显微技术

基本原理

• 分辨率D：D=0.61λ/N*sin(α/2)

符号	含义	单位
D	最小可分辨的两点间距离（分辨率）	nm 或 μm
λ	照明光波长(最短的可见光波长λ=400nm)	nm 或 μm
N	物镜与标本间介质的折射率	无量纲（空气=1，水≈1.33，油≈1.51~1.52）
α	物镜孔径角（最大可达140°）	度或弧度
NA=N*sin	数值孔径	无量纲

光镜最大分辨率为0.2μm（阿贝极限）

艾里斑和瑞利判据

衍射会让点光源的成像扩散成中心亮斑+一圈一圈的衍射环，这个中心亮斑就是Airy disk，当一个点光源的艾里斑中心恰好落在另一个点光源艾里斑的第一暗环位置时，这两个点光源刚好可以分辨。

第一暗环的r=0.61λ/NA

• 衬度（对比度）

样品不同区域对光或电子的强弱差别。很多生物样品透明，需通过染色或特殊光学技术来产生衬度。

光学显微镜

• 相差显微镜

光波的基本属性：波长，频率（表现为颜色），振幅（表现为明暗），相位（你看不到，乌贼可以）

相差显微镜是将相位差转化为振幅差，并利用其中的相环扩大相差

适合观察活细胞而不需染色

• 微分干涉显微镜（DIC）

DIC利用干涉，其对象为相邻位置的两束光

折射率×厚度→相位变化速率→明暗关系，有浮雕感，在计算机的辅助下可见单根微管（24nm直径）

同样适合透明活体样品。

• 荧光显微镜

利用荧光分子（荧光蛋白、染料）标记特定结构，用特定波长光激发，发出更长波长的荧光。落射荧光显微镜是现在的主流配置。

共聚焦显微镜：用一个针孔排除焦平面以外的荧光，实现“光学切片”，让计算机后成像通过不同焦平面的图像叠加重构可对厚样品进行三维重建。

双光子/多光子显微镜：使用近红外飞秒脉冲激光，只在焦点极高光子密度处激发荧光，光毒性小，成像更深，常用于活体脑成像。

光片显微镜（SPIM）：用一层薄光片从侧面照明，快速获得大视野三维图像，光损伤极低，适合长时间活体胚胎发育观察。

• 暗场显微镜

是一种通过特殊光学设计实现高对比度显微成像的技术。其核心原理基于丁达尔效应，通过阻挡直射光并收集样品散射或反射的光线，从而在黑暗背景上凸显透明或低对比度的微小结构。在暗场显微镜中

这一技术特别适合观察未染色的活细胞、微生物、晶体等样本

• 超分辨显微技术（突破衍射极限）

受激发射损耗显微镜（STED）：通过一束环形“损耗光”把激发光周围荧光熄灭，只留下中心极小区域的荧光，分辨率可达30 nm。

电子显微镜

• 透射电子显微镜（TEM）

样品制备：常规的TEM需要用超薄切片样本。固定剂为戊二醛和四氧化锇（锇酸），也可用超低温冷冻，目的是保证样品真实性；包埋剂为疏水的环氧树脂，目的是作切割时的支撑，保证完整且有强度；利用重金属盐染色，锇酸染脂质，柠檬酸铅染蛋白质，乙酸双氧铀染核酸（金属离子不同程度的吸收，散射离子，体现出明暗关系）