电泳染色方法
蛋白质电泳染色
银染法
原理
碱性环境下,甲醛等还原剂将蛋白质上结合的银离子还原为单质银颗粒，从而显现出棕黑色。不过确切原理还不是很清楚。
试剂
- 乙醇、冰醋酸：固定剂,稳定凝胶中的蛋白质并去除杂质。
- 乙酸钠、硫代硫酸钠：致敏剂，使得银离子更容易结合在凝胶上。
- 硝酸银溶液：提供银离子。
- 甲醛溶液、碳酸钠：显色剂，碳酸钠提供碱性环境，甲醛还原银离子。
- EDTA、甘氨酸溶液：终止液：终止显色反应。
实验步骤
- 固定：使用含有乙醇和冰醋酸的固定液处理凝胶。
- 致敏：加入乙酸钠和硫代硫酸钠。
- 洗涤：使用纯水洗涤凝胶，去除多余的试剂。
- 染色：将凝胶浸泡在含有硝酸银和甲醛的显色剂中进行反应。
- 显色：显色剂使银离子还原成金属银，形成可见的染色效果，应当为棕黑色条带。
- 终止：使用终止液停止显色反应，并固定染色结果。
特点
- 灵敏度极高，可以检出低丰度（<1ng）蛋白质。
- 染色结果和蛋白质氨基酸组成有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
考马斯亮蓝染色法
原理
考马斯亮蓝R-250分子中的芳香环可以通过范德华力与疏水氨基酸残基结合，而磺酸基则通过静电作用与带正电的氨基酸残基结合。游离状态下呈红色而与蛋白质结合后呈蓝色。
试剂
- 50%甲醇+10%冰醋酸：固定剂，固定蛋白质，去除SDS和盐。
- 0.1%考马斯亮蓝R-250+50%甲醇+10%冰醋酸：染色剂，显色。
- 40%甲醇+10%冰醋酸：脱色剂，去除未结合染料，降低背景噪声。
- 1%乙酸：保存剂，防止凝胶干燥和条带褪色。
实验步骤
- 固定：将凝胶浸泡于固定液中，室温摇动30分钟至过夜。
- 染色：倒弃固定液，加入染色液（液面需完全覆盖凝胶），室温摇床震荡染色12小时（或微波加热至95℃加速至20分钟，避免沸腾）。
- 脱色：弃染色液，加入脱色液震荡脱色；每30分钟更换脱色液，直至背景透明（通常需3~4次）；若需低背景，可用纯水脱色过夜。
- 保存：将凝胶浸泡于1%乙酸中，4℃可保存1周。
特点
- 高度灵敏，0.2μg-0.5μg/条带。
- 成本低。
荧光染色
原理
荧光染料（如SYPRO Ruby、Deep Purple）通过疏水作用结合蛋白质，紫外激发下发光。
试剂（以SYPRO Ruby为例）
- SYPRO Ruby：染色剂，最大激发光波长300/420nm，最大发射光波长618nm。
- 40%甲醇+10%乙酸：固定剂，用于去除SDS和固定蛋白质。
- 2%乙酸水溶液（或蒸馏水）：脱色剂，用于去除未结合的染料。
- 2%甘油溶液：保存剂，用于长期保存凝胶（可维持6个月荧光信号稳定）。
实验步骤
- 固定：将电泳后的凝胶转移至塑料容器中，加入足量固定液（覆盖凝胶体积5-10倍），室温摇动30分钟。
- 染色：倒掉固定液，加入SYPRO Ruby染色液（覆盖凝胶），避光条件下室温摇动染色90分钟至过夜。
- 脱色：倒掉染色液，加入2%乙酸或蒸馏水（覆盖凝胶），室温摇动洗涤30-60分钟。
- 成像：使用荧光扫描仪或蓝光/紫外透射仪照射凝胶。
- 保存：
- 短期：将凝胶浸泡于2%甘油中避光保存（室温或4℃）。
- 长期：用湿玻璃纸包裹凝胶，空气干燥后永久保存。
特点
- 灵敏度1-2ng。
- 染色和保存全程需避光，防止荧光猝灭。
- 染色不影响后续质谱分析，无需额外脱色步骤。