显微技术

基本原理

分辨率D：D=0.61λ/N*sin(α/2)

符号	含义	单位
D	最小可分辨的两点间距离（分辨率）	nm 或 μm
λ	照明光波长(最短的可见光波长λ=400nm)	nm 或 μm
N	物镜与标本间介质的折射率	无量纲（空气=1，水≈1.33，油≈1.51~1.52）
α	物镜孔径角（最大可达140°）	度或弧度
NA=N*sin	数值孔径	无量纲

光镜最大分辨率为0.2μm（阿贝极限）

艾里斑和瑞利判据

衍射会让点光源的成像扩散成中心亮斑+一圈一圈的衍射环，这个中心亮斑就是Airy disk，当一个点光源的艾里斑中心恰好落在另一个点光源艾里斑的第一暗环位置时，这两个点光源刚好可以分辨。

第一暗环的r=0.61λ/NA

衬度（对比度）

样品不同区域对光或电子的强弱差别。很多生物样品透明，需通过染色或特殊光学技术来产生衬度。

光学显微镜

相差显微镜

光波的基本属性：波长，频率（表现为颜色），振幅（表现为明暗），相位（你看不到，乌贼可以）

相差显微镜是将相位差转化为振幅差，并利用其中的相环扩大相差

适合观察活细胞而不需染色

微分干涉显微镜（DIC）

DIC利用干涉，其对象为相邻位置的两束光

折射率×厚度→相位变化速率→明暗关系，有浮雕感，在计算机的辅助下可见单根微管（24nm直径）

同样适合透明活体样品。

荧光显微镜

利用荧光分子（荧光蛋白、染料）标记特定结构，用特定波长光激发，发出更长波长的荧光。落射荧光显微镜是现在的主流配置。

共聚焦显微镜：用一个针孔排除焦平面以外的荧光，实现“光学切片”，让计算机后成像通过不同焦平面的图像叠加重构可对厚样品进行三维重建。

双光子/多光子显微镜：使用近红外飞秒脉冲激光，只在焦点极高光子密度处激发荧光，光毒性小，成像更深，常用于活体脑成像。

光片显微镜（SPIM）：用一层薄光片从侧面照明，快速获得大视野三维图像，光损伤极低，适合长时间活体胚胎发育观察。

暗场显微镜

是一种通过特殊光学设计实现高对比度显微成像的技术。其核心原理基于丁达尔效应，通过阻挡直射光并收集样品散射或反射的光线，从而在黑暗背景上凸显透明或低对比度的微小结构。在暗场显微镜中

这一技术特别适合观察未染色的活细胞、微生物、晶体等样本

超分辨显微技术

受激发射损耗显微镜（STED）：通过一束环形“损耗光”把激发光周围荧光熄灭，只留下中心极小区域的荧光，分辨率可达30 nm。

分辨率由公式 $D=\frac{\lambda }{2NA\sqrt{\frac{1+I}{I_s}}}$ 决定，其中损耗光强I很小很小时，公式同阿贝极限公式。因此可以说它绕过了阿贝极限。

电子显微镜

透射电子显微镜（TEM）

样品制备：常规的TEM需要用超薄切片样本。固定剂为戊二醛和四氧化锇（锇酸），也可用超低温冷冻，目的是保证样品真实性；包埋剂为疏水的环氧树脂，目的是作切割时的支撑，保证完整且有强度；利用重金属盐染色，锇酸染脂质，柠檬酸铅染蛋白质，乙酸双氧铀染核酸（金属离子不同程度的吸收，散射离子，体现出明暗关系）

负染技术

染背景对样品进行衬托，分辨率达1.5nm，观察纯化的精细结构（如线粒体基粒，核糖体，蛋白颗粒，病毒）

冷冻蚀刻技术

将样品快速冷冻固定后，在真空中用物理方法将其断开，断裂面倾向于沿着阻力最小的路径，即膜疏水内部的中间层裂开；其次温和的去除断裂面结晶水（升华）；然后向断面喷镀一层铂/碳混合物；再垂直喷镀一层纯碳膜，加固支撑：最后把有机物洗掉，看那个铂/碳壳子。

冷冻电镜

不用固定，包埋，染色，快速冷冻后获得大量图像进行分析（对包在冰膜中相同、分散、取向随机的大量颗粒性样品），主要用来研究生物大分子及其复合物（比如NPC和剪接体）

电子断层成像技术

对样品中的同一物品，在不同的倾角下连续拍照，再用这些照片重构三维结构

分辨率低于冷冻电镜，但可用于更大尺度的细胞器、细胞骨架、膜泡运输系统的三维结构

扫描电镜（SEM）

经典的SEM：利用二次电子（样品表层的核外电子），体现表面立体信息

背散射SEM：利用背散射电子，看内部结构，可用于三维重构，且无需超薄切片

处理：二氧化碳临界干燥法：不发生形变；喷镀金膜：保证良好的导电性

扫描隧道显微镜（STN）

非破坏性测量，原理是针尖和样品足够近时会产生隧道电流，其与针尖-样品距离呈指数关系

原子力显微镜(AFM)

利用微小的探针来测量样品的形貌和力学性质，探针在一个弹簧悬臂的末端，与样品作用时以“光杠杆”效应得以放大。