2023诺贝尔生理学或医学奖简介

Karikó 和 Weissman 因证明⽤修饰的核苷碱基产⽣的 mRNA 可以逃避先天免疫识别并改善蛋⽩质表达，对mRNA疫苗的生产起到了巨大的贡献，被授予2023诺贝尔生理学或医学奖。

疫苗的分类

目前的疫苗可分为以下几种：

• 减毒疫苗：透过减少病原体的毒力，但仍保持它活性的疫苗。其采用感染因子，借由改变使病毒变得无害或降低毒性。
• 灭活疫苗：即将病原微生物灭活后保留全微生物体做成的疫苗。
• 类毒素疫苗：病原体毒素经热处理或化学处理后被破坏或弱化，进而制成疫苗。
• 结合型疫苗是一种将弱抗原以强抗原作为载体结合制成的疫苗。混合两者的目的是使免疫系统对弱抗原产生更强的反应。
• 核酸疫苗：最初，DNA 疫苗被认为⽐ mRNA 疫苗更有前景，因为 DNA 更稳定。然⽽进展缓慢。⼀个可能的原因是注射的 DNA 必须穿过质膜和核膜这两个屏障，才能到达发⽣转录的细胞核。相⽐之下，基于 mRNA 的疫苗只需要进⼊发⽣翻译的细胞质，从⽽使递送更容易。

mRNA疫苗的优点

mRNA 不会整合到基因组中，从而消除了对插入突变的担忧。mRNA 疫苗可以以无细胞方式制造，从而实现快速、可扩展且经济高效的生产。例如，一个5升生物反应器可以在一次反应中生产近一百万剂 mRNA 疫苗。此外，单一 mRNA 疫苗可以编码多种抗原，增强针对弹性病原体的免疫反应，并能够用单一制剂靶向多种微生物或病毒变体。mRNA 疫苗的序列可以很容易进行改造，因此可以快速针对新出现的病毒变异株开发新的疫苗。

mRNA设计和合成原理

mRNA 疫苗包含合成的 mRNA 分子，可指导产生免疫反应的抗原。体外转录 (IVT) mRNA 模仿内源 mRNA 的结构，有五个部分，从 5′到 3′：5′帽子、5′非翻译区 (UTR)、编码抗原的开放阅读框、3′UTR 和poly (A) 尾部。与哺乳动物一样，5' 端的第一个或第二个核苷酸在核糖的 2' 羟基上被甲基化（2'- O-甲基化），这可以防止病毒 RNA 被胞质传感器识别，从而防止意外的免疫反应。来自高度表达基因（例如 α 和 β 珠蛋白基因）的天然 UTR 是合成 mRNA 的首选。这些工程化的 UTR 序列通过排除 3' UTR 中的miRNA 结合位点和 AU 丰富区域，最大限度地减少 mRNA 降解。此外，它们还最大限度地减少了阻止核糖体扫描 mRNA 转录物的区域，例如 5' UTR 中具有二级和三级结构（例如发夹）的序列。

为了最大化翻译，mRNA 序列通常掺入修饰的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物。由于所有天然 mRNA 都包含修饰的核苷，因此免疫系统已经进化到能够识别未修饰的单链 RNA，这是病毒感染的标志。具体而言，未修饰的 mRNA 可被模式识别受体识别，例如 Toll 样受体 3 (TLR3)、TLR7 和 TLR8，以及视黄酸诱导基因 I (RIGI) 受体。TLR7 和 TLR8 受体与 mRNA 中富含鸟苷或尿苷的区域结合，触发 I 型干扰素（例如 IFNα）的产生，从而阻断 mRNA 翻译。使用修饰的核苷，特别是修饰的尿苷，可防止模式识别受体的识别，从而实现足够水平的翻译以产生预防量的蛋白质。

IVT mRNA 的一种变异，即自扩增 mRNA，也包含编码 RNA 依赖性 RNA 聚合酶的复制酶基因。病毒衍生的聚合酶在细胞内扩增 mRNA 转录物，从而能够以更少的 mRNA 剂量表达大量抗原。

(1) 一旦病原体的基因组被测序，就可以设计目标抗原的序列并将其插入质粒 DNA 构建体中。(2) 质粒 DNA 在体外通过T7噬菌体RNA聚合酶（也可以使用T3和SP6聚合酶）转录为 mRNA，(3) 通过高效液相色谱 (HPLC) 纯化 mRNA 转录物以去除污染物和反应物。(4)纯化的mRNA与脂质在微流体混合器中混合，形成脂质纳米颗粒。快速混合导致脂质瞬间封装 mRNA 并沉淀为自组装纳米颗粒。(5)透析或过滤纳米颗粒溶液以除去非水溶剂和任何未封装的mRNA，(6)将过滤的mRNA疫苗溶液储存在无菌小瓶中。

mRNA 疫苗的递送载体

由于 mRNA 较大且带负电荷，因此无法穿过细胞膜的阴离子脂质双层。此外，在体内，它被先天免疫系统的细胞吞噬并被核酸酶降解。包括电穿孔、基因枪和离体转染在内的各种技术可以在培养皿中在细胞内递送mRNA。然而，体内应用需要使用转染免疫细胞的mRNA递送载体，而不会引起毒性或不需要的免疫原性。我们有如下方法：

脂质纳米颗粒

基于脂质的纳米颗粒是临床上最先进的 mRNA 递送载体。截至 2021 年 6 月，所有正在开发或批准用于临床的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗均采用脂质纳米颗粒 (LNP)。LNP 为 mRNA 递送提供了许多好处，包括易于配制、模块化、生物相容性和大 mRNA 有效负载能力。除了RNA药物之外，LNP通常还包括四种成分：可电离脂质（最为重要）、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质，它们一起封装并保护脆弱的mRNA核心。可电离脂质如含有多环金刚烷尾部（例如 11-AM）或含有环状咪唑头（例如 93-O17S）的脂质已被设计用于靶向体内 T 细胞。辅助脂质通过促进脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并增强功效，从而有助于与胞内体的膜融合。聚乙二醇化脂质成分由与锚定脂质（例如 DMPE 或 DMG）缀合的聚乙二醇 (PEG) 组成。亲水性 PEG 可以稳定 LNP，通过限制脂质融合来调节纳米颗粒尺寸并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用来延长纳米颗粒半衰期。

聚合复合物和聚合物纳米颗粒

尽管不如 LNP 先进，但聚合物具有与脂质类似的优势，并能有效递送 mRNA 。阳离子聚合物将核酸凝结成复合物，称为聚合复合物，其具有各种形状和大小，可以通过内吞作用被吸收到细胞中。聚乙烯亚胺是研究最广泛的核酸递送聚合物。尽管其功效非常出色，但其应用受到毒性的限制。

基于肽的输送系统

除了基于脂质和聚合物的载体之外，肽还可以将 mRNA 递送到细胞中，这要归功于其主链和侧链中的阳离子或两亲基团（例如精氨酸残基），这些基团与 mRNA 静电结合并形成纳米复合物。例如，含有重复精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的融合细胞穿透肽可将 mRNA 递送至树突状细胞（免疫系统的专业抗原呈递细胞）以引发 T 细胞介导的免疫。还有一种市售的细胞穿透肽 PepFect14，可将 mRNA 递送至小鼠异种移植模型中的卵巢癌细胞。