蛋白质含量测定

紫外吸收测定蛋白质含量

近紫外(280nm)

蛋白质280nm的吸收主要取决于色氨酸和酪氨酸，少量取决于苯丙氨酸和二硫键。

百分之几的核酸就足以对280nm的吸收产生极大影响。

• A280 (1 mg/mL) = (5690nw + 1280ny + 120nc)/M
• nw、ny、nc分别是单位质量M中色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸残疾数目。

远紫外

肽键在190nm处的吸收最强，但由于190nm处有氧气的干扰以及技术的限制，一般使用205nm。

各种侧链，包括 Trp、Phe、Tyr、His、Cys、Met 和 Arg 的侧链（按降序排列），对 A205 有贡献。

和A280相比，在不同蛋白质之间的改变很小，但缺点包括需要在远紫外条件下精确校准分光光度计。许多缓冲液和其他成分，如血红素或吡哆醛基团，在该区域吸收很强。

Lowry法测定蛋白质含量

• 复合物形成试剂：碳酸钠+硫酸铜+酒石酸钾钠，即用即配
• Folin–Ciocalteu 试剂：磷钨酸+磷钼酸
• 先加复合物形成试剂，静止十分钟，再在涡旋振荡中加Folin-Ciocalteu试剂，静止30-60分钟。
  • Folin–Ciocalteu 试剂在碱性下不稳定，但反应只在碱性条件下发生，因此涡旋振荡保证快速混匀。

BCA法测定蛋白质含量

BCA法类似lowry法，利用碱性条件下Cu2+被还原为Cu+，BCA可以结合Cu+。但BCA在碱性条件下稳定，因此可以一步完成。

Cu的还原有两种途径：被色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸还原，或者被肽键还原。前者不受温度的影响，但后者在高温下加强。

产物紫色，吸收峰562nm。

• 试剂A：BCA、碳酸钠、酒石酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠
• 试剂B：硫酸铜
• 工作液：试剂A与试剂B混合，苹果绿色，可保存一周。
• 工作液与蛋白质混合后在60℃孵育30分钟。

糖基化蛋白会被考马斯亮蓝法低估，被BCA和Lowry法高估。其中，BCA是最接近的。

考马斯亮蓝法

有两种考马斯亮蓝（CCBCBB），G250和R250。G250比R250多了两个甲基，常用于计算蛋白质浓度。二R250常用于电泳染色。

• 记忆：G用来“G算浓度”，R用来“Ran色”。

以G250为例，含有两个磺酸基和三个氮原子。磺酸基几乎永远带负电。

• 三个氮全带正电，共带一个正电，呈现红色。
• 两个带正电，共不带电，呈现绿色。
• 一个带正电，共带一个负电，呈现蓝色。
• 都不带正电，共带二负电，呈现粉红色。

当溶液为酸性，G250主要为红色，但与蛋白质结合的G250的蓝色形式被稳定。

该染料似乎与蛋白质的精氨酸和赖氨酸残基结合最强，并且在较小程度上与组氨酸和芳香族残基（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）结合最强。

• 配置：G250溶解在乙醇中，再加入磷酸。

与蛋白质结合的蓝色形式G250吸收峰从590移动到620，但因为测定环境中pH值一般为绿色形式（650nm），因此测定的595nm是误差和准确性的权衡之举。

考马斯亮蓝不与游离的精氨酸、赖氨酸等反应，也不和3000Da一下的肽反应，因此不用于测定一些生物活性肽的含量。

BSA对CBB的反应比一般蛋白质要强，可能会低估样品中蛋白质的含量。牛γ-球蛋白能避免这一问题。