 很多核酶都需要金属离子才能发挥功能，大部分情况下是Mg²⁺。
• 脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease）：
  • DNA的核糖，其2‘端没有羟基，不能以核糖核酸酶A采用的机制水解，因此DNA比RNA稳定。
  • 脱氧核糖核酸酶种类也很多，核糖核酸酶水解后磷酸基团一般和3’端相连，而脱氧核糖核酸酶既有使磷酸基团与3‘端相连的，也有使它与5’端相连的。
  • 研究最多的脱氧核糖核酸酶是微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease）。
  • 微球菌核酸酶的专一性不强，既能切DNA，也能切RNA，没有特别的切割序列，切割后磷酸基团留在3‘端。
  • 它的催化机制非常简单，一个谷氨酸残基的侧链羧基与水分子结合，促使其电离，然后氢氧根亲核攻击磷酸基团。
  • 微球菌核酸酶需要Ca²⁺。
  • 有一类脱氧核糖核酸酶，称为DNA限制性内切酶（DNA Restriction Endonuclease），它们专一识别特定的DNA序列，并在序列中特定位置切割DNA，它们在生物工程中很重要。
  • 最常见的DNA限制性内切酶有：EcoRI（大肠杆菌）、EcoRV（大肠杆菌）、BamHI（解淀粉芽孢杆菌）。
  • DNA限制性内切酶都需要Mg²⁺，一般识别的序列是回文互补序列，即倒过来的序列就是它的互补序列。
  • DNA限制性内切酶在DNA的两条链上切割位置不一定相同，不同时产生的DNA末端称为黏性末端（Adhesive End），相同时产生的DNA末端称为平末端（Flat End）。
• 变位酶（Mutase）：
  • 变位酶催化的反应是在一个分子内将磷酸基团从一个位置移至另一个位置，常见变位酶有：磷酸葡糖变位酶（Phosphoglucomutase）、磷酸甘油酸变位酶（Phosphoglycerate Mutase）、磷酸甘露糖变位酶（Phosphomannomutase）。
  • 变位酶多采用双取代反应机制，即先由一个氨基酸残基给受体位置提供磷酸基团，再从供体位置提供磷酸基团。
  • 磷酸葡糖变位酶催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸的相互转化。
  • 在催化反应前，磷酸葡糖变位酶的活性中心的丝氨酸残基被磷酸化，该磷酸基团随后被转移至底物上，形成葡萄糖-1,6-二磷酸，此中间物称为变位酶的共底物（Cosubstrate）。
  • 然后，共底物上的另一个磷酸基团被转移回丝氨酸残基。
  • 若丝氨酸残基的磷酸基团在催化中不慎丢失，则可从一个自由的葡萄糖-1,6-二磷酸重新获得。
  • 其它变位酶的磷酸基团载体可为组氨酸或天冬氨酸。
• 激酶（Kinase）：
  • 激酶催化的反应是将磷酸基团从ATP或其它高能磷酸化合物转移至其它底物。
  • 所有的激酶都有相似的结构，即一个β折叠片两端各一个球形结构域。（图30）
  • （脱氧）核苷酸激酶（(Deoxy-)Nucleotide Kinase）利用ATP将单核苷酸变为二核苷酸，其中最重要的是腺苷酸激酶（Adenylate Kinase）。
  • 多种激酶在代谢通路中有重要作用，如己糖激酶（Hexokinase）、磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase）、磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate Kinase）、肌酸激酶（Creatine Kinase）、丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase）。
  • 蛋白质激酶（Protein Kinase）在蛋白质功能调控中有重要功能，被磷酸化的残基绝大部分是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。
  • 多数激酶采用直接亲核攻击的机制，少部分激酶会产生磷酸化酶的过渡态。
• 核苷酸转移酶（Nucleotidyl Transferase）：
  • DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、拓扑异构酶（Topoisomerase）不直接转移磷酸基团，而是转移单核苷酸，此类酶称为核苷酸转移酶。
  • 反应机制一般是一个核苷酸的核糖3’端的羟基直接攻击另一个核苷酸的最靠近核糖的磷酸基团。
  • 合成RNA和DNA的酶采用的底物是NTP和dNTP，核苷酸被加入核酸后释放焦磷酸，它立刻被焦磷酸水解酶分解为磷酸，该反应几乎不可逆，因而可保证已合成部分的稳定性。
• 硫氧还反应：
  • 发生在S原子上的取代反应通常伴随着氧还反应，最常见的类型是巯基-二硫键交换反应（Thiol-disulfide Exchange）。
  • 几乎所有真核生物细胞内都有谷胱甘肽（Glutathione），一种含巯基的三肽，两个谷胱甘肽分子的巯基可被还原形成二硫键。
  • 几乎所有细胞（包括原核生物）都有硫氧还蛋白（Thioredoxin），化学功能类似谷胱甘肽。
  • 巯基-二硫键交换反应中，巯基（还原态）的S原子亲核攻击二硫键（氧化态）的S原子，与之形成新的二硫键，同时还原另一个S原子形成巯基。

加成反应

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图32：加成反应

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图33：半缩醛

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图34：碳酸酐酶

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图35：碳酸酐酶的催化机制

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图36：醇胺和席夫碱

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图37：羰基边上的C-C双键的电子共振

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图38：米氏加成

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图39：烯酰-CoA水合酶

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图40：烯酰-CoA水合酶的催化机制

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图41A：富马酸水合酶的碳正离子机制

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图41B：富马酸水合酶的E1cb机制

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图42：烯醇酶

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图43：顺乌头酸酶

• 加成反应最容易在极性双键上发生，包括羰基和亚氨基。
• 醇类、胺类、硫醇类易和羰基发生加成反应，产物包括半缩醛（Hemiacetal）、半缩酮（Hemiketal）、醇胺（Carbinolamine，通常会脱水形成席夫碱）、半缩硫醛（Hemimercaptal）。（图33给出了半缩醛的形成机制，其它物质依此类推）
• 虽然水有羟基，但绝大多数情况下化学反应平衡不倾向于水与羰基发生加成反应，即一个C原子与2个羟基相连会立刻发生消去反应变成羰基和水，少数重要特例：甲醛水溶液（福尔马林）、CO₂水溶液（碳酸）。
• 极性双键边上的C-C双键也可以发生加成反应。
• 极少数情况下，孤立的非极性双键可发生加成反应。
• 碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase）：
  • 碳酸酐酶是典型的羰基加成酶，催化的是CO₂与水加成形成碳酸。
  • 碳酸酐酶是催化速度最快的酶之一，属于“完美酶”。
  • 碳酸酐酶的活性中心有一个Zn²⁺，它的周围有3个组氨酸残基和一个氢氧根形成配位键，该氢氧根被一个丝氨酸残基的羟基稳定。
  • 一般认为反应分三步：
    • 锌离子边的氢氧根亲核攻击C原子，形成和锌离子配位的碳酸氢根。
    • 一个水分子取代碳酸氢根，释放产物。
    • 若干组氨酸残基和其它残基组成类似丝氨酸蛋白酶的电荷中继系统的氢键网络，协助水分子电离形成氢氧根。
• 米氏加成（Michael Addition）和其它羰基β碳原子加成：
  • 羰基边上的C-C双键存在电子共振现象，这样羰基的亲电子性就会被转移到离双键较远的β碳原子上。
  • 该C原子可以被亲核攻击，形成烯醇式中间物，在添加一个质子后形成稳定的产物，此加成反应称为米氏加成，其逆反应称为米氏消去。（图38）
  • 为了制造米氏消去反应的条件，最常见方法是将一个羟基氧化为羰基。
  • 在发生加成反应前，通常细胞会将酰基转移到辅酶A（维生素B₅衍生物）上，形成硫酯，最常见的产物是乙酰-CoA。（因此辅酶A又称酰基载体）
  • 用辅酶A形成硫酯键是因为常见酰类中，硫酯是最容易发生反应的。（乙酰-CoA又称活化乙酸）
  • 辅酶A或其一部分可以和蛋白质共价结合，此时蛋白质称为酰基载体蛋白。
  • 有些羧酸也能发生β碳原子加成反应，但羧酸的羰基是反应性最弱的，因此米氏加成机制不再适用，此时采用的机制是碳正离子机制。
• 烯酰-CoA水合酶（Enoyl-CoA Hydratase）：
  • 烯酰-CoA水合酶是脂肪酸β氧化中的一步，是典型的米氏加成酶。
  • 该酶的活性中心由2个谷氨酸残基和1个甘氨酸残基组成，谷氨酸残基都在羰基的β碳原子一侧，甘氨酸残基在另一侧。
  • 一个谷氨酸残基协助水分子电离，用羟基亲核攻击β碳原子。
  • 另一个谷氨酸残基为α碳原子提供质子。
  • 甘氨酸残基的氨基N原子与羰基O原子形成氢键，使电子共振倾向于极性转移的形式。
• 富马酸水合酶（Fumarate Hydratase或Fumarase）：（注：富马酸又称延胡索酸）
  • 富马酸的水合反应是在羧基边上的C-C双键加成反应，因此不采用米氏加成机制。
  • 首先，借助羰基的微弱极性，一个质子将双键的电子吸至α碳原子处，于是α碳原子带上氢，β碳原子带上正电荷。
  • 然后，氢氧根亲核攻击β碳原子，完成反应。
  • 较近期的研究认为上述机制不对，新的机制称为E1cb机制，其区别在于是用氢氧根把电子推到α碳原子上，而不是用质子吸。（图41B）
  • 除了富马酸水合酶，若干种以富马酸为底物或产物的酶因结构相似，被认为机制也同上，包括天冬氨酸酶（Aspartase）、精氨琥珀酸裂解酶（Argininosuccinate Lyase）、腺苷琥珀酸裂解酶（Adenylosuccinate Lyase），统称为天冬氨酸酶-富马酸酶家族（L-aspartase/fumarase Family）。
• 烯醇酶（Enolase）：
  • 烯醇酶将2-磷酸甘油酸变为磷酸烯醇式丙酮酸，是羧基边上的消去反应（脱水反应）。
  • 烯醇酶需要2个金属离子，可用Mg²⁺或Mn²⁺。
  • 其中一个离子结合较紧密，称为Conformational Ion（稳定蛋白质构象），另一个结合较松，称为Catalytic Ion（稳定中间物）。
  • 烯醇酶的机制也被认为是E1cb机制，质子由一个组氨酸残基脱下，而羟基被一个赖氨酸残基脱下。
• 顺乌头酸酶（Aconitase）：
  • 顺乌头酸酶连续催化一个消去反应和一个加成反应，总结果是一个异构反应。
  • 柠檬酸先脱水，形成顺乌头酸的中间物，再水合形成异柠檬酸。
  • 顺乌头酸酶是铁硫蛋白，目前认为其中一个Fe²⁺的作用类似碳酸酐酶的Zn²⁺，而其它铁离子通过氧还反应参与酶的调控。

消去反应

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图44：脱羧消去反应

• 大部分消去反应是加成反应的逆反应，机制如上已述。
• 如果一个亲核基团和一个亲电子基团分别处在一个C-C=C-C碳链的两端上，则它们可以同时离开分子，碳链变为C=C-C=C，即发生了消去反应。
• 该机制有一个特例，即同时失去基团COO^-和Y^-，称为脱羧消去反应（Decarboxylative Elimination）。
• 脱羧消去反应可以用于合成苯环，图44显示了生物合成苯丙氨酸的苯环的过程。

缩合反应和裂解反应

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图45：缩合反应

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图46：草酰乙酸水解酶

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图47：硫解酶

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图48：羟醛缩合酶

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图49：柠檬酸合酶

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图50：多元羧酸合酶

• 涉及C-C键断裂和形成的反应，一般不能用取代反应的机制进行，而需要缩合反应和裂解反应。
• 裂解反应一般发生在羰基边上的α和β碳原子之间，缩合反应是分裂反应的逆反应，对应地有三种类型，见图43。
• 第一类称为羰基取代反应（Carbonyl Displacement），以草酰乙酸水解酶（Oxaloacetate Acetylhydrolase）为典型：
  • 羰基取代反应最容易在β碳原子也是羰基C原子时发生。
  • 首先，利用羰基的极性，α和β碳原子之间的单键断裂。
  • 同时，羟基亲核攻击羰基碳原子，α碳原子获得一个质子。
  • 产物是乙酸和草酸。
• 硫解酶（Thiolase）用CoA作为亲核基团，从脂肪酰-CoA上逐个取下乙酰-CoA。
• 第二类称为羟醛缩合反应（Aldol Condensation）：
  • 醛在强碱溶液中会部分转变为烯醇，它们能反应形成3-羟丁醛，这是最初的羟醛缩合反应，目前的“羟醛缩合反应”包括所有羰基和酮发生的加成反应。
  • 羟醛缩合酶有两类，第一类要形成席夫碱；第二类不形成席夫碱，但需要金属离子。
  • 最典型的羟醛缩合酶：糖酵解的醛缩酶（Aldolase）。
  • 第二类羟醛缩合酶：
    • 首先，从酮的α碳原子上取下一个质子，酮会变为烯醇，此形式被酶的金属离子稳定。
    • 然后，烯醇的C-C双键中的一个断裂，α碳原子和羰基的C原子成键，羰基的O原子接受取下的质子。
  • 第一类羟醛缩合酶：
    • 首先，酶的一个侧链氨基的N原子替代酮的O原子，与C原子成双键，即形成席夫碱。
    • 然后，从酮的α碳原子取下一个质子，酮会变为烯胺。
    • 剩余部分和第二类大致相同，见图46。
  • 有一类羟醛缩合酶，以乙酰-CoA和α碳原子为羧基的酮为底物，缩合的同时催化硫酯键水解，称为多元酸合酶（Polycarboxylic Acid Synthase），其中包括柠檬酸合酶（Citrate Synthase）。
  • 硫酯键的水解不可逆，因此硫酯键不但有增强反应性的功能，还有保证反应方向的功能。
• 第三类是烯醇和CO₂的加成反应，其逆反应是最常用的脱羧方法。
  • 此类酶中最简单的机制是利用金属离子或席夫碱促进β碳原子断键，适用于β羧酸。
  • 若底物中没有羰基，则常先将一个羟基氧化成羰基，然后脱羧。
  • 细胞中最常用的固定CO2的分子有三种：核酮糖-1,5-二磷酸（C₃暗反应）、磷酸烯醇式丙酮酸（C₄暗反应）、琥珀酰CoA（还原性三羧酸循环）。

脱氢反应

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图51：常见脱氢反应

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图52：NAD⁺和NADP⁺

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图53：乳酸脱氢酶，示脱氢反应机制

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图54：醛基氧化为羧酸

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图55：HMG-CoA被还原到醇基

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图56：FAD和FMN

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图57：核黄素的功能

• 脱氢反应是特殊的消去反应，是涉及氧还反应的消去反应。
• 脱氢反应中，一个单键两侧的原子各脱去一个氢原子，其中一个是H⁺，另一个是H^-，形成双键。
• 细胞中不会出现游离的H^-，它会直接被转移到特殊的辅酶，氢载体上。
• 细胞中常用的氢载体有四种：NAD⁺，NADP⁺，FAD，FMN。
• NAD⁺和NADP⁺的还原性差不多，但细胞中NAD⁺和NADPH较多；NAD⁺一般用于分解代谢中，NADP⁺一般用于合成代谢中。
• FAD和FMN通常要和酶共价结合，其还原性随酶的不同而不同。

NAD⁺（辅酶I）和NADP⁺（辅酶II）

• 结构见图52，与氢结合的部位是氮杂苯环。
• 氧化态下，在260 nm处有吸收峰，被还原后出现新的340 nm处吸收峰。
• 硫代硫酸钠（大苏打、海波）可以还原它，产生SO₂。
• 所有使用此类辅酶的酶都有两个结构域，其一与辅酶结合，结合位点称为Rossman Fold。
• 脱氢反应机制见图53。
• 细胞常利用NAD(P)⁺将醛氧化为羧酸：
  • 首先使羰基和酶的巯基发生加成反应，羰基变为羟基。
  • 然后羟基发生脱氢反应，变回羰基，形成硫酯。
  • 硫酯水解通常伴随很大的能量释放，可用于形成ATP，但需要磷酸基团，所以此处用磷酸作亲核基团发生取代反应。
  • 最后磷酸基团水解同时产生ATP。
  • 最典型的上述反应是3-磷酸甘油醛变为1,3-二磷酸甘油酸，再产生3-磷酸甘油酸。
• 反过来，羧酸也可被还原为醛基，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
• 醛基有时会被进一步还原为醇基，如HMG-CoA还原酶。（图55）
• 约一半的亚洲人的乙醇脱氢酶有缺陷，不能大量饮酒（会血乙醛上升、脸红、头晕）；戒酒硫（Disulfiram）能抑制乙醇脱氢酶，也会造成上述症状。
• NAD(P)⁺不能用于氧化C-C单键，NAD(P)H却可以可以用于还原C-C双键，此反应见于脂肪酸的合成和链甾醇（Desmosterol，胆固醇合成中间物）的还原。

FAD和FMN（统称核黄素）

• 结构见图56，与氢结合的部位是异咯嗪。（核黄素的结构中有核糖醇，光谱性质为呈淡黄色，故名核黄素，但核糖醇不是通过糖苷键与之结合的）
• 核黄素通常氧化性比NAD(P)⁺强，但产生的ATP不如NAD(P)⁺多。
• 核黄素既可一次接受两个电子也可只接受一个，而NAD(P)⁺必须一次接受两个。
• 还原的核黄素容易被氧气氧化，不需酶催化。
• 核黄素是植物光感受系统的一部分，也是细菌荧光系统的一部分。
• 总的来说，核黄素的生化功能比NAD(P)⁺丰富得多，但在供能反应中NAD(P)⁺更常见。（图57）