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染色质构象捕获
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[[文件:Chromosome Conformation Capture Technology (zh-cn).svg.png|缩略图|500x500像素|染色质构象捕获的基本过程]] 染色质在细胞核中以折叠盘曲的形式存在,使得相距遥远的片段可能会彼此接近,承担着潜在的功能。为了检测哪些片段是彼此接近的,用到染色质构象捕获技术(chromosome conformation capture)。 第一步,将相互靠近的DNA之间交联,保持其联系。有两种办法:甲醛,或者紫外线。但甲醛的交联是可逆的(加热即可),而紫外线交联不可逆。因此一般用甲醛。 第二步,将DNA打碎为片段。然后,用DNA连接酶将被交联的片段末端连接,这样,两个相互接近的片段就首尾相连了。 第三步,解除交联,根据需要,将被连接的片段PCR、测序。 [[文件:各种C.jpg|缩略图|500x500像素]] === 3C(chromosome conformation capture) === 最基本的技术,用于探究已知的片段A和片段B时间是否有接近。两条PCR引物分别来自片段A和片段B,如果有产物,说明存在A与B的连接,也就证明了A和B的接近。 === 4C(circular chromosome conformation capture) === 环状-3C技术;用于探究哪些片段会和已知片段A接近。先将片段A-片段X连成环状,再利用反向PCR扩增出各种各样的片段X,然后再利用高通量测序技术探究到底有哪些片段接近了片段A。 === 5C(Chromosome conformation capture carbon copy) === 碳拷贝-3C技术;用于探究一定区域内(<1Mb)所有的相互接近的片段。 [[文件:Hic.webp|缩略图|500x500像素]] 在这个区域内,设计大量的、带有已知接头(T7、T3)的引物,将他们退火到解交联的文库上,如果两个引物恰好相邻,就会被Taq连接酶连接在一起; 用已知接头进行高通量测序,就能知道在这区域内相靠近的所有片段。 === Hi-C === 可以用来探究全基因组内全部的相互接近的片段。 用hindⅢ切割交联的片段,用有生物素标记的核苷酸补平粘性末端; 连接平末端,用亲和素纯化经过连接的片段; 用T4DNA聚合酶的外切活性去除所有未经连接、具有开放末端的DNA; 添加接头,高通量测序。 === ChIP-loop === ChIP+3C,确定已知蛋白质P是否参与已知片段A和片段B之间的互作。 === ChIA-PET(Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing) ===
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