酵母的小菌落

50 年前，有报道称，面包酵母 Saccbaromyces cerevisiae 在用 DNA 靶向药物吖啶黄处理后可以形成“微小菌落petite colonie”突变体。为了纪念细胞质遗传研究的周年，我们将对早期工作进行回顾，并结合一些当前发展的观察。主要重点是解决线粒体 DNA 丢失如何导致微小阴性酵母致死（ρ0致死）以及酿酒酵母如何耐受线粒体 DNA 消除的问题。最近的研究表明，ρ0致死可以通过小阴性酵母克鲁维酵母线粒体 F,-ATPase 的 U、p 和 y 亚基中的特定突变以及裂殖酵母核 pfp 等位基因来抑制。相反，酿酒酵母中 F,-ATPase LY 和 p 亚基编码基因的失活以及 AAC2、PGSIIPELI 和 YMEl 基因的破坏会将这种小阳性酵母转化为小阴性形式。对影响线粒体 DNA 依赖性的核基因的研究为线粒体基因组所提供的功能以及线粒体内膜结构和功能完整性的维持提供了重要的见解。

Ⅰ.引言

1949 年，巴黎的 Boris Ephrussi 和同事描述了面包酵母 Saccharomyces cerevisiae 中“小菌落”突变体的鉴定和特性。几年后，两本专著描述了小菌落的显著遗传和生化特性，详细介绍了呼吸所需的新孟德尔因子。尽管这些出版物标志着线粒体生物合成遗传学研究的开始，但它们的重要性并没有被试图解开牛心和大鼠肝线粒体呼吸和氧化磷酸化秘密的生物化学家所重视（Schatz，1993）。到 1963 年，人们认识到动物、植物和真菌中的线粒体能够结合氨基酸并含有 DNA 和 RNA（Rabinowitz 和 Swift，1970），这引起了人们对酵母细胞质遗传的早期研究的关注。这篇综述是为了纪念第一次发表 50 周年，简要介绍了 petite 的历史记录及其对线粒体生物合成研究的贡献。以下各节（111-VI）重点介绍了最近有关区分 petite 阳性和 petite 阴性酵母的因素的令人兴奋的发现。正如将要叙述的那样，意想不到的结果将 petite 突变的研究推向了新的领域。在此期间，petite 突变体在建立面包酵母线粒体基因组的遗传和物理图谱方面发挥了重要作用（Linnane 和 Nagley，1978 年；Locker 等人，1979 年；Dujon，1981 年），并继续用于研究 mtDNA 复制和传递。此外，小突变的机制具有内在意义，部分原因是小突变以每代约 1% 的高速率自发出现，并且可以通过许多物理和化学因素轻松诱导（Ferguson 和 von Borstel，1992 年）。本综述将不考虑小突变体在理解线粒体 DNA 重组、基因组重排、复制和传播方面的作用，但可以在前面提到的引文和其他文章中找到（Whittaker，1979 年；Wolf 和 Del Guidice，1988 年；Gingold，1988 年；Dujon 和 Belcour，1989 年；Clark-Walker，1992 年；Piskur，1994 年）。

II.历史观点

A. 面包酵母中的“Petite Colonie”突变体

从1949 年，Boris Ephrussi 及其合作者在“Action de l’acriflavine sur les levures”标题下发表了七篇论文，描述了 petites 的遗传、生理和生化特征。遗传学研究证实，细胞质因子不可逆地改变或丢失 ，而生化和生理学实验表明，突变菌株生长较慢，呼吸作用不足，细胞色素 a + a3 和 b 缺失。acriflavin中的一种活性成分euflavin被发现会诱发小突变，而不是作为预先存在的小突变的选择剂，小突变在面包酵母培养物中发生的频率约为 0.2-1.0%。关于自发的小突变，人们注意到它们的频率比孟德尔基因突变的预期频率高得多，而且，Ephrussi 和同事（1949a）似乎很惊讶，以前的作者没有描述过在他们的平板培养物中存在更小和更苍白的菌落。然而，在需要粉色腺嘌呤的菌株中出现白色菌落，这被归因于“通过与任何正常种群杂交很容易获得的某些基因成分耗尽”（Lindegren 和 Lindegren，1947），这似乎错失了发现酵母细胞质遗传的机会。同样，在用氰化物或环氧乙烷处理后获得的呼吸水平较低的其他酿酒酵母菌株的观察结果，事后看来，代表了化学诱导的微小突变体的例子（Stier 和 Castor，1941；Whelton 和 Phaff，1947）。这三个小组缺乏后续调查，突显了 Boris Ephrussi、Piotr Slonimski 及其同事在坚实的基础上建立微小突变体研究方面取得的独特成就。

尽管巴黎小组的研究为呼吸所需的遗传因子位于细胞质和可能的线粒体提供了强有力的证据（Ephrussi 和 Slonimski，1955 年），但其他人用瞬时异核体直接证明了该元素的核外传递（Wright 和 Lederberg，1957 年）。使用遗传标记的单倍体野生型和小菌株，证明了新融合对的亲本型芽可能具有相反伴侣的呼吸表型。在这些实验中，利用了新发现的抑制现象。

对野生型和小突变体杂交的初步研究已经产生了几乎 100% 的呼吸能力二倍体。然而，在大规模交配实验中，发现不同类型的petite 突变体会​​产生一些呼吸缺陷的二倍体后代（Ephrussi 等人，1955 年）。换句话说，这些菌株含有一种可以抑制赋予呼吸能力的遗传元素的因子。进一步的研究表明，抑制性 petite 的抑制程度多种多样，并且这种特性可以传递（Ephrussi 和 Grandchamp，1965 年；Ephrussi 等人，1966 年）。目前的知识使我们能够将抑制性 petite 解释为保留了mtDNA，但有缺失和重排，而吖啶黄产生的突变体称为中性 petite，用于初始测试，通常缺乏 mtDNA（见下文）。利用超抑制小体实现抑制的机制仍在研究中，本综述将不予讨论。

偶然发现在研究中起着重要作用，分离小菌落的发现就是明证。在对二倍体面包酵母菌株的研究中，发现 44% 的子囊孢子呼吸功能缺陷，这表明孟德尔基因可能是原因。进一步分析证实，二倍体菌株是控制呼吸能力的隐性染色体基因的杂合子。继这一重大发现之后，人们很快认识到呼吸作用需要几个核基因。此时引入了命名法，以区分分离小体 p1、p2 等和营养小体 p-，其中野生型用 P 和 p+ 表示。自这项早期研究以来，已分离和鉴定了 200 多个线粒体生物发生所需的核基因。在负责线粒体代谢的核基因中，有一类基因影响线粒体DNA的复制、重组和传递。然而，这些基因对小颗粒产生的影响是一个很大的话题，本综述将不予考虑。

B. 线粒体DNA与p因子的关联

在确定了某些呼吸酶合成所需的细胞质因子后，似乎有理由假设“导致营养小颗粒形成的突变是由线粒体的丧失引起的”（Ephrussi，1953年）。然而，另一种假设是，细胞质因子的丧失会消除呼吸酶的合成，但颗粒保持不变（Slonimski和Ephrussi，1949年）。后一种观点的支持来自以下观察呼吸缺陷突变体仍然含有线粒体 (Yotsuyanagi, 1955,1962)。通过不同的方法获得了影响细胞质因子性质的进一步证据。基于紫外线导致小菌落增加的知识，结果表明突变体产生的作用光谱与核酸的吸收光谱相匹配，峰值约为 260 nm。然而，细胞质因子的性质多年来一直未得到解决，直到证明来自面包酵母的纯化线粒体具有相关的 DNA (Schatz 等人，1964)。几位研究人员很快发现，与线粒体共分离的 DNA 具有与核 DNA 不同的碱基组成，证据是 CsCl 中的浮力密度较低且熔化温度较低。后来，电子显微镜研究通过显示线粒体基质中存在 DNA 纤维，消除了对 DNA 位置的任何疑虑。

线粒体含有 DNA 的认识促使研究人员询问这种物质是否具有可以等同于 p 因子的编码功能。因此，在前面引用的研究中，还通过浮力密度离心法检查了小突变体的 DNA。结果分为两类。一组实验表明，小突变体缺乏线粒体 DNA，而其他分析则显示 DNA 数量减少或浮力密度改变。对这两类突变体的一个解释是，自发产生的形式永远不会失去所有的线粒体 DNA，而长期吖啶黄处理诱导的形式通常会失去所有的线粒体 DNA。事实上，将面包酵母暴露于 DNA 靶向药物溴化乙锭 (EB) 中，这种药物比吖啶黄更能有效地诱导小突变体 ，通常会消除所有线粒体 DNA，使细胞 ρ0。

抑制作用与线粒体 DNA 浮力密度变化之间的联系提供了强有力的证据，表明 p 因子是线粒体 DNA 。许多研究小组支持这一观点，他们坚定地确定了野生型线粒体 DNA 的碱基组成及其在小突变体中的改变 。小酵母中线粒体 DNA 碱基组成的变化，一般是腺嘌呤和胸腺嘧啶增加，表明导致呼吸丧失的原因是缺失，而不是点突变。在 S.cerevisiae 线粒体 DNA 中，缺失的形成 发生在序列同源性区域的重组。同样，在 Kfuyveromyces factis 线粒体 DNA 中，短重复序列是缺失的位点。这些事件的细节以及参与线粒体 DNA 重组的酶将不予讨论。

Ⅲ.其他酵母的呼吸缺陷突变

A. 小菌落阳性和小菌落阴性酵母

鉴于吖啶黄对酿酒酵母小菌落突变体有特异性诱导作用，因此，在研究该药剂对其他酵母的作用之前，已经过去了很多年，这似乎很奇怪。也许当时普遍存在一种类似于 Alvarez 和 Mackinnon (1957) 的态度，他们在关于白色念珠菌呼吸缺陷突变体的论文中写道：“遗传性呼吸功能丧失可能是具有有氧和无氧代谢能力的微生物中常见的现象。”尽管有这种假设，但大多数经测试的子囊菌酵母在用euflavin处理时不会形成小突变体，这由 de Deken (1961) 首次报道，并由 Bulder (1964a,b) 和 de Deken (1966b) 进行了更广泛的研究。在初步观察到酵母可以分为小菌落阳性和小菌落阴性物种后，人们开始研究生理特性和突变状态之间是否存在相关性。药物吸收的差异被排除在解释之外，因为这两类酵母的呼吸酶合成都受到抑制。由于 euflavin 通过抑制细胞色素合成来模拟葡萄糖抑制，因此有人提出，Crabtree 效应的存在与形成小突变体的能力之间可能存在相关性。一般来说，存在正相关关系，但也有例外。例如，裂殖酵母对呼吸作用的抑制是其三倍从甘油转变为葡萄糖，但它是小负性的。此外，Brettanomyces anomalus 和 Kloeckera africana（程度较小）不表现出克拉布特里效应，但形成小分子并不困难 。厌氧生长能力和小变异性之间存在更好的相关性，但也有例外，例如前面提到的 K. africana，在支持 S. cerevisiae 和其他小阳性物种的条件下不能厌氧生长。

揭示影响小菌落突变易感性的因素的另一个复杂因素是，观察到分离呼吸缺陷突变体可以从小菌落阴性物种 K. lactis（Herman 和 Griffin，1968 年；Del Giudice 和 Puglisi，1974 年；Allmark 等人，1977 年；Gbelska 等人，1996 年）和 S. pombe（Heslot 等人，1970 年；Wolf 等人，1971 年）中分离出来。

此前有人提出，S.rosei 的小菌落阴性表型不能用发酵能力不足来解释（Bulder，1966 年）。尽管遗传数据表明，小菌落阴性物种具有足够的发酵能力，可以在没有呼吸的情况下生长，但需要注意的是，前面讨论过的已识别的染色体突变可能是有漏洞的，而残余的呼吸能力可能足以支持生长。然而，通过破坏细胞色素 c 的独特基因 CYCl（Chen 和 Clark-Walker，1993），直接证明了 K. lactis 可以在没有功能性电子传递链的情况下生长。含有被破坏的 CYCl 的菌株不能在需要呼吸进行代谢的不可发酵底物上生长，但可以在葡萄糖上生长。换句话说，K. lactis 具有足够的发酵能力来支持生长，但它不能形成细胞质小菌落突变体。这些结果暗示 K. lactis 的线粒体基因组至关重要，它编码一个或多个必需基因。因此，提出了以下问题：哪些线粒体基因对小阴性酵母至关重要，小阳性物种中存在哪些差异使它们能够在线粒体 DNA 丢失后存活下来？第 IV、V 和 VI 节将考虑一种回答这些问题的实验方法。

6. 小阳性性状的进化

尽管似乎没有所有小阳性酵母都具有决定性的生理特性，但外来元素可能会掩盖共同属性。例如，即使补充了 S. cerevisiae 所需的麦角固醇和不饱和脂肪酸（Andreasen and Stier，1953，1954），小菌落阳性菌种 K. africana 也无法在厌氧条件下生长，这可能是由于缺乏需要氧气合成的因子或培养基中未提供的某种化合物。在其自然栖息地中，由于存在这种化合物，K. africana 可能能够在微需氧环境中生长。因此，在低氧条件下生长的能力仍有可能是小菌落阳性菌种的共同特征，而附带但偶然的表型是能够在线粒体 DNA 丢失后存活的能力。到目前为止，由于酵母分类学状态不令人满意，还无法确定小菌落易变性的系统发育分布。 DNA 序列比较在酵母系统发育中的应用揭示了一些奇怪的错误分类例子，这些错误分类一定是由于以前使用的生理特征的趋同进化造成的（参见 Saccharomyces kluyveri，一种微小阴性酵母：Kurtz-man 和 Robnett，1998 年）。当基于序列的系统发育树被检查是否存在微小阳性物种时，显然至少在两种情况下出现了对突变的敏感性，并且在一种情况下，形成微小的能力似乎已经丧失（Hoeben 等人，1993 年）。

有两个很好地分离的微小阳性酵母分支。酵母属中的大多数物种（包括近亲和更远的形式）都是小菌落阳性（Nagai 等人，1961；Bulder，1964a；de Deken，1966b；Clark-Walker 等人，1981）。同样，除了一个物种 Brettanomyces custersianus 之外，Dekkera Brettanomyces 属中的其他所有物种都是小菌落阳性（Bulder，1964a；Subik 等人，1974a；Hoeben 等人，1993）。通过序列比较构建的树上这两个小菌落阳性组的位置表明，它们被小菌落阴性酵母广泛分开（Cai 等人，1996；Kurtzman 和 Robnett，1998）。位于这些

XIN JIE CHEN AND G. DESMOND CLARK-WALKER

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组之间的是其他小阳性物种，例如光滑念珠菌、克鲁维酵母arrowii、Kloeckera africana 和 Hanseniaspora vinea，进一步的研究可能会表明它们与 Saccharomyces 进化枝有关（Clark-Walker 等人，1981 年和未发表的观察结果）。然而，Saccharomyces 和 Dekkera 进化枝之间的广泛分离表明形成小突变体的能力是在两个不同的场合出现的。由于只有 500 多种子囊菌酵母（Kurtzman 和 Fell，1997 年）中的一小部分进行了突变状态检查，因此，在酵母分类学更加稳固的情况下，对这一特性进行全面分析将大有裨益。此类研究与更详细的生理特性评估相结合，可能会揭示小阳性酵母所占据的进化生态位。正是利用特定环境（可能是微需氧环境）的能力选择了小阳性酵母所共有的生理特性。也许这种特性就是在没有电子传递链的情况下维持线粒体功能完整性的能力。这些细胞中线粒体DNA的丢失导致类似于厌氧的生理状况，但不再是致命的。

C. 自然产生的呼吸缺陷型酵母

在关于小诱导的研究中，Bulder（1964a）列出了Schizosaccharomyces versatalis、Torulopsis lactis-condensi、T. pintolopesii和Candida slooffii，它们是实验室外分离的呼吸缺陷型（强制性发酵）菌株。随后，其他人证实了 C. sloofii、T. pintolopesii（Watson 等人，1980）和 S. versatilis（Subik 等人，1974a）缺乏呼吸作用。分离呼吸缺陷菌株（通常来自厌氧环境，例如动物肠道（Mendonca-Hagler 和 Phaff，1975））提出的问题是，它们是否与营养型小酵母相似，还是由染色体基因突变引起。对三种不同 C. sloofii 分离株的研究表明，每种分离株都含有低浮力密度的环状 DNA，类似于面包酵母小酵母突变体的线粒体 DNA，并且每种情况下的环状 DNA 大小不同（Arthur 等人，1978）。这些菌株与小突变体相似，这通过观察结果得到进一步支持，即真黄素可以消除轻浮力密度 DNA（Arthur 等人，1978 年）。

随后对 T. pintolopesii 的研究表明，该分离株也类似于小突变体（Watson 等人，1980 年）。 早期的 DNA 浮力密度分析和杂交实验表明，C. sloofii 和 T. pintolopesii 的呼吸能力强的亲本可能是 Saccharomyces telluris 和/或 Torulopsis bovina，并且这四种酵母是同一分类群的代表（Mendonca-Hagler 和 Phaff，1975 年）。

似乎 C. sloofii 和 T. pintolopesii 是小型突变体，它们找到了一个可以与亲本形式竞争的生长环境。然而，S. versatilis 的起源远不清楚。如上所述，这种酵母缺乏呼吸；然而，与营养型小型酵母相比，它似乎缺乏细胞色素 c (Subik etal., 1974a)。基于序列比较的系统发育分析并未发现 S. versatilis 的近亲可能是具有呼吸能力的亲本 (Naehring etal., 1995; Kurtzman and Robnett, 1998)。

在获得更多数据之前，S. versafitis 作为染色体突变体还是细胞质突变体的地位似乎仍未确定。

IV. 线粒体DNA在小阴性酵母中起着什么重要作用？

A. 编码电子传递或ATP合酶的核基因并不重要

如前所述，在K. Zactis和S. pombe中都可以分离出染色体呼吸缺陷突变体。至少对于K. lactis，在本研究中使用Rag+菌株对于恢复突变体是偶然的。现在已知当线粒体呼吸受到抑制时，K. lactis菌株的发酵生长能力会有所不同。

发酵生长取决于 RAG1 和 RAG2 基因的等位基因状态（Goffrini 等人，1989 年），这两个基因分别编码葡萄糖转运蛋白（WCsolowski- Louvel 等人，1992 年）和磷酸葡萄糖异构酶（Goffrini 等人，1991 年）。这些基因的一些等位基因不允许在存在抗霉素的情况下在葡萄糖上生长，抗霉素会抑制呼吸作用。这些观察结果暗示，一些小阴性物种可能表现得像 K. Zactis 的 Rag 突变体。事实上，缺乏足够的发酵能力是小阴性酵母出现的最初解释之一。然而，如果使用 K. lactis 的 Rag+ 菌株，则有可能破坏编码电子传递链和氧化磷酸化（ATP 合酶）成分的基因。

如前所述，已经发现 K. lactis 在独特的细胞色素 c g 中被破坏ene (CYCl) 在可发酵碳源上可存活，表明电子传递不是必需的 (Chen 和 Clark-Walker，

1993)。当通过破坏 K. Zactis QCR8 基因（编码 bcl 复合物的亚基 VIII）（Mulder 等人，1994）和 K. lactis COX18 同源物（组装功能性细胞色素 c 氧化酶所必需的）（Hikkel 等人，1997）构建可行的无效突变体时，可以得出相同的结论。此外，还报道了成功破坏编码 FIFo-ATP 合酶亚基的基因。这些基因包括 A TPl、ATP2、ATP3、ATP6 和 ATPE，编码 F1 复合体的 a、p、y、6 和 E 亚基（Chen 和 Clark-Walker，1995；1996；Hansbro 等人，1997；X. J. Chen，未发表的数据），以及 ATP4、ATP5 和 ATP7，这三个核编码基因编码膜 FO 区的 b、OSCP 和 d 亚基（Chen 等人，1998）。因此可以得出结论，电子传递和 ATP 合成对 K. lactis 都不是必需的。然而，K. lactis 呼吸缺陷突变体不能在厌氧条件下生长 (G. D. Clark-Walker，未发表数据)。如前所述，该物种中某些细胞成分的合成可能需要氧气。

另一种被广泛研究的典型小阴性物种是裂殖酵母。Heslot 和同事 (1970) 首次描述了 S. pombe 的分离呼吸缺陷突变体，它们缺乏细胞色素 a + a3 并且呼吸速率较低。 Wolf 及其合作者 (1971) 还分离出了缺乏细胞色素 c 氧化酶和琥珀酸-细胞色素 c 还原酶活性的分离 (Y) 突变体。Boutry 和 Goffeau (1982) 鉴定出在 F1-ATPase 的 或 p 亚基中发生特异性改变的 S. pombe 突变体。在最近的一项研究中，Bonnefoy 等人 (1996) 描述了 S. pombe ABCl 基因的破坏，该基因是线粒体呼吸链 bcl 复合物正常运作所必需的。同样，在 S. pombe 中，针对性破坏编码 F1-ATPase (Y) 和 p 亚基的基因产生了活细胞 (D. I. O’Connor、X. J. Chen 和 G. D. Clark-Walker，未发表数据)。这些观察结果是与 K. lactis 的研究结果一致，即电子传递链和 ATP 合酶对于这些小负性物种的生存都不是必需的。已经对许多其他小负性酵母进行了研究，以在化学诱变、紫外线照射或高温处理后产生呼吸缺陷突变体。这些物种包括路德维希酵母 (Nagai et al., 1976)、白色念珠菌 (Aoki和伊藤桑，1987 年； Roth-Ben Arie 等，1998)，卡斯氏雪旺酵母（Claisse 等人，1991）、鲁氏接合酵母（Yagi 等人，1992）、念珠菌apicola 和 Candidaombicola（Hommel 等，1994）。虽然这些突变体缺乏细胞色素或细胞色素c氧化酶，不确定突变是否存在泄漏，分离株保留了剩余呼吸能力。

B. Petite 阴性细胞对 mit- 突变具有抗性 在研究 Petite 阴性酵母的呼吸缺陷突变体时，一个特殊的观察结果是，几乎所有恢复的突变体都来自染色体。由于电子传递和 ATP 合成对于生存来说都是可有可无的，因此人们至少会期望编码细胞色素 b、细胞色素 c 氧化酶亚基或 ATP 合成酶亚基 6、8 和 9 的基因中的病变被鉴定为细胞质呼吸缺陷突变体。然而，已证明分离 mit- 突变体是一种罕见事件。可以提及两个特殊情况。在 S. pombe 中，虽然通过吖啶黄诱变诱导拟突变体的尝试失败了，但可以在特定的线粒体突变株中恢复此类突变体（Seitz-Mayr 和 Wolf，1982 年）。在这些菌株中，呼吸缺陷突变体可以以 2-20% 的速度增加，其中大约 20% 携带 50-1500 bp 的线粒体 DNA 缺失（Ahne 等人，1984、1988 年）。突变株携带 urfa 序列（未指定的阅读框架；Zimmer 等人，1991 年）的突变，该序列与 S. cerevisiae 和其他物种中 varl 编码的线粒体核糖体蛋白具有显著的同源性（Neu 等人，1998 年）。 urfa 中的突变如何诱导点突变和小缺失的形成仍不清楚。在 K. Zactis 中，仅报道了一种细胞质突变体。已发现呼吸缺陷突变体 Gly-3.9 具有重排的线粒体基因组，导致 75 个氨基酸 ATP 合酶亚基 9 蛋白的羧基末端缺失 22 个氨基酸（Clark-Walker 等人，1997 年）。这种由重度 EB​​ 诱变诱导的突变体缺乏 Atp9p。然而，使用 K. Zactis 和 S. cerevisiae 之间的杂交菌株，已分离出呼吸缺陷的线粒体 DNA 缺失突变体来自小负型 KF4，其染色体组成和线粒体 DNA 谱与 K. Zactis 基本相似 (Hardy 等，1989；Maleszka 和 Clark-Walker，1990)。鉴于从野生型 S. pombe 和 K. Zactis 中分离线粒体突变体一直失败，看来这些酵母中的线粒体基因组在迄今为止使用的诱变程序下对突变或缺失具有耐受性。在 S. pombe 的突变菌株和 K. Zactis 的 atp (mgi) 突变体中高频率地恢复了 mit- 突变体（见第 V 节），排除了这些酵母缺乏特定的 mtDNA 序列或 DNA 重组机制的可能性，而这些机制会导致缺失发生，正如之前所建议的那样（Clark-Walker 和 Miklos，1974 年）。由于对 K. Zactis atp9 突变体的遗传分析（见前文）未能确定任何可能的核突变，导致该分离株倾向于形成 mit- 突变体（G. D. Clark-Walker 和 X. J. Chen，未发表的数据），核基因中的第二个突变不太可能是 mit- 基因组形成的先决条件。小阴性酵母中 mit- 突变很少发生的原因仍然未知。 C. 线粒体 DNA 在小阴性酵母中的重要作用

面对先前提出的证据表明，有可能破坏编码电子传递链和 ATP 合酶成分的染色体基因，提出了一个问题，即线粒体基因组是否对小阴性酵母必不可少？先前的研究表明，用吖啶黄或 EB 对小阴性酵母进行严厉处理会导致产生无法存活的微菌落（Bulder，1964b；Heritage 和 Whittaker，1977）。这意味着无法存活的微菌落已经丢失了线粒体 DNA，但尚未对这一想法进行直接测试。然而，这个问题已通过一项遗传实验得到解决，其中 S. cerevisiae 线粒体基因组维持基因 MGMlOl（Chen 等人，1993 年）的 K. lactis 同源物已被破坏（Clark-Walker 和 Chen，1996 年）。含有破坏基因的减数分裂分离子形成 6-8000 个无活力细胞的微菌落。同样，在 S. pombe 中，另一个线粒体基因组维持基因 MGMl（Jones 和 Fangman，1992 年；Guan 等人，1993 年）的破坏产生了缺乏线粒体 DNA 的无活力细胞（Pelloquin 等人，1998 年）。换句话说，已经证明，mtDNA 的丢失对这些小阴性酵母来说是致命的。

同样，线粒体蛋白质合成对乳酸克鲁维酵母和裂殖酵母存活的重要性也得到了研究。早期研究指出，基于红霉素、氯霉素和四环素的抑制作用，线粒体蛋白质合成对 K. Zuctis 生长具有重要意义 (Morgan and Whittaker, 1978)。在一些定义明确的 Rag+ (发酵能力强) 菌株中，红霉素确实可以完全抑制葡萄糖培养基上的生长 (X. J. Chen，未发表的数据)。在最近的一项研究中，Pel 及其合作者 (1996) 破坏了编码线粒体肽链释放因子的乳酸克鲁维酵母 MRFl 基因，发现产生的细胞在 10-13 代后死亡。事实上，在 S. pombe 中，从线粒体增变菌株中筛选 p 突变体仅鉴定出 coxl、~0x2、cox.? 和 cob 基因中的缺失突变体，但从未鉴定出线粒体蛋白质合成所需的基因（tRNA 和rRNA 基因；Ahne 等人，1984 年）。总之，这些发现强烈表明线粒体翻译产物在 K. lactis 和 S. pombe 中起着至关重要的作用。

D. “双组分”模型

如果线粒体 DNA 和线粒体蛋白质合成对 K. Zuctis 和S. pombe 至关重要，而电子传递和氧化磷酸化过程并非必不可少，那么，小阳性酵母和小阴性酵母之间的差异的一个简单解释可能是，后一类中的线粒体 DNA 编码了前一类中不存在的重要基因。

然而，到目前为止，与小阳性酵母 S. cerevisiue (Foury et af., 1998) 相比，对 S. pombe 线粒体 DNA 的完整序列 (Paquin et al., 1997) 和 K. lactis 线粒体 DNA 的核苷酸序列的检查并没有发现新的基因。与 S. cerevisiue 一样，S. pombe 和 K. factis 的线粒体基因组编码 (1) 细胞色素 b 和细胞色素 c 氧化酶亚基 1、2 和 3，它们是电子传递链的组成部分，(2) ATP 合酶 Fo 部分的亚基 6、8 和 9，以及 (3) 核糖体蛋白 Varl。

为了解决前面所述问题提出的问题，提出了一个“双组分”模型来解释小负酵母中的 pO 致死性。根据该模型，虽然电子传递链和 ATP 合酶的失活并不致命，但 bo 的 mtDNA 基因同时丢失电子传递和氧化磷酸化途径的 th 组分不能被容忍。对这一模型的强有力支持来自 K. factis 的观察，即细胞色素 c 基因 (CYCZ) 和 A TP3 或 A TP5​​ 基因的联合破坏，分别编码 F1 和 Fo 复合物的组成部分，产生无法存活的细胞 (Clark-Walker 和 Chen，手稿正在准备中)。

V. 核突变使 Petite 阴性酵母易于形成细胞质 Petite 最近的研究表明，只要在核基因组中引入特定的“功能获得”突变，K. factis 和 S. pombe 等 Petite 阴性物种就可以转化为 Petite 阳性酵母。

这些突变的发现使细胞能够绕过对线粒体DNA的要求，为小突变的研究开辟了新篇章。

预计这项研究将提供对如何维持线粒体内膜的结构和功能完整性的见解，特别是在缺乏功能性电子传递链和ATP合酶的细胞中。

A. atp [mgi] 乳酸克鲁维酵母突变

通过将细胞暴露于高浓度的EB，分离出可以抑制K. Iuctis中po致死性的utp（以前称为mgi）突变体（Chen和Clark-Walker，1993年）。 在初始实验中分离的四个突变体中有三个被发现是po，而第四个突变体被发现含有重排的线粒体基因组（Clark-Walker等，1997年）。对这三种 pa 突变体的遗传分析表明，在 EB 处理下形成 p-lpo 菌落的能力在减数分裂后代中以 2’ : 2- 的比例分离。因此，在 K. factis 中确定，产生呼吸缺陷突变体的能力受核基因的影响。这类核突变最初被指定为 mgi（代表线粒体基因组完整性），但由于它们发生在线粒体 F1-ATPase 中（见下文），因此被重新命名为 atp。 K. lactis atp 突变体可以具有呼吸能力，也可以具有呼吸缺陷，这表明 Mgi 表型与呼吸能力无关（Chen 和 Clark-Walker，1993、1995、1996；Clark-Walker 等人，已提交出版）。具有呼吸能力的 atp 突变体在以下方面表现为小阳性酵母。首先，它们可以自发形成细胞质呼吸缺陷菌落，频率为 055%（Chen 和 Clark-Walker，1993、1996），这与 S. cerevisiae 观察到的频率相似（Clark-Walker 等人，1981）。其次，自发小酵母的线粒体 DNA 有简单的缺失、基因组重排和一些片段的扩增，就像小酵母一样（Chen 和 Clark-Walker，1993 年）。最后，afp 突变体在用 EB 处理后可以高频率形成 p- 或 po 菌落。由于发现 Mgi- 表型的出现与对高浓度 EB 的抗性之间存在紧密相关性（Chen 和 Clark-Walker，1995 年），因此开展了一项分离 atp 突变体的大型筛选计划。通过将 K. lactis 暴露于浓度为 16 pg/ml 的 EB，所有产生的抗性菌落都在核基因组中含有 atp 突变（Chen 和 Clark-Walker，1995 年；Clark-Walker 等人，已提交出版）。在总共 42 个 atp 突变体中，仅发现了三个基因座，即 atpl(mgi2)、atp2 (mgil) 和 alp3 (mgis)。

ATPl (MGZ2) 和 ATP3 (MGZ5) 基因是通过补充与 atpl-2 和 atp3-1 等位基因相关的呼吸缺陷表型而分离的 (Chen and Clark-Walker, 1995)，而 ATP2 (MGZl) 基因是通过补充与 atp2-1 等位基因相关的冷敏感表型而鉴定的 (Chen and Clark-Walker, 1996)。 ATP1、ATP2 和 ATP3 基因编码的蛋白质与 S. cerevisiae 的线粒体 F1-ATPase 的 a、p 和 y 亚基具有 86.3%、88.9% 和 70.6% 的同一性，并且可以补充 S. cerevisiae 的 afpl、atp2 和 afp3 突变体的呼吸缺陷表型（X. J. Chen 和 G. D. Clark-Walker，未发表的数据）。 6. K. lactis atp 突变体中与 F,-ATPase 相关的新功能 有几条证据支持 K. lactis 的 atp 等位基因是功能获得突变的观点。首先，所检测的所有 42 个 a@ 突变体都携带 F1-ATPase 三个最大亚基之一的点突变（Clark-Walker 等，已提交发表）。其次，功能丧失突变不具有与 afp 等位基因相同的表型。当编码 F1 的 a、p 或 y 亚基的基因被破坏时，产生的无效突变体仍为 petite 阴性（Chen 和 Clark-Walker，1995，1996）。最后，atp 等位基因表现出显性表型，与突变的功能获得性质一致。当用 EB 处理时，atpl+ 杂合二倍体或携带 atp 等位基因的单倍体菌株除了野生型基因拷贝外，还容易形成主要为 po 的小菌落（Chen 和 Clark-Walker，1995 年，1996 年；另见图 1）。

atp 等位基因的存在显然是缺乏 mtDNA 的细胞存活所必需的，因为 K. lactis po 细胞中质粒产生的 atp 等位基因的丢失是致命的（Clark-Walker 和 Chen，1996 年）。因此，携带 atp突变的 F1 复合物可以获得一种新功能，负责抑制 pO 致死性。这种新功能不同于 F1 在 ATP 合成中的作用，因为 atp 突变体的一个子类是呼吸缺陷的（Chen 和 Clark-Walker，1995 年；Clark-Walker 等人，已提交出版）。 F1 具有新功能的进一步证据来自以下观察结果：

图 1 K. luctis atpl-2 等位基因的显性 pO 致死抑制表型。K. luctis 单倍体 CK190/2 是通过将 KIATPl 的野生型拷贝整合到 atpl-2 菌株的染色体中构建的，通过生长边缘技术 (Chen and Clark-Walker, 1996) 暴露于溴化乙锭。药物处理后形成的小菌落大多是 po。

212

XIN JIE CHEN AND G. DESMOND CLARK-WALKER

正如下一节所讨论的，在没有 FO 复合物的情况下可以抑制 pO 致死性。

C. 影响 FA-ATPase 的 pO 致死抑制活性的因素

1. pO 致死抑制需要组装的 FI，但与 Fo 无关

atp 等位基因的 pO 致死抑制活性由组装的 F1 的作用介导。携带 atpl-2、atp2-1、atp2-3 等位基因（a 和 0 亚基分别发生突变）的菌株的抑制活性因 F1 的 y 亚基编码基因的破坏而完全消除（Chen 和 Clark-Walker，1995 年、1996 年）。同样，编码 0 亚基的基因的破坏将 atp3-1 突变体转化为小负形式。

在这些菌株中，F1 的新功能需要由至少 a、0 和 y 亚基组成的组装核心复合物。然而，最近的研究表明，第二类 atpl 和 atp2 等位基因在没有 y 亚基的情况下也能发挥作用（X. J. Chen 和 G. D. Clark-Walker，未发表的数据）。当 y 亚基被引入这些突变菌株时，pO 致死抑制表型受到抑制。这些观察结果在确定抑制机制方面的重要性正在研究中。

F1 的 6 亚基的存在可以以等位基因特异性的方式影响 Mgi 表型的表现（Hansbro 等人，1998 年）。根据 EB 消除线粒体 DNA 后细胞的生长情况，发现编码 6 的基因的破坏完全消除了 atp2-l 和 atpl-6 等位基因的 Mgi 表型，但仅部分减弱 atp2-9 和 atp3-2 菌株中 po 细胞的生长。然而，6 的失活不会影响 atpl-1 等位基因的 Mgi- 表型。6 蛋白在 FI 组装中的作用已在 S. cerevisiae 中报道（Giraud 和 Velours，1997 年）。6 亚基的存在是否通过影响 K. lacris 中突变体 F1 的组装来调节 Mgi- 表型尚待研究。Fo 区的存在不是 F1 的 pO 致死抑制活性所必需的。由于 Fo 的亚基 6、8 和 9 由线粒体 DNA 编码，因此携带 atp 突变的 F1 不太可能通过 po 细胞中的 Fo 执行其功能。这一观点得到了以下观察结果的进一步支持：K. lactis 核 ATP4、ATP5 和 ATP7 基因（编码亚基 b、OSCP 和 d）的破坏不会在 EB 消除线粒体 DNA 时消除 atp 突变体的生长（Chen 等人，1998 年）。在这些菌株中，六个主要的 Fo 蛋白，即亚基 6、8、9、b、OSCP 和 d，都不存在。因此，新的 F1 功能与 Fo 无关。

酵母中的小突变

21 3

突变体 F1 复合物是否以游离形式存在于线粒体基质中或与非 Fo 膜成分相互作用尚待确定。

2. ATP 水解活性

F1 相关的 ATP 水解活性可能对改变的 FI 的极致致死抑制功能至关重要，因为 fi 亚基的 ATP 结合位点的突变会消除 atpl-2 菌株的 Mgi- 表型（G. D. Clark-Walker，未发表数据）。这与所有抑制突变体都保留一些 F1 相关的 ATPase 活性的事实一致。然而，F1 相关的 ATPase 活性与 pO 致死率抑制之间没有发现直接相关性，因为来自具有不同抑制突变的菌株的线粒体 ATPase 活性可能高于或低于野生型菌株（Clark-Walker 等人，已提交出版）。携带 p 亚基中 T191S 突变的菌株，其线粒体 ATPase 活性高于迄今为止检查的抑制菌株，并且比野生型菌株高出两倍，不会抑制 pO 致死率。这些观察结果提示F1相关的ATPase活性对于抑制功能至关重要，但ATP水解可能不是F1新功能的主要原因。

3.突变位点

从po细胞的生长速度判断，可以在不同的atp突变体中观察到不同的pO致死抑制活性。在总共 42 个 atp 等位基因中，可变异的氨基酸仅局限于 7 个位置，即 Y 亚基中的 Pro- 328、Ala-333 和 Phe-443；p 亚基中的 Val-306 和 Arg-435；以及 y 蛋白中的 Thr-275 和 Ile-281（Clark-Walker 等人，已提交发表）。所有可变异残基在进化过程中都高度保守，如图 2 所示。p 亚基中 Arg-435 突变的一个奇怪方面是，该氨基酸可以被 5 个残基取代，范围从带类似电荷的 Lys 到非极性的 Gly。因此，似乎抑制 pO 致死性的关键变化是去除 pR43.5 提供的特性。当投射到晶体结构上时牛 F1 复合物（Abrahams 等人，1994 年），可变氨基酸位于两个区域。一个位置位于 F1 的“基部”膜表面附近，另一个位置靠近顶部或基质近端区域。因此，这两个子域对于 F1 复合物的 pO 致死抑制功能至关重要。

D. S. pornbe 的 ptp 突变体

S. pombe 中描述了两个核突变，ptpl-1 和 ptp2-1，它们允许细胞在没有 mtDNA 的情况下生长（Haffter 和 Fox，

a-亚基

KlATPl 298

ScATPl 295

SpATPl 286

BtATPl 258

HsATPl 301

BaATPl 250

EcATPl 250

KlATPl 407

ScATPl 404

SpATPl 395

BtATPl 367

HsATPl 410

BaATPl 359

EcATPl 370

p-亚基

KlATP2 267

ScATP2 273

SpATP2 286

BtATP2 240

HsATP2 290

EcATP2 228

BaATP2 236

atpl-1 (F->S)

atpl-5 (F->L)

atp2-9 (V->F)

KlATPZ 387

ScATP2 393

SpATP2 406

BtATP2 360

HsATP2 410

EcATP2 341

BaATP2 356

y-亚基

KlATP3 266

ScATP3 288

BtATP3 250

HsATP3 275

BaATP3 263

EcATP3 265

atpa-1 (R->G)

atp2-3 (R->I)

atp2-6 (R->T)

atp2-7 (R->V)

atp2-8 (R->K)

atp3-1(T->A) atp3-2 (I->T)

图 2 在 K. lactis 的 utp 菌株中发生突变的 F1-ATPase 的 a、B 和 y 亚基中氨基酸残基的进化保守性。来自 K. lacris

(KI)、S. cerevisiae (Sc)、S. pornbe (Sp)、牛 (Bt)、人类 (Hs)、大肠杆菌 (Ec) 和嗜热芽孢杆菌 PS3 (Ba) 的序列已对齐。来自 K. lactis、S. cerevisiue、

S. pornbe 和人类的基因的氨基酸编号从前体中的第一个 Met 开始。牛蛋白质的编号是指晶体结构中的编号 (Abraham et uL, 1994)。箭头表示 K. Zactis atp 突变体中残基改变的位置。氨基酸缬氨酸是 afp2-9 突变的位点，由于 BaATP2 中存在异亮氨酸残基，因此并未完全保守。

S. pornbe 的 y 亚基序列目前不可用。

酵母中的小突变

21 5

1992)。这些突变体是通过在含有葡萄糖和 EB 的液体培养基中长期孵育细胞分离出来的。在一项独立研究中，结果表明 po 细胞可以从具有线粒体编码的突变体的 S. pombe 菌株中产生（Massardo 等人，1994 年）。由于 po 细胞的频率尚未准确确定，因此不确定这些分离物中是否存在支持分离 po 细胞的核突变。

ptpl-1 突变已被证实是参与线粒体 DNA 代谢的 RNase MRP RNA 基因缺陷细胞存活所必需的 (Paluh and Clayton, 1996)。然而，ptp 突变的性质仍不清楚。ptp 突变是否发生在 F1-ATPase 亚基中尚待研究。

VI. 酿酒酵母中 Petite 存活所需的基因

尽管最近才描述了 Petite 阴性酵母向 Petite 阳性形式的转变，但人们早已知道，在 S. cerevisiae 中，在 opl (Kovacova 等，1968) 或 ZlXl (peZ1) 突变 (Subik, 1974) 存在的情况下，petite 突变体无法存活。类似地，影响发酵途径的突变也会导致酿酒酵母变成小负型。第二类基因，例如编码乙醇脱氢酶 I 和丙酮酸脱羧酶的基因（Ciriacy，1976；Lancashire 等人，1981），将不在本综述中讨论。然而，除了 opl 和 pell 之外，现在已知与发酵生长无关的其他三个基因座的突变会影响面包酵母中小负型的存活。如后所述，AAC2、PGSl/PELl、YMEl、ATPl 和 ATP2 的破坏可以使酿酒酵母变成小负型。 A. AAC2

ADPlATP 跨线粒体内膜转运是氧化磷酸化的关键要素。它是线粒体合成 ATP 的输出和线粒体中 ATP 的输入所必需的在呼吸受到抑制的条件下，AAC3 会进入细胞器。酿酒酵母有三个编码 ADP/ATP 转位酶的同源基因。AA CI（Adrian 等人，1986 年）和 AAC2 基因（Lawson 和 Douglas，1988 年）优先在有氧条件下表达，而 AAC3 的解除抑制仅发生在厌氧条件下（Kolarov 等人，1990 年；Drgon 等人，1991 年）。AAC2 基因编码呼吸细胞中大部分线粒体转位蛋白。与 AACl 和 AAC3 相比，它们的失活不会显著影响在厌氧条件下在不可发酵碳源或葡萄糖上的生长，而 AAC2 的破坏会产生呼吸缺陷表型 (Lawson 等人，1990 年；Drgon 等人，1991 年)。然而，AACl 和 AAC3 的过度表达可以弥补 aac2 突变体的呼吸缺陷 (Lawson 和 Douglas，1988 年；Kolarov 等人，1990 年)。在厌氧条件下，只要存在野生型 AAC3，am2 突变体就可以生长 (Kolarov 等人，1990 年)。 AAC2 基因因 opl 突变而广为人知，该突变最初被分离为一种可能存在氧化磷酸化缺陷的菌株（Kovac 等人，1967 年），但后来被证实会影响跨线粒体膜的核苷酸易位（Kovac 等人，1972 年）。opl 突变体在 AAC2 基因中存在病变（Kolarov 等人，1990 年；Lawson 等人，1990 年），并且不能耐受 p- 突变，因为吖啶黄处理会导致细胞死亡（Kovacova 等人，1968 年）。opl/aac2 突变体的小负性已被解释为 AAC2 在将 ATP 导入线粒体中的作用。因为线粒体内 ATP 对线粒体的生物合成至关重要（例如，对蛋白质的输入；Nelson 和 Schatz，1979 年；Hwang 和 Schatz，1989 年；Cyr 等人，1993 年），所以从细胞质中输入 ATP 对 p-/po 细胞的生存至关重要。因此，将野生型酿酒酵母的 p- 突变体与 Bong-

krekic 酸（一种 ADP/ATP 转运蛋白的抑制剂）一起孵育，可完全抑制细胞生长（Subik 等人，1972 年；Kolarov 和 Klingenberg，1974 年）。同样，电子传递抑制剂（如抗霉素 A）与米酵菌酸的联合应用也会导致细胞无法存活，因为线粒体内 ATP 会耗尽（Gbelska 等，1983 年）。关于 ADP/ATP 交换过程对小菌株存活率的作用，一个令人费解的问题是，可以从 opl 突变体中分离出电子传递链缺陷的 mit 突变体（Kotylak 和 Slonimski，1977 年；Dujon，1981 年审阅）。这些观察结果表明，在 ADP/ATP 交换缺陷的 opl 菌株中，线粒体内 ATP 合成的丧失是可以容忍的。因此，AAC2 在 ATP

输入中的作用不能完全解释 opl 突变体的微小负表型，尽管 opl 等位基因或细胞质 mit- 突变可能存在泄漏，这一点尚有争议。在这方面，确定mit- 或核 pet 突变是否可以在 aac2 无效突变体中被容忍将是有趣的。这里，还必须记住，使用米酵菌酸可能会抑制所有三种转位酶的活性，但不能完全反映 opl 突变体的生理状况。在 opl 细胞中，AACl 或 AAC3 的低水平表达无法支持呼吸生长，但仍可能输入足够的 ATP 来维持线粒体的其他功能（见下文）。这很可能与以下观察结果相一致：p- 突变体的生长可以被米酵菌酸完全抑制，但 mit- 突变体可以被 opl 突变体耐受。如果是这样的话，可以提出 AAC2 在 po 细胞中的作用一定不仅仅是维持线粒体内 ATP 水平。事实上，有人提出了 AAC2 介导的 ADP/ATP 易位在维持线粒体内膜电位 A$ 方面的作用。现在人们普遍认为 A$ 对线粒体的生物合成至关重要，因为蛋白质的输入和分选依赖于 A$（有关综述，请参阅 Neupert，1997 年）。在 p+ 酵母细胞中，A$ 由质子泵与电子传输耦合而产生（Mitchell，1979），或在厌氧条件下，通过 FIFO-ATP 合酶的可逆质子转运而产生，代价是 ATP 水解（Kovac 等人，1972）。在 p-/po 细胞中，两种 A$ 生成途径均不存在，必须有第三种机制来为膜提供能量。尽管磷酸盐的运输系统（Pi/Ht 同向转运或 Pi/OH- 反向转运，Wohlrab 于 1986 年进行了综述；Wehrle 和 Pedersen，1989 年）和无机焦磷酸盐的运输系统（Pereira-da-Silva 等人，1993 年）已被报道为电生系统，但这些系统似乎在线粒体中 A$ 的生成中没有发挥重要作用（Giraud 和 Velours，1997 年）。然而，通过 ADP/ATP 转位酶和 FI-ATPase 对 ATP 的水解被认为在小细胞跨膜电位的形成中起着重要作用（Chen 和 Douglas，1989 年；Giraud 和 Velours，1997 年）。ATP/ADP 交换的电生性已在许多早期研究中得到证实（Pfaff 和 Klingenberg，1968 年；Laris，1977 年；Klingenberg 和 Rottenberg，1977 年）。基本上，发酵途径产生的外部 ATP4- 与内部 ADP3- 的交换导致膜基质侧净增加负电荷。在酿酒酵母中，厌氧生长的细胞和细胞质呼吸缺陷突变体中保留了活跃的 ADP/ATP 易位 (Kolarov 和 Klingenberg，1974；Subik 等人，1974b)。在 p" 线粒体中，可以检测到 55 mV 的 A$ 电位值，并且该电位以 ATP 依赖性方式产生（Dupont 等人，1985 年）。如前所述，由于 opl 菌株不能容忍 mtDNA 中的大量缺失，因此此类菌株已成功用于分离 mit- 突变体。然而，似乎无法从 opl 菌株中分离出线粒体编码的 ATP6、8 和 9 基因中的 mit- 突变（J. Subik，个人通信）。似乎缺乏 AAC2 的细胞需要功能性 FIFO- ATP 合酶。总之，尽管自发现 opl 突变以来已经进行了广泛的研究，但 AA C2 在 S. cerevisiae 的小阳性表型中的确切贡献仍然是一个活跃的研究课题。

6. PGSI [以前称为 PEL I]

酿酒酵母 pgsl/pell 突变体是 pfl 致死的 (Janitor 等，1995；Chang 等，1998a)。PGSUPELI 基因座首次被描述为一种突变体，它不能耐受 EB 诱变或 mtDNA 消除 (Subik，1972)。

由于 PGSUPELI 编码的基因产物与大肠杆菌的磷脂酰丝氨酸合酶 (Pss) 具有一定的序列同源性 (Janitor 等，1995)，因此最初认为该基因编码酿酒酵母中的次要 Pss 活性。后续研究表明，PGSUPELI 编码磷脂酰甘油磷酸 (PG-P) 合酶 (Pgs)。有证据表明，PGSUPELI 的过度表达导致体外 PG-P 合酶活性显著增加，而 PGSl/PELl 基因的 N 端截短衍生物的表达可以挽救 E. colipgsA 突变体的生长缺陷 (Chang et af., 1998a)。

Pgs 催化 CDP-二酰甘油和3-磷酸甘油酯合成 PG-P（图 3），这是磷脂酰甘油 (PG) 和心磷脂 (CL) 生物合成中的限速步骤 (Carman 和 Zeimetz，1996 年；Greenberg 和 Lopes，1996 年；Minskoff 和 Greenberg，1997 年)。

PG 和 CL 是两种阴离子磷脂，主要局限于酵母细胞的线粒体膜 (Zinser 等，1991 年)。Dowhan (1997) 综述了这两种阴离子磷脂在原核生物和真核生物中的生物学作用。磷脂的两种可能功能值得注意。首先，阴离子磷脂似乎是蛋白质在跨膜转运过程中展开所必需的。

甘油

甘油-3-磷酸

t

t

t

t

1-酰基-甘油-3-磷酸

磷脂酸 (PA)

CDP-二酰基甘油

PGS 7/PE L 7

+ s e F

磷脂酰丝氨酸 (PSI

t

磷脂酰乙醇胺

1

(PE)

>

\ +甘油-3-磷酸

磷脂酰甘油磷酸 (PGP)

+

磷脂酰甘油 (PG)

1

1

磷脂酰胆碱 (PC)

图 3

4 CL S 1/C R D 7

心磷脂 (CL)

酵母中心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的生物合成途径。仅列出编码文中讨论的酶的基因。

酵母中的小突变

21 9

线粒体内膜。线粒体蛋白的前体可以特异性地与心磷脂结合（Ou 等人，1988 年）。安德里亚霉素是一种对阴离子磷脂具有高亲和力的抗生素，可抑制蛋白质进入线粒体（Eilers 等人，1989 年；Endo 等人，1989 年）。此外，还发现阴离子磷脂参与线粒体蛋白质前序列中螺旋的形成（Wang 和 Weiner，1994；Chupin 等，1995，1996）。其次，发现 CL 与许多线粒体蛋白质和复合物紧密结合。这些蛋白质或复合物的活性有时会受到 CL 缺失的影响（Hoch，1992）。一个例子是 CL 与 ADP/ATP 转位酶的相互作用（Beyer 和 Klingenberg，1985）以及 CL 对核苷酸载体活性的要求（Hoffmann 等，1994）。酿酒酵母可以在没有 CL 的情况下存活，因为编码心磷脂合酶 CLSUCRDI 的基因的无效突变体是可行的。此外，令人惊讶的是，突变体可以在不可发酵的碳源上生长，例如甘油和乙醇，尽管速度较慢（Jiang 等，1997；Tuller 等，1998；Chang 等，1998b）。有人提出，在突变细胞中，其他膜磷脂（如 PG）可以充分满足细胞对 CL 的需求。在缺乏 Cls/Crd 活性的菌株中检测到 PG 升高了五倍（Chang 等，1998b）。事实上，缺乏 PG 和 CL 的 S. cerevisiaepgsl/pell 无效突变体表现出更严重的表型。 pgsl/pell 基因被破坏的菌株呼吸功能缺陷，对葡萄糖培养基的温度敏感，细胞色素 c 氧化酶水平低 (Subik, 1974; Janitor 等, 1995; Chang 等, 1998a)。当与编码磷脂酰丝氨酸合酶的 CHOl 基因破坏相结合时，观察到致死表型，表明阴离子磷脂和磷脂酰乙醇胺 (PE) 在维持细胞结构方面存在功能重叠 (Janitor 等, 1996)。最重要的是，pgsl/pell 无效突变体是 pO 致死的 (Janitor 等，1993；Chang 等，1998a)，这与能够耐受 mtDNA 消除的 clsl/crdl 突变体形成对比 (Chang 等，1998b)。

C. YMEl

S. cerevisiae YMEl (酵母线粒体逃逸) 基因最初是通过补充一个增加了线粒体 DNA 逃逸到细胞核的突变体而分离出来的 (Thorsness 和 Fox，1993；Thorsness 等，1993；Thorsness 和 Weber，1996 审查)。 ymel 突变体在维持线粒体区室完整性方面表现出一些缺陷 (Campbell 等，1994)。突变体液泡对异常线粒体的周转率增加，随后，mtDNA 以更高的频率从细胞器中释放出来，并以比野生型细胞更高的速率迁移到细胞核 (Campbell 和 Thorsness，1998)。

YMEl 编码一种 ATP 和锌依赖性蛋白酶，属于 AAA（与多种细胞活动相关的 ATPase）蛋白质家族。 Ymelp 与大肠杆菌 FtsH 蛋白 (Tomoyasu 等，1993) 密切相关，包含 ATP 结合以及蛋白水解 HExxH 基序 (Nakai 等，1995；Weber 等，1996)。Ymelp 是约 850 kDa 的线粒体内膜复合物的一部分 (Leonhard 等，1996)，位于线粒体内膜 (Schnall 等，1994；Weber 等，1996；Leonhard 等，1996)。据报道，ATP 结合位点和蛋白水解位点的方向位于膜间隙中 (Leonhard 等人，1996)，但也有人提出了位于基质中的方向 (Weber 等人，1996)。

除了 DNA 从线粒体中逃逸外，YMEl 中的突变还具有多效性。首先，突变体在未组装的细胞色素 c 氧化酶亚基 2 的降解方面存在缺陷 (Nakai 等人，1995)，这表明 Ymelp 在蛋白质周转中起着积极作用。其次，突变体呼吸链复合物的活性降低 (Nakai 等人，1995)。

第三，ymel 细胞对非发酵碳源的温度敏感，对葡萄糖培养基的低温敏感（Thorsness 等人，1993 年），这也可能反映了线粒体内膜的脆弱状态。最后，ymel 突变体是 pO 致死的（Thorsness 等人，1993 年）。目前尚不清楚是否所有表型都可以归因于 ymel 突变体在膜蛋白降解方面的缺陷。或者，应该考虑 Ymelp 作为分子伴侣的额外作用（Nakai 等人，1995 年；Weber 等人，1996 年；另见 Rep 和 Grivell 的评论，1996 年）。 D. ATPl 和 ATP2

FIFo-ATP 合酶是位于线粒体内膜上的氧化磷酸化途径中的多亚基蛋白质复合物。

酵母酶与细菌和叶绿体中的酶一样，由两个基本结构域组成：外在和内在膜复合物 F1 和 Fo。ATP 在 F1 区合成，利用 Fo 传输的能量，这是质子从膜间隙移动到内膜基质侧的结果（Boyer，1997）。F1 部分也称为 F1-ATPase，由五种蛋白质组成，化学计量为 3a:3p:ly:16:1~。从牛 F1-ATPase 的晶体结构 (Abrahams 等，1994) 中发现，a 和 p 亚基在六聚体复合物中交替出现，并且阵列形成的中心空间被 y 亚基的氨基和羧基末端 a 螺旋占据。ATP 的合成是 y 亚基在六聚体阵列内旋转的结果 (Sabbert 等，1996；Noji 等，1997；Yasuda 等，1998)，而质子运动通过 Fo 复合物 (Elston 等，1998) 驱动。虽然已经确定了相当于线粒体16蛋白的大肠杆菌E亚基的晶体结构（Uhlin），但F中6和E亚基的位置尚未确定。et al., 1997)。

在 S. cerevisiae 中，F1-ATPase 的所有五个亚基均由核基因编码。A TPI、A TP2、A TP3、A TP6（A TP16）和 A TP E（A TP15）基因分别编码 a、p、y、6 和 E 亚基（Takeda et al., 1985,

1986; Arselin et al., 1991; GuClin et al., 1993; Giraud and Velours, 1994; Paul et al., 1994），大小分别为 55.0、51.3、30.6、14.6 和 6.6 kDa（Arnold et al., 1998）。 Fo 复合物由至少 9 种蛋白质组成，其中亚基 6 (28.0 kDa)、8 (5.8 kDa) 和 9 (7.8 kD) 由线粒体 DNA 编码 (Grivell, 1989)，亚基 4 (或 b, 23.2 kDa)、5 (或 OSCP, 20.9 kDa)、7 (或 d, 19.7 kDa)、h (或 Atp 14, 10.4 kDa)、f (或 Atpl7, 10.6 kDa) 和j/i (或 Atpl8, 6.7 kDa) 由核基因编码 (Velours 等, 1988; Uh 等, 1990; Norais 等, 1991; Arselin 等, 1996; Spannagel 等, 1997; Arnold等，1998，1999；Vaillier 等，1999）。亚基 6、b 和 9 相当于大肠杆菌的亚基 a、b 和 c，而赋予酿酒酵母 ATPase 活性寡霉素敏感性的 OSCP 对应于大肠杆菌的 F1 6 亚基（Cox 等，1992）。另外三个亚基 e（或Atp21Kiml1，10.7 kDa；Arnold 等，1997）、g（或 Atp20，12.9 kDa）和k（或 Atpl9，7.5 kDa）被发现与 ATP 合酶的二聚体形式有关（Arnold 等，1998）。大量研究表明，F1-ATPase 突变会影响 S. cerevisiae po 细胞的生长。在一项早期研究中，发现 F1-ATPase 缺陷的菌株极易丢失其线粒体基因组。由此产生的双突变体表现出生长缓慢的表型，并且不会厌氧生长（Ebner 和 Schatz，1973 年）。最近的研究也得出了类似的观察结果。编码 F1-ATPase 的 y 和 6 亚基的基因被破坏的 S. cerevisiae 菌株不仅显示出完全转化为 p-/po，而且在葡萄糖培养基上生长不良（Weber 等人，1995 年；Giraud 和 Velours，1997 年；Zhang 等人，1999 年）。这些实验提出了 F1-ATPase 在维持 p-/po 细胞强劲生长方面发挥积极作用的可能性。在这方面已经进行了一项彻底的研究，表明编码 F1-ATPase 的 a 和 p 亚基的基因的破坏使 S. cerevisiae petite 呈阴性（Chen 和 Clark-Walker，1999 年）。后一项发现清楚地表明，与 F1-ATPase 相关的功能对于 S. cerevisiae 中 petite 的生存至关重要。这也与以下观察结果一致：在 p- 背景下，F1-ATPase 组装缺陷的 S. cerevisiae 菌株的生长受到严重影响（A. Tzagoloff，个人通信）。可以预期，破坏专门协调 F1 组装的基因（例如 ATPll 和 ATP12，

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）将产生小负表型（Ackerman 和 Tzagoloff，1990；Bowman 等人，1991；Ackerman 等人，1992）。因此，ATPll 失活阻止缺乏 F1 的 y 或 6 亚基的细胞转化为 p-/po（Zhang 等人，1999）也就不足为奇了。

缺乏 F1-ATPase y 和 S 亚基的 S. cerevisiae 高效转化为小体，这可以通过 Fo 复合物中的被动和未耦合质子流来解释，这可能导致跨线粒体内膜的质子动力崩溃 (Zhang 等人，1999)。因此，细胞倾向于通过消除编码 Fo 的 6、8 和 9 亚基的 mtDNA 来消除质子孔。至于 po Ay 和 po AScells 的缓慢生长表型，Zhang 等人 (1999) 认为，这可能是由于 ATP 合酶抑制蛋白无法控制缺乏 y 亚基的 F1 的 ATP 水解。结果，细胞内 ATP 水平降低，导致生长缓慢。相反，Giraud 和 Velours (1997) 认为缺乏 6 亚基的细胞生长缓慢的原因是 F1 组装缺陷。F1 对线粒体中 ATP 的水解减少，从而降低了线粒体内 ADP 水平。由于线粒体内 ADP 水平对于维持 po 细胞中的线粒体膜电位 A#（通过核苷酸载体的 ADP/ATP 交换）很重要（见下文），因此 F1 突变体的生长率受到影响。

E. 酿酒酵母突变体中 pO 致死表型的可能解释

为了了解酿酒酵母通过 AAC2、PGSl/PELl、YMEl 和编码 F1-ATPase (Y 和 p 亚基) 的基因突变转变为小负型的机制，了解是否可以在这四种突变体中追踪共同的主要缺陷将会很有趣。从 AAC2、PGSl/PELl 和 YMEl 的研究中可以明显看出，这三个基因的主要功能都局限于维持线粒体内膜的结构和功能完整性。PGSl/PELl 突变导致缺乏阴离子磷脂 PG 和 CL 中的 ency 以及 ymel 突变体中未组装蛋白质的积累将直接影响膜的结构完整性。如前所述，AAC2 的缺失可能会消除核苷酸载体介导的跨内膜 A# 生成途径，这对于 p-/po 细胞的生存至关重要。从这个意义上讲，mtDNA 的丢失也会导致类似的后果。po 细胞可能由于在没有 mtDNA 编码伙伴的情况下积累了核编码蛋白质而导致膜完整性受损，并且由于缺乏功能性电子传递链和 ATP 合酶而导致膜电位降低。在这种情况下，当三个基因之一发生突变并消除线粒体基因组时，可以产生协同致死性，这可能并不奇怪。细胞死亡的主要原因可能是内膜功能丧失或 A$ 崩溃。F1-ATPase 在 p-/po 细胞存活中的作用尚不清楚。一种被接受的可能性是 F1-ATPase 可能在 A@ 的维持中与 AAC2 上位 (Giraud and Velours, 1997)。F1 的 ATP 水解对于产生线粒体内 ADP 很重要，这随后使产电 ADP/ATP 交换过程在 po 细胞中发挥作用。基于这一观点，一种建议是野生型小阴性酵母（如 K. lactis）可能没有在消除 mtDNA 方面有功能的 F1。 atp 等位基因的抑制突变可能导致 F1 的形成，F1 可以在没有 Fo 的情况下水解 ATP。这一点仍有待澄清。一个令人费解且有趣的发现是 F1-ATPase 和 Ymelp 之间可能存在遗传相互作用。Weber 和同事 (1995) 发现，S. cerevisiae ymel 突变体的 pO 致死表型可以被 F1 亚基中的 Thr297Ala 和 Ile303Thr 突变抑制。此外，这两个突变与抑制 K. lactis 中 pO 致死性的 KZatp3-2 和 -2 等位基因（以前称为 mgi5-l 和 -2）相同（Chen 和 Clark-Walker，1995；Clark-Walker 等，已提交出版；见图 2）。突变的巧合发生强烈表明 S. cerevisiae F1 和 K. Zucris 中的突变复合物以类似的方式抑制 pO 致死性。Ymelp 可能与突变的 F1-ATPase 具有直接的功能重叠，或者，作为 Ymelp 底物的未知蛋白质的功能可以被 po 细胞中的 F1 复合物取代。值得注意的是，po S. cerevisiae 菌株中的野生型 F1 复合物保留了大量的 ATP 水解活性（Schatz，1968；Kovac 和 Weissova，1968；Criddle 和 Schatz，1969；Tzagoloff 等人，1973），无法抑制 ymel 突变体的 pO 致死表型。因此，突变体 F1 的 pO 致死抑制活性可能不仅仅是线粒体中 ATP 的水解。除了 ATP 水解之外，复合物的另一种新特性也可能是 pO 致死抑制的原因。据报道，F1 的 α 亚基与分子伴侣具有序列相似性（Luis et aZ.，1990；Alconada et al.，1994）。从功能上讲，α 亚基的存在是蛋白质有效进入线粒体所必需的（Yuan and Douglas，1992）。目前尚不清楚 F1 复合物的这种分子伴侣活性是否与 pO 致死抑制有关。如图 4 所示，除了功能

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FIG. 4

编码 F1-ATPase (Y 和 p 亚基、AAC2、YMEI、PGSI/PELI 和 S. cerevisiae 的线粒体 1 基因组之间的可能功能相互作用。PG，磷脂酰甘油；CL，心磷脂。

突变体 F1 和 Ymelp 之间的相互作用，观察 F1 和 AAC2 或 PELl 之间是否发生类似的相互作用将会很有趣。

VII. 结束语

尽管自首次报道面包酵母的细胞质遗传以来已经过去了 50 年，但我们仍然没有回答这些初步观察提出的一些问题。除了吖啶黄之外，还有数百种化学物质可以诱导小突变体的形成，但这些药剂如何起作用仍有待确定（Ferguson 和 von Borstel，1992 年）。小型突变体中线粒体 DNA 的结构已得到彻底研究（Locker 等，1979；Bernardi，1979；Dujon，1981；Dujon 和 Belcour，1989），并且已知导致缺失的重组位点是序列同源性的短区域（Clark-Walker，1989；Weiller 等，1991）；然而，重组的步骤和参与的酶直到最近才得到详细研究（Zweifel 和 Fangman，1991；Kleff 等，1992；Ezekiel 和 Zassenhans，1993；Piskur, 1994; Ling 等, 1995; White 和 Lilley, 1996)。同样，我们知道面包酵母中高度抑制的小体在富含 GC 的片段中保留了具有完整启动子的线粒体 DNA，该片段称为 ori/rep，因为它似乎是复制起点 (Blanc 和 Dujon, 1980; Dujon, 1981; de Zamaroczy 等, 1981,1984)。然而，我们不明白这种元素如何优先出现在后代中（Zweifel 和 Fangman，1991 年；Kleff 等人，1992 年；Lockshon 等人，1995 年；Piskur，1997 年；Graves 等人，1998 年；van Dyck 和 Clayton，1998 年）。

本综述详细考虑的关于小突变的另一个方面源于早期的观察，即并非所有酵母在用 DNA 靶向药物治疗时都会形成线粒体基因组缺失突变体。

其中一个主要目标是了解 pO 致死抑制突变如何使 K. lactis 在失去线粒体 DNA 后存活下来，并将这些知识应用于确定 S. cerevisiae 如何进化为表现得像自然发生的抑制菌株。发现看似无关的基因，这些基因是 S. 酿酒酵母中维持小阳性表型所必需的，例如 AAC2、PGSYPELl、YMEl 以及编码 F1-ATPase 的 a 和 /3 亚基的基因，表明了解 po 突变体对这些基因的依赖性并不容易。然而，可以预见的是，将会发现更多这种类型的基因。对其他小阴性酵母中 pO 致死抑制突变的研究应该揭示 atp 等位基因是 K. lactis 的独特之处还是可以推广到其他生物体。因此，确定 S. pombe 中 ptp 突变的性质以及与抑制突变类似的遗传变化是否是分离哺乳动物 po 细胞的基础将会很有趣 (Desjardins 等人，1985 年；King 和 Attardi，1989 年；Martinus 等人，1996 年)。

从更广泛的意义上讲，从研究酵母中的 petite 突变中获得的知识可能与其他真核生物有关。 有记录表明，mtDNA 缺失可见于人类疾病中，例如偶尔发生或以特定和可遗传的方式发生的肌病和神经病 (Holt 等人，1988 年；Zeviani 等人，1989 年)。已发现核基因座使细胞易于发生线粒体 DNA 缺失并导致常染色体显性遗传病 (Suomalainen 等人，1995 年；Kaukonen 等人，1996 年)。一些疾病中也报道了常染色体隐性突变，这些突变导致线粒体 DNA 发生多次缺失 (Mizusawa 等人，1988 年；Bohlega 等人，1996 年；Nishino 等人，1999 年)。在考虑这些疾病中可能的遗传变异时，直接参与线粒体 DNA 复制和传递的核基因突变很可能是发生改变的候选对象。此外，还需要考虑 pO 致死抑制突变可能参与其中，这些突变使线粒体 DNA 易于发生缺失。